Résumé
Contexte
Actuellement, il est bien établi que le cancer survient dans un tissu inflammatoire chronique. Un certain nombre de NOD-like receptors (NLR) forment inflammasomes, complexes multiprotéiques intracellulaires critiques pour générer des cytokines pro-inflammatoires matures (IL-1ß et IL-18). Comme l'inflammation chronique de la muqueuse gastrique est une conséquence de l'infection de Helicobacter pylori, nous avons étudié le rôle des polymorphismes génétiques et l'expression de gènes impliqués dans la voie de signalisation NLR dans H. l'infection et le cancer gastrique lié de pylori (GC). Matériel et méthodes Cinquante et un des polymorphismes génétiques ont été génotypés en 310 Chinois de souche (87 non-cardia cas de GC et 223 contrôles avec dyspepsie fonctionnelle). En outre, l'expression du gène de 84 molécules impliquées dans la voie de signalisation NLR a été évaluée dans des cellules THP-1 avec deux attaquées H. Résultats CARD8 Associations roman Conclusions entre les polymorphismes dans la voie de signalisation NLR ( CARD8 Citation:. Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fock KM, Mitchell HM (2014) Le NOD-Like Receptor signalisation Pathway dans infection de Helicobacter pylori et des cancer gastrique: Une étude cas-témoin et l'expression génique Analyses. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10.1371 /journal.pone.0098899 Editeur: David M. Ojcius, Université de Californie Merced, États-Unis d'Amérique reçues: 2 Mars 2014; Accepté: 8 mai 2014; Publié 5 Juin, 2014 Droit d'auteur: © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités Financement:. Ce travail a été soutenu en partie par le Cancer Council de Nouvelle-Galles du Sud, Australie (Grant no.66 /04). NON. Kaakoush est soutenu par une bourse de début de carrière du Conseil de recherches médicales de la Santé nationale et, en Australie. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent Introduction L'incidence globale du cancer gastrique (GC) varie considérablement selon les pays. Selon les statistiques mondiales sur le cancer, un total de 952,000 nouveaux cas de GC et 723.000 décès liés à la GC sont estimés avoir eu lieu en 2012, représentant 6,8% des cas de cancer totales et 8,8% du total des décès liés au cancer [1]. Plus de 70% des nouveaux cas et des décès surviennent dans les pays en développement, les taux d'incidence les plus élevés étant signalés en Asie de l'Est, en Europe orientale et centrale et en Amérique du Sud [2]. L'agent pathogène bactérien Helicobacter pylori récepteurs Germ ligne codée appelés récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) font partie du système immunitaire inné et sont essentiels pour la détection de motifs microbiens invariants connu comme agent pathogène -Associated motifs moléculaires (PAMP). PRR ont été divisés en cinq clades génétiques et fonctionnels distincts: nucléotide domaine de liaison d'oligomérisation (NOD) récepteurs de type (NLR), les récepteurs Toll-like récepteurs de lectine de type C, le gène de l'acide inductible rétinoïque (RIG) -I-like récepteurs et absent dans le mélanome 2 (AIM2) récepteurs de type [5] [6]. la famille NLR non seulement reconnaître PAMP, mais les modèles moléculaires également des dommages-associés (Damps) dans le cytoplasme, qui sont des ligands endogènes produit après une lésion tissulaire ou la mort cellulaire [7]. Le NLR structure caractéristique comprend un domaine nucléotidique contraignant et oligomérisation (NACHT) central qui est présent dans tous les membres de la famille NLR, un C-terminal riches en leucine répétitions (LRR) et un recrutement N-terminal caspase (CARD) ou pyrine (PYD ) domaine. Basé sur l'analyse phylogénétique des domaines Nacht, il a été déterminé que la famille NLR comprend trois sous-familles: 1) la famille NOD qui comprend NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 et CIITA, 2) les NLRPs y compris NLRP1-14 (également connu sous le nom Nalps) et 3) la sous-famille IPAF qui consiste IPAF (NLRC4) et NAIP [7]. L'inflammasome NLRP3 le inflammasome le plus complètement caractérisé, consiste en la NLRP3 protéine d'échafaudage, la protéine associée de point comme l'apoptose (ASC) et la caspase-1. NLRP3 interagit et recrute l'ASC de l'adaptateur via PYD-PYD interaction [8]. Cette interaction conduit au recrutement de caspase-1, une cystéine protéase spécifique de l'aspartate intracellulaire, qui seraient ensuite conduire à la maturation et la libération de cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-1β et de l'IL-18. Dans H. pylori de l'infection, les quatre premières barrières physico-chimiques sont la couche de mucus, les cellules épithéliales gastriques, les TLR et les NLR. Un nombre limité d'études ont évalué l'interaction entre la voie de signalisation NLR et H. pylori Par conséquent, des études antérieures montrent clairement que, en réponse à H. pylori Génotypage Matériaux et méthodes de polymorphismes impliqués dans le NOD-like déclaration Ethique de récepteur de signalisation Pathway. Cette étude a été approuvé par le Comité d'éthique humaine (HREC) de l'Université de Nouvelle-Galles du Sud (UNSW) (HREC 08115 et HREC 02144). Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque individu recruté pour l'étude. Sujets de l'étude. Les sujets étaient des personnes d'origine chinoise qui ont subi une endoscopie digestive haute à l'hôpital Changi General (Singapour) et l'hôpital universitaire de la Malaisie (Kuala Lumpur), entre Janvier 2004 et Avril 2007. les patients connus pour être infectés par le virus de l'immunodéficience humaine ou qui avaient été prescrits des médicaments non-stéroïdiens anti-inflammatoires, les agents anti-microbiens ou inhibiteurs de l'acide dans la période de deux mois avant le recrutement ont été exclus. Quatre-vingt-sept patients nouvellement diagnostiqués avec un primaire non-cardia GC (Classification internationale des maladies, 9 e révision, le code 151) sur la base de la confirmation histologique ont été invités à participer à l'étude. Le groupe de contrôle composé de 223 personnes atteintes de la dyspepsie fonctionnelle (FD), qui a été défini comme des symptômes persistants ou récurrents (douleur ou d'inconfort centrée dans l'abdomen supérieur) en l'absence de maladie organique (y compris à l'endoscopie supérieure), conformément à Rome II système de classification [14]. Helicobacter pylori H. Les anticorps IgG de pylori chez ces individus chinois ont été déterminées à l'aide d'une maison-enzyme-linked immunosorbent assay [15] et immunoblot (MPD Helico blot 2.1, MP Biomedicals, Australie). sélection polymorphismes. bases de données électroniques (PubMed, Scopus, science direct, Ovid, BIOSIS Previews, bases de données Scirus, CINAHL, IMBIOMED, Scielo et LILACS) ont été fouillés jusqu'à Février 2013 pour les polymorphismes impliqués dans la voie de signalisation NLR qui ont été associés au cancer, maladie infectieuse ou étaient fonctionnellement pertinents. Cinquante et un des polymorphismes dans 6 gènes, qui ont été signalés à une fréquence >allèle mineur;. 1% dans le National Center for Biotechnology information (NCBI) dbSNP, ont été sélectionnées pour l'analyse (tableau S1 dans les tableaux S1) des techniques de génotypage. génotypage des 51 polymorphismes sélectionnés dans la voie de signalisation de la NLR de chacun inclus dans l'étude, l'ADN génomique a été extrait à partir d'échantillons de sang total périphérique à l'aide du kit QIAamp DNA Blood Mini comme décrit par le fabricant (Qiagen; Chadstone, Australie). L'ADN a été réhydratée dans de l'eau stérile et normalisée à 10 ng /ul pour personnalisé génotypage SNP par l'application de la matrice désorption laser assistée par ionisation à temps de vol (MALDI-TOF), spectrométrie de masse, la Sequenom MassARRAY iPLEX assay? (San Diego, Californie , États-Unis) [16], [17] à l'installation Australian Genome Research Ltd, Sainte-Lucie, Université du Queensland, en Australie. Un polymorphisme qui ne pouvait pas être inclus dans l'essai Sequenom MassARRAY iPLEX, connu sous le nom NLRP3- Quatre polymorphismes ( CARD8 L'analyse statistique. Le Student non apparié t Gene expression de molécules impliquées dans la culture de cellules de mammifères la lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 (code: TIB-202). (type culture américaine la collecte, Manassas, USA), a été cultivée dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum inactivé par la chaleur de fœtus bovin (FBS) (Invitrogen, Mulgrave, Australie), du pyruvate de sodium 1 mM (Invitrogen), 2 500 mg /L de bicarbonate de sodium (Invitrogen ) et une solution à 100 pg /ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen). Les cellules ont été maintenues dans 25 cm 2 culture tissulaire flacons (Greiner-Bio-On, Frickenhausen, Allemagne).. À 37 ° C avec 5% de CO 2 culture bactérienne Le H pylori test d'infection. cellules THP-1 ont été ensemencées dans une plaque de culture à 6 puits à une concentration de 5 x 10 5 cellules /ml et ensuite différenciés en macrophages avec de l'acétate de phorbol myrastate (Sigma-Aldrich) pendant 72 heures [24]. avant l'infection bactérienne, les cellules de mammifères ont été incubées dans un milieu sans antibiotique. H. pylori Après infection, non contestée et H. -challenged cellules THP-1 pylori ont été utilisés pour l'isolement de l'ARNm à l'aide du mini kit RNeasy de Qiagen tel que décrit par le fabricant (Qiagen). Pour l'analyse de l'expression du gène de 84 molécules impliquées dans la voie de signalisation de la NLR, l'ADNc a été synthétisé à partir de 0,8 ug d'ARN total en utilisant la RT 2 ADNc premier kit volet (Qiagen) et ensuite analysées en utilisant le Inflammasome humain RT 2 tableau Profiler PCR (PAHS-097R) (Qiagen), comme recommandé par le fabricant. les profils d'expression génique ont été obtenus à partir de trois expériences indépendantes H. pylori de la GC026 infectés, H. pylori Pour l'analyse des données d'expression génique, la méthode de quantification relative à base de Ct ΔΔ a été mis en œuvre en utilisant la RT sur le Web 2 tableau Profiler PCR Analyse de données version 3.5 (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). modifications au moins deux plis (≥2, ≤0.5) et P SDS-PAGE et THP de Western blot -1 cellules ont été ensemencées, différenciées et infectées à une MOI de 1, comme décrit précédemment. Les protéines ont été extraites en utilisant un tampon RIPA, séparé sur 12% de sodium dodécyl sulfate polyacrylamide gels d'électrophorèse sur gel et transférés sur des membranes de polyvinylidène difluorure de méthanol traités en utilisant le système de transfert de cellule Trans-Blot (Bio-Rad). Les membranes ont été immunomarquées avec des anticorps de lapin anti-humains polyclonaux dirigés contre NLRX1 (1:200) ou des anticorps monoclonaux anti-humain de souris contre la β-actine (1:1000) (Santa Cruz). De chèvre anti-lapin et anti-souris couplés à des anticorps IgG HRP (1:2000; Bio-Rad) ont été utilisés comme anticorps secondaires, respectivement. Les membranes ont été sondées en conformité avec le protocole Pierce ECL Western blot Substrat (Thermo Scientific; Scoresby, Australie). Résultats Les caractéristiques cliniques des caractéristiques cliniques des sujets d'étude y compris le sexe, H. pylori polymorphismes dans les gènes impliqués dans le NOD-like Receptor la signalisation Pathway sont associés au cancer gastrique dans Cinquante et un des polymorphismes de particuliers chinois ethniques dans les gènes impliqués dans la voie de signalisation NLR étaient génotypés chez 310 personnes d'origine chinoise (87 cas de GC et 223 FD contrôles). Le taux de tous les polymorphismes sélectionnés d'appel était 97-100% dans cette étude. Tous les polymorphismes dans la voie de signalisation NLR ont été trouvés en HWE dans le groupe témoin montrant non significative χ 2 valeurs sauf pour CARD8 alléliques et génotypiques que ainsi que les RUP et les IC à 95% pour les 27 polymorphismes restants sont présentés dans le tableau 1 et le tableau S4 dans les tableaux S1. Le CARD8 analyses basées sur haplotypes-sont une approche puissante pour disséquer l'architecture des maladies complexes. Dans l'étude actuelle, l'algorithme EM a identifié 25 haplotypes avec une fréquence > 0,01 dans les cas de GC (Tableau S5 dans les tableaux S1). Utilisation de la majeure haplotype dans le groupe de contrôle que l'haplotype de référence, deux (Hap1 et Hap8) polymorphismes dans les gènes impliqués dans le NOD-like Receptor la signalisation Pathway sont associés à infection de Helicobacter Pylori dans Étant donné que H de personnes d'origine chinoise. pylori Joint Effet de Infection de Helicobacter Pylori et polymorphismes génétiques augmente nettement le risque de cancer gastrique dans. ethniques individus chinois d'autres analyses ont été réalisées pour évaluer non seulement la présence ou l'absence des polymorphismes sélectionnés mais aussi H. pylori Influences Pour caractériser davantage l'effet de H. pylori Étant donné que l'inflammation est une caractéristique de la carcinogenèse gastrique, nous avons analysé en outre l'expression de cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines lors de l'exposition à deux H . Les souches pylori de. L'expression de neuf gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires ( IFNB1 Helicobacter pylori infection de Résultats dans Up-régulation de NFKB1 Treize gènes codant pour NLR ont été évalués dans cette étude, y compris les membres de la sous-famille IPAF (PNIA, NLRC4), NLRPs (NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) et NOD (NOD2, NLRC5, NLRX1 et CIITA) (figure 1B). L'expression de cinq gènes codant pour NLR a été significativement régulée dans les cellules H. pylori contestées (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 et NLRX1) (tableau 5). Parmi ceux-ci, NLRP12 (pli règlement: 0,03, p-valeur: 0,016298) et NLRX1 (pliez règlement: 0,02, p-valeur: 0,01762) ont été nettement régulée à la baisse dans les cellules H. pylori GC026-contestées. En tant que technique de validation, d'autres essais de Western blot enquête expression NLRX1, ont été menées. Constamment, une diminution des niveaux de NLRX1 ont été trouvés dans THP-1 cellules contestées à la fois avec H. pylori GC026 et 26695 (Information à l'appui Figure S3). Étant donné que le NF-kB est régulée négativement par NLRP12 et NLRX1, nous avons comparé en outre l'expression de NFKB1 Helicobacter Pylori expression d'autres molécules impliquées non seulement dans la NLR voie de signalisation, mais aussi dans la carcinogenèse a également été analysé en comparant les cellules THP-1 réponses à la fois H. Les souches pylori de. Fait intéressant, PTGS2 Discussion GC est maintenant considéré comme un multifactorielle processus, dans lequel les facteurs, la génétique et l'environnement hôtes bactériennes sont impliqués à différents stades de la physiopathologie du cancer. À l'heure actuelle, il est bien établi que le cancer survient dans un tissu inflammatoire chronique, ce qui est particulièrement remarquable dans le tractus gastro-intestinal [4]. Comme une inflammation chronique de la muqueuse gastrique est une conséquence de H. pylori À notre connaissance, ceci est le premier rapporté la preuve que les polymorphismes impliqués dans la voie de signalisation NLR sont associés à un risque accru de GC dans une population humaine. analyse statistique multivariée a montré que le CARD8
trains pylori, GC026 (GC) et 26695 (gastrite).
-rs11672725, NLRP3
-rs10754558, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs199475867 et NLRX1
-rs10790286 montraient des associations significatives avec GC. En analyse multivariée, CARD8
-rs11672725 restait un facteur de risque (OR: 4,80, IC à 95%: 1,39 à 16,58). En outre, NLRP12-
rs2866112 a augmenté le risque de H. pylori
infection (OR: 2,13, IC à 95%: 1,22 à 3,71). Les analyses statistiques évaluant l'effet conjoint de H. pylori
infection et les polymorphismes sélectionnés a révélé de fortes associations avec GC ( CARD8
, NLRP3
, CASP1
et Les polymorphismes de NLRP12). Dans les analyses d'expression génique, cinq gènes codant pour NLR ont été significativement réglementés dans H. cellules -challenged de pylori ( NLRC4
, NLRC5
, NLRP9
, NLRP12
et NLRX1
). Fait intéressant, la régulation persistante de NFKB1
avec la régulation simultanée de NLRP12
et NLRX1
a été observée dans H. Les cellules GC026-contestées de pylori. En outre, les gènes cibles NF-kB codant pour des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines et des molécules impliquées dans la carcinogenèse étaient nettement régulés à la hausse dans les H. Les cellules GC026-contestées de pylori.
, NLRP3
, NLRP12
, NLRX1
et CASP1
) et GC ont été identifiés chez des individus chinois. Nos polymorphismes génétiques et les résultats de l'expression des gènes mettent en évidence la pertinence de la voie de signalisation NLR dans la carcinogenèse gastrique et son interaction étroite avec NF-kB
est un facteur étiologique essentiel pour GC (IARC, 1994), cependant, des études antérieures suggèrent que, en plus de H. infection et alimentaires les facteurs de pylori, génétique de l'hôte contribuent à GC [3]. Les polymorphismes génétiques sont apparus ces dernières années en tant que déterminants de la sensibilité et la gravité de la maladie, ce qui est particulièrement vrai dans la malignité gastro [4]. Par conséquent, les polymorphismes au sein de gènes impliqués dans l'immunité innée et adaptative pourraient jouer un rôle important dans la pathogenèse de H. pylori
infection et le développement de H. les complications de la PI pylori dont GC.
. Par exemple, une étude initiale par Basak et al. [9] ont montré que non seulement H. pylori, de la lipopolysaccharide (LPS) active la caspase-1, mais que cette activation de la caspase-1 est impliquée dans le LPS induit par l'IL-1β maturation. Par la suite, Hitzler et al. [10] ont montré que H. pylori de l'infection active caspase-1, conduisant à l'IL-1β /IL-18 le traitement et la sécrétion, à la fois dans les cellules dendritiques cultivées (PED) et in vivo
. Constamment, deux études récentes, en utilisant des lignées de cellules gastriques humaines, confirmés expression de la caspase-1 a augmenté, l'IL-1β et de l'IL-18 dans H. les cellules infectées par des pylori [11], [12]. En outre, une étude récente menée par Kim et al. [13] a montré que la sécrétion d'IL-1β par des CD infectées avec H. pylori
nécessite TLR2, NOD2 et l'inflammasome NLRP3.
, inflammasome dépendante de la caspase-1 activation est essentielle pour générer des cytokines pro-inflammatoires matures qui sont cruciales pour les réponses Th1 associés à immunopathologie gastrique. Étant donné que peu d'informations sur le rôle de inflammasomes et d'autres molécules impliquées dans la NLR voie de signalisation en réponse à H. Le plus pylori infection, et que les polymorphismes dans les gènes fonctionnellement pertinents de cette branche du système immunitaire sont susceptibles d'influer sur l'amplitude et la direction de la réaction de l'hôte contre l'infection, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation de la NLR, y compris inflammasome- molécules apparentées, dans H. pylori
développement GC concernant la PI en évaluant 51 polymorphismes génétiques chez les individus chinois, une population à haut risque connu pour GC, et de traiter l'expression du gène de 84 molécules impliquées dans la NLR voies de signalisation dans une lignée cellulaire monocytaire lors de l'exposition H . pylori
.
détection.
42 pb-VNTR, a été génotypés par PCR standard. Les amorces ont été conçues avec la version Primer Oligo logiciel d'analyse de 6,71 (Insights de biologie moléculaire, Inc; Colorado Springs, États-Unis). Des expériences ont été effectuées en utilisant le cycleur thermique 2720 (Applied Biosystems, Foster City, États-Unis). Les produits de PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% et visualisés sous transillumination UV en utilisant le système de gel Doc 2000 (Bio-Rad, Hercules, USA). Les séquences d'amorces et conditions de cyclage thermique pour le génotypage de ce polymorphisme sont décrits dans le tableau S2 dans les tableaux S1.
-rs2043211, CARD8
-rs6509368 , CARD8
-rs12984929 et NLRP3
-rs10754558) génotypés par MALDI-TOF spectrométrie de masse ont été choisis au hasard pour la confirmation des résultats par PCR en temps réel. Les séquences d'amorces et conditions de cyclage thermique sont décrites dans le tableau S2 dans les tableaux S1. En tant que validation de la méthodologie mise en œuvre pour le génotypage de NLRP3-
42 pb-VNTR, analyses de séquençage ont été réalisées dans 10% des échantillons d'étude choisis au hasard, au Centre Ramaciotti, UNSW, Australie.
-test a été utilisé pour analyser les caractéristiques cliniques. La méthode de comptage directe a été utilisée pour estimer les génotypes et allèles fréquences. Déviation de Hardy-Weinberg (HWE) a été testé avec la bonté de l'ajustement test du chi carré (χ 2). Détermination du déséquilibre de liaison (LD) a été basée sur un test de rapport de vraisemblance, dans lequel l'importance du rapport de vraisemblance observé est obtenu par le calcul de la distribution nulle de ce rapport dans l'hypothèse d'équilibre de liaison, en utilisant une procédure de permutation [18]. Haplotype inférence a été réalisée au moyen de l'Expectation-Maximisation (EM) pour le multi-locus données génotypiques [19]. Les odds ratios (OR) et les intervalles de 95% de confiance (IC) ont été calculées au moyen de test de probabilité exacte de Fisher (deux-tailed p
-values). Afin de corriger les facteurs de confusion, une régression logistique binaire (LR) ajusté par H. le statut et le sexe pylori a été réalisée. P
-values < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. les filtres de qualité pour l'exclusion des polymorphismes de l'analyse statistique inclus appeler des taux inférieurs à 95% et écart par rapport à HWE. Les données ont été analysées au moyen de la version des programmes de 3.1 Arlequin [20], GraphPad Prism la version 5.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, Etats-Unis) et SPSS, version 19.0.0. (SPSS Inc, Chicago, USA):
Receptor signalisation Pathway NOD-like
souche GC026 ( cagA
+, cAGE
+, CAGL
+, CAGT
+ , vacA
s1 m1 +, BABA
+, OIPA
+, Dupa
+ et saba de la +) a été isolé à partir un patient de GC à l'hôpital universitaire de la Malaisie, Kuala Lumpur [21], [22]. Le H. pylori la souche 26695 ( cagA
+ et vacA
s1m1 +) a été isolé chez un patient souffrant de gastrite [23] (code ATCC 700392). Les deux H. Les souches pylori de ont été cultivées pendant deux jours sur des plaques de gélose au sang de cheval (gélose au sang de base N ° 2 additionné de 6% stérile de sang de cheval défibriné (Oxoid, Heidelberg Ouest, Vic., Australie) à 37 ° C dans un bocal anaérobie contenant un kit de génération de gaz (Oxoid) pour fournir une atmosphère microaérobique de 6% O 2, 10% de CO 2 et 84% N 2.
souches GC026 et 26695 ont été ensuite ajoutés au milieu à une multiplicité d'infection de 1, et incubées pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. La concentration bactérienne ajoutée a été déterminée sur la base d'une courbe standard et la densité optique (DO) des lectures à 595 nm en utilisant un modèle de Bio-Rad lecteur de microplaques 550 (Bio-Rad). La concentration réelle ajoutée a été confirmé par le comptage des unités formant colonie (UFC) cultivées sur des plaques de gélose au sang de cheval, après dilution en série de la suspension bactérienne.
Extraction de l'ARN, l'ADNc de préparation et de PCR des tableaux.
26695-infectés et (contrôle) des échantillons non infectés correspondant. Les expériences ont été réalisées en utilisant le cycleur Rotor-Gene Q (Corbett Life Sciences, Doncaster, Australie).
-values. < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significative
état de l'infection et l'âge médian sont indiqués dans le tableau S3 dans les tableaux S1. Le sexe masculin a été jugée plus prédominant chez les patients du GC que chez les témoins FD, montrant une association positive avec le développement de la GC dans cette population d'origine chinoise (OR: 2,15, IC à 95%: 1,29 à 3,58, P
-value: 0,0036). H. pylori de l'infection a été détectée pour être présent dans 68,7% des individus dans cette étude (73/87 patients du GC et 140/223 FD contrôles). Comparaison de la prévalence de H. pylori de l'infection chez les patients du GC et des contrôles FD a montré que H. pylori de l'infection était un facteur de risque pour le développement de GC (OR: 2,38, IC à 95%: 1,41 à 3,99, P
-value: < 0,0001). Même si les sujets dans cette étude ont été appariés en fonction de 5-ans les groupes d'âge, l'âge médian des patients du GC (65,3 yrs) était significativement plus élevé que celui des contrôles FD (54,3 yrs) ( P
-value: <. 0,0001)
-rs12984929 (χ 2: 35,98), CARD8-
rs4802445 (χ 2: 5,87) et CARD8-
rs6509368 (χ 2: 5,43). Vingt et un des polymorphismes dans NLRP3
(n = 5), NLRP12
(n = 3), NLRX1
(n = 3), ASC
(n = 4) et CASP1
(n = 6) ont été jugées non-polymorphes dans cette population d'origine chinoise (tableau S1 dans les tableaux S1).
fréquences
-rs11672725 génotype TT a montré une forte association avec GC dans l'analyse statistique bivariées (OR: 4,80, IC à 95%: 1,39 à 16,58). En plus de CARD8
-rs11672725, quatre polymorphismes ont montré des résultats limites dans l'analyse bidimensionnelle ( NLRP3
-rs10754558, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs199475867 et NLRX1
-rs10790286) (tableau 1). D'autres analyses statistiques multivariées, l'ajustement pour H. pylori
infection et le sexe masculin, ont montré que la CARD8
-rs11672725 génotype TT est resté un facteur de risque pour GC dans cette population d'origine chinoise (tableau 2).
CARD8-NLRP12, un NLRP3
(HAP3) et trois NLRX1-CASP1
(Hap21, 23 et 24) haplotypes ont été trouvés pour augmenter le risque de GC dans cette population d'origine chinoise. Fait intéressant, Hap1 abrite le CARD8
-rs11672725 allèle T et Hap21 et Hap23 abritent NLRX1
-rs10790286 allèle C, ce qui montre la cohérence avec les résultats obtenus à partir de l'allèle et le génotype analyse.
est connu pour être un facteur de risque majeur associé à GC, d'autres analyses ont été réalisées pour évaluer l'association entre les polymorphismes génétiques impliqués dans la voie de signalisation NLR et H. pylori
infection. Fait intéressant, Chinois étude cas-témoins ethnique a montré que NLRX1
-rs10790286, NLRP12
-rs2866112, NLRP12
-rs4419163 et ASC
-rs8056505 ont été associés à un risque significativement accru de H. pylori
infection chez ces personnes (tableau S6 dans les tableaux S1). analyse statistique multivariée a confirmé que NLRP12
-rs2866112 a été associée à un risque accru de H. pylori
chez les individus chinois (OR: 2,13, IC à 95%: 1,22 à 3,71)
statut par rapport au risque de GC, dans une tentative de déterminer l'existence d'une interaction biologique sous forme de synergie ou d'antagonisme. Il est frappant, les personnes hébergeant dix des polymorphismes sélectionnés ( CARD8
-rs10405717, NLRP3
-rs12079994, NLRP3
-rs3806265, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs2866112, NLRP12
-rs4419163, NLRX1
-rs10790286, CASP1
-rs2282659, CASP1
-rs530537 et CASP1
-rs61751523) et infectées par H. pylori
ont été observées pour être plus à risque de GC, la majorité de ces RUP étant dans la gamme 4,0-5,0 (tableau 3). En revanche, en l'absence de H. pylori de l'infection, CARD8
-rs2043211 diminué de manière significative le risque de GC (OR: 0,19, IC à 95%: 0,06 à 0,63)
Helicobacter pylori. l'expression de plusieurs molécules impliquées dans le NOD-like Receptor la signalisation Pathway
sur les molécules impliquées dans la voie de signalisation NLR, nous avons évalué l'expression de 84 gènes codant pour NLR, d'autres composants de inflammasome, les régulateurs négatifs, les cytokines pro-inflammatoires, caspases pro-inflammatoires et des molécules impliquées dans la signalisation en aval, dans THP-1 macrophages -derived après exposition à deux différents H. Les souches pylori de (de GC026 et 26695). Dans H. Les cellules THP1 de GC026 contesté par pylori, 49 gènes ont été exprimés de façon différentielle par rapport au groupe témoin (tableau S7 dans les tableaux S1 et S1 dans les figures Figure S1). Parmi ceux-ci, régulation à la hausse statistiquement significative et la régulation d'au moins deux fois a été trouvé dans les gènes 17 et 28, respectivement (tableaux 4 et 5). Trente-cinq gènes ont été exprimés de manière différentielle entre le groupe témoin et le groupe exposé à H. pylori
26695 (Tableau S7 dans les tableaux S1 et S2 Figure dans les figures S1). Parmi ceux-ci, une régulation statistiquement significative et la régulation d'au moins deux fois a été trouvé dans 5 et 23 gènes, respectivement (tableaux 4 et 5).
Helicobacter Pylori
Souches associés avec le cancer gastrique et gastrite mènent à différents niveaux d'expression de cytokines et de chimiokines
, IL1B
, IL12B, IL6
, IL33
et TNF
) et chimiokines ( CXCL1
, CXCL2, CCL5
) étaient significativement régulés à la hausse dans les cellules THP-1 contestées à la fois avec H. pylori
GC026 et 26695 souches (tableau 4). En outre, une réponse immunitaire intense ( CXCL1
, CXCL2
, CCL5
, IL6
, IL12B
, TNF
et IFNB1
) a été lancé contre H. pylori
GC026 (figure 1A). Fait intéressant, un certain nombre de gènes codant pour les chimiokines ( CCL2
et CCL7
) et des cytokines ( IL18
, TNFSF11
et CD40LG
) ont été régulés à la baisse dans les H. -challenged THP-1 de cellules pylori (tableau 5).
avec simultanée Marqué bas-règlement de NLRP12
et NLRX1
et RELA
entre H. pylori
GC026- et cellules 26695-contestées. Remarquablement, bien que RELA
a montré une baisse des niveaux de cellules THP-1 exposées à la fois H. Les souches pylori de (plier règlement: 0,49, p
-value: 0,044673 et plier règlement: 0,26, p
-value:. 0,131017 pour H pylori
GC026 et 26695, respectivement), régulation à la hausse statistiquement significative de NFKB1
n'a été observée que dans H. Les cellules GC026-contestées de pylori (fold règlement: 2,50, p
-value: 0,006825). (figure 1C)
augmente l'expression de PTGS2
et BIRC3
était significativement régulée à la hausse dans les cellules THP-1 lors d'une exposition à la fois H. Les souches pylori de, H. Les cellules GC026-contestées de pylori (pli règlement: 54.03, p
-value: 0,0247) montrant les niveaux d'expression significativement plus élevés par rapport à H. pylori
cellules 26695-contestées (plier règlement: 19,56, p
-value: 0,016089) (figure 1d). En outre, un deuxième gène impliqué dans la carcinogenèse, BIRC3
, était exclusivement régulée à la hausse dans les H. Les cellules GC026-contestées de pylori (pliez règlement: 12.28, p
-value: 0,001638). (figure 1D)
infection et cette bactérie est initialement visé par PRR, nous avons étudié le rôle des molécules impliquées dans la voie de signalisation NLR dans H. pylori
infection et GC connexe.
-rs11672725 génotype TT est un facteur de risque cohérent pour GC dans les individus chinois. CARD8
, situé à 19q13, code pour la protéine du domaine de recrutement des caspases 8 (CARD8), également connu sous le nom TUCAN, qui a été rapporté pour interagir avec NLRP3, supprimer les signaux d'activation de NF-kB et surexprimé dans les tissus cancéreux humains y compris les tissus de l'ovaire, du poumon et le cancer du sein [25] - [27]. À ce jour, une seule étude, menée dans une population allemande, a évalué le rôle de ce polymorphisme dans la maladie [28]. Ces auteurs ont abordé la relation entre CARD8