PLoS ONE: Povećanje zračenja učinke ursolic kiseline u BGC-823 humanog adenokarcinoma želuca Cancer Cell Line

Sažetak pregled

Nedavna istraživanja su pokazala da određene biljne polifenole, tj ursolic kiselina (UA), koji su izvijestili da su antitumorsko djelovanje, može se koristiti za senzibilizirati stanice tumora na terapiju zračenjem inhibirajući putevima koji vode do otpora zračenja. Ovaj eksperiment je osmišljen kako bi ispitati učinke i mogući mehanizam radiosenzibilizacije po UA u BGC-823 stanična linija iz ljudskog adenokarcinoma raka želuca in vitro pregled. UA izazvao citotoksičnost na način ovisan o dozi, a koristi se koncentracija sub-citotoksičnosti UA testirati radioenhancement djelotvornost s UA u raka želuca. Radiosenzitivnost određena je klonogenskog testa preživljavanja. Preživjeli dio kombiniranog grupe sa zračenjem i sub-citotoksičnosti UA značajno smanjen u odnosu na zračenja grupi. Poboljšani radiosebzibilizacija učinkovitost bila povezana s poboljšanom G2 /M uhićenja, povećana reaktivnih vrsta kisika (ROS), dolje regulira Ki-67 razina i poboljšanu apoptozu. U zaključku, kao UA pokazali jako antiproliferativne učinak i sinergijski učinak, može se koristiti kao potencijalni osjetljivost lijeka za primjenu radioterapije pregled

Izvor:. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L , Qian X, et al. (2015) Jačanje zračenja učinke ursolic kiseline u BGC-823 humanog adenokarcinoma želuca stanična linija karcinoma. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169 pregled

Urednik: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 26 siječnja 2015; Prihvaćeno: 24. lipnja 2015; Objavljeno: 15. srpnja 2015 pregled

Copyright: © 2015 Yang i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu pregled

Financiranje:. Supported by potpora iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (Grant br 81172094), prvih šest talente projekt provinciji Jiangsu (Grant br 2011ws005), te medicinskih znanosti i tehnologije Razvojni projekti Nanjing (Grant br ZKX10011). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Unatoč padu incidencije, rak želuca još uvijek se smatra jednim od vodećih uzroka smrti izazvane rakom diljem svijeta. Kirurgija i dalje je glavno bilo ljekovito tretmana; Ipak, oko dvije trećine bolesnika s karcinomom želuca dijagnosticiran imaju kirurški odstraniti lokalno uznapredovalog i /ili metastatskog bolesti. 5 godina stopa preživljavanja pacijenata koji su s naprednim loco-regionalna raka želuca dijagnosticiran su kroz ljekovito resekcija ostati niska zbog visokog rizika od lokalnog recidiva ili udaljenih metastaza, čak i ako resekcija se vjeruje da je ljekovito. [1] perspektiva randomizirano narušeno (INT) -0116 suđenje (556 bolesnika) i retrospektiva Korean iskustvo (990 bolesnika) reducirane lokalnoj tarifi recidiva s postoperativnom regionalne zračenje u kombinaciji s kemoterapijom i veću stopu preživljavanja u adjuvantna ruku. [2] Radioterapija je glavni loco-regionalna kontrola modalitet neoperabilnim raka želuca [3] Nacionalni Comprehensive Cancer Network (NCCN) smjernice preporučuju radioterapije kao standardni tretman za pacijente s rakom želuca s visokim rizikom od recidiva. [4], međutim, postoje dva glavna ograničenja povezanih s liječenje raka želuca zračenjem: (1) intrinzična ili stečena otpornost na radioterapiju; (2) nespecifična toksičnost prema sluznice želuca i okolnog normalnog tkiva. [2,5] pregled

Da bi se riješila ova ograničenja, znanstveni pokušaji da se u potrazi za učinkovitu radiosensitizer iz bilja s nižom toksičnosti i veće učinkovitosti. Nedavna istraživanja su pokazala da mnoge biljne polifenole, uključujući Kurkumin, flavopiridola, emodin, ursolic kiseline i sl, može se koristiti za senzibiliziranje tumorskih stanica na kemoterapijskih agenasa i terapije zračenjem inhibirajući puteve koji vode do otpora liječenja. [6,7, 8] Ova sredstva su također utvrđeno da je zaštitna terapije povezane toksičnosti. [5] ursolic kiselina (UA), pentacikličke triterpene kiselina, koja se smatra jednom od najperspektivnijih kemoprevenciju raka, pokazalo se da se potakne antitumorski aktivnosti, uključujući zabranjivanje inicijacije tumora i promocije. [9,10] On također potiče diferencijaciju tumorskih stanica za regulaciju ekspresije gena diferencijaciju specifičnim za mišji F9 teratokarcinom stanica. [11] Osim toga, bilo je dokaza koji pokazuju da UA proizvedene antiangiogeno učinak kod pileta chorioalantoic membrane i anti-invazivne aktivnosti u HT1080 ljudsko fibrosarkoma stanica. [12.13] pregled

Međutim, prije istraživanja tek trebaju pokazati da li UA može pojačati učinke zračenja u zloćudna novotvorina , Eksperiment je osmišljen kako bi istražili učinke i mogući mehanizam in vitro radiosenzibilizacije po UA u BGC-823 stanična linija iz ljudskog adenokarcinoma raka želuca pružiti teoretsku podršku za kliničku uporabu. Pregled

Materijali i metode pregled

stanična kultura pregled

BGC-823 stanice dobivene su iz Šangaja Instituta za staničnu biologiju (Shanghai, Kina) i pohranjeni u 1640 mediju s 10% telećeg goveđeg seruma na 37 ° C u atmosferi zasićenog vodom s 5% CO _{2. pregled}

stanične citotoksičnosti test pregled

citotoksičnost je određena MTT test izvodi prethodno objavljeni. [14] Za ilustraciju, stanice su stavljene na 8 × 10 ^{3 stanica po jažici u pločicama s 96 jažica te je smjesa ostavljena preko noći da se. Zatim, stanice su tretirane s različitim koncentracijama UA (0, 5, 6.25, 10, 12.5, 20, 40, 50 ug /ml) za 48 sati na minimalno tri ponovljene jažice. Svakoj jažici je zatim dodano 20ul MTT, pripravljeni miješanjem 5 mg MTT s 1 ml fiziološke otopine i inkubirano je još 4 sata. Medij u svakoj jažici je bio zamijenjen s 150ul DMSO. Apsorpcija je određena pomoću čitača mikroposuda (OON-Rad) na 490 nm. Prazno kontrolne jažice su se koristili za nula apsorpciju. Brzina inhibicije (IC%) je izračunata pomoću pozadinsku korigirana apsorbancija pomoću slijedeće formule:. Pregled}

IC _{50 definirana je kao koncentracija potrebna za 50% -tnu inhibiciju rasta stanica pregled}

Cell grupiranje i in vitro ionizirajućeg zračenja pregled

Ćelije su nasumce podijeljeni u 4 skupine: kontrolna skupina (a), UA skupini (B), radioterapija (RT) skupinu (C), te u kombinaciji skupina (D ). BGC-823 stanice su uzgojene u ploče sa 6 jažica, a zatim skupina B i D su tretirani s UA, dok je skupina C i D su ozračene upotrebom 6-MeV elektronski snop linearnog akceleratora (Elekta, Sweden). Pregled

klonogenskog testa preživljavanja pregled

radiosenzitivnost je određena klonogenskog testa preživljavanja. Stanice (500-2000 po udubljenju) stavljene su u pločice sa 6-jažica, te ostavi da se vežu preko noći. Potom stanice su tretirane s UA (0, 6,25 i 10ug /ml) tijekom 24 h, a zatim izložen rastućim dozama RT (0, 2, 4, 6 i 8Gy). Nakon 10-14 dana inkubacije kolonije koja se sastoji od više od 50 stanica zabilježene. Kolonije su isprani pažljivo, obojeni etanol /kristalno ljubičaste boje, a zatim prebroje. Učinkovitost oplata (PE) je izračunata kao: (srednja vrijednost kolonija sjemenskih /stanica), a frakcije preživjelih (SF) je izračunata kao [znači kolonija /(sjemenskih stanica × PE)], pri čemu PE definirana je kao (znači kolonija za uN-zračenju kontrola /sjemenskih stanica). D _{0 vrijednosti izračunate su više-ciljnog modela single-hit [S = 1 - (1-e ^{D /D0) N], što predstavlja prosječnu dozu smrtonosnog izloženosti. Omjer povećanje osjetljivosti na (SER) je izračunata kao D 0 odnos kombinirano liječenje i samo ST. pregled}}

staničnog ciklusa analiza pregled

Utjecaj staničnog ciklusa je analiziran pomoću propidij jodid /RNaza pufer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) bojanjem u skladu s uputama proizvođača. 2,5 x 10 ^{5 stanice su nanesene na ploče sa 6 jažica, te ostavi da se vežu preko noći. Zatim, stanice su tretirane s UA (0 i 10ug /ml) tijekom 24 h, a zatim izložena sobnoj temperaturi (0 i 2Gy) tijekom 48 h. Stanice su sakupljene tripsinizacijom, fiksirane u 70% etanolu pri -20 ° C, isprane u PBS, suspendirane u 1 ml PBS koji sadrži 1 mg /ml RNase i 50 ug /ml propidijevog jodida, inkubirani u mraku 30 minuta na 37 ° C, i analiziraju pomoću protočne citometrije (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). pregled}

Mjerenje apoptoze

stanice kvantifikaciju apoptoze stanica je ocijenjena pomoću Annexin-FITC-V Apoptoza Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) prema uputama proizvođača. 2,5 x 10 ^{5 stanice su nanesene na ploče sa 6 jažica, te ostavi da se vežu preko noći. Zatim, stanice su tretirane s UA (0 i 10ug /ml) tijekom 24 h, a zatim izložena sobnoj temperaturi (0 i 2Gy) tijekom 48 h. Stanice su sakupljene tripsinizacijom i ponovno suspendirane u 500ul iz pufera za vezanje i 5ul aneksina V-fluorescein izotiocijanat (FITC), a zatim se doda 5ul propidij jodida (PI). Analize su provedene uz protočne citometrije. Pregled}

Detekcija reaktivni kisikovi (ROS) generiranje pregled

koncentracije intracelularne ROS su detektirani pomoću membrane propusne za fluorescentno 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetata (DCFH-dA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kina) u skladu s uputama proizvođača. 1 × 10 ^{6 stanice su nanesene na ploče sa 6 jažica, te ostavi da se vežu preko noći. Zatim, stanice su tretirane s UA (0 i 10ug /ml), tijekom 24 h, a zatim izložen na sobnu temperaturu (0 i 2Gy) tijekom 48 h. Stanice su sakupljene tripsinizacijom, resuspendirane DCFH-DA za 30 minuta, isprana je RPMI seruma 1640, a zatim protočnom citometrijom. Srednja intenzitet fluorescencije (MFI) predstavljen unutarstanični nivo ROS. Pregled}

Imunohistokemijsko bojanje procjenu Ki-67 ekspresiju pregled

Ki-67 ekspresija proteina je procijenjena pomoću avidin-biotin kompleksa imunohistokemijske (ZSGB-BIO , Beijing, China) u skladu s uputama proizvođača. 2 x 10 ^{4 stanice su stavljene na ploče sa 6 jažica s cover slip za svaku jažicu, te se ostavi da se vežu preko noći. Potom stanice su tretirane s UA (0 i 10ug /ml), tijekom 24 h, a zatim izložen na sobnu temperaturu (0 i 2Gy) tijekom 24 h. Zatim su prekrivene su fiksirane u 4% paraformaldehidu, inkubira s 0,5% Triton X-100 tijekom 20 minuta, isprane u PBS i inkubirane s 3% H _{<2O pod> 2 za 15 minuta. Nakon ispiranja s PBS tri puta, stanice koje su pričvršćene na poklopcima su inkubirane s Ki-67 monoklonskih antitijela za 60 min na 37 ° C, a zatim isprane u PBS ponovno. Biotin-konjugiranih sekundarnih antitijela tijekom 20 minuta pri 20-37 ° C, ispere s PBS četiri puta, zatim obojeni DAB kompleta za bojanje, ispere s vodom i zatim protu hematoksilinom. Pregled}}

Statistička analiza pregled

podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, srednja usporedbe su izvedene s jednosmjernim ANOVA. P < 0.05 je prihvaćena kao statistički značajna. Statistička analiza provedena je pomoću SPSS, v. 17.0. Pregled

Rezultati

citotoksične učinke UA na BGC-823 stanicama pregled

citotoksični učinak UA na BGC-823 stanica procijenjena je na temelju MTT pokusom. otkrili smo da UA ovisno o dozi povećana citotoksičnost u želučanoj raka stanične linije BGC-823 (Slika 1). Polu-maksimalna inhibitorna koncentracija (IC _{50) vrijednosti za BGC-823 bila 17.5ug /ml. Blago citotoksičnost (< 15%) UA za BGC-823, 10ug /ml, je bio korišten za naknadne planiranih eksperimenata, za kontrolu za radioenhancement zbog izravnog citotoksični učinak pregled}

U radiosenzibilizacije učinci UA u. vitro pregled

krivulje preživljavanja stanica mjerene klonogenskog testa preživljavanja je prikazano na slici 2. u usporedbi s RT samo SF _{2 RT kombinaciji s UA značajno smanjio u BGC-823 stanice, ser vrijednosti kombinirane grupe su 1.180 puta i 1.315 puta. Ovi rezultati pokazuju da UA pojačan učinak zračenja BGC-823 u dozi ovisno u laganom koncentracije citotoksičnosti. Pregled}

distribucija staničnog ciklusa i indukcije apoptoze. Pregled

Da bi istražili da li RT i /ili UA liječenje može izazvati bilo koji perturbacija staničnog ciklusa, analiza BGC-823 stanice tretirane 2Gy zračenjem i /ili 10ug /ml UA je izvedena. U odnosu na kontrolnu skupinu, 10ug /ml UA sami dobiveno gotovo nema učinka na stanični ciklus. Međutim, kombinirani skupina UA i zračenja induciranih staničnog ciklusa na G _{1 faze (51.87% prema 60,28%, p = 0,13), a G 2 /M fazi (3.14% VS 13,67%, p <0,01) u usporedbi s 2Gy ozračivanja skupini (slika 3A i 3C). Ovi rezultati ukazuju na to da je liječenje kombinacija možda izazvao G 1 fazu i G 2 /M fazi uhićenje, koji je više osjetljiv na štetne učinke zračenja. Na slične zaključke iz podataka staničnog ciklusa je dokazano prethodnog studija. [15] pregled}

Kombinacija UA i zračenje također može uzrokovati više apoptotski smrt stanica kao što je prikazano na slici 3B. Udio apoptotičnih stanica znatno povećana primjenom oba UA i zračenja u BGC-823 stanice, za razliku od UA ili IR liječenju sama. (78,2% vs 9,6% i 12,5%, p < 0.01, slika 3D) pregled

UA povećao RT izazvana stvaranja ROS pregled

to je široko prihvaćeno da ubijanje stanica nakon izlaganja ionizirajućem zračenju djelomično posredovan ROS. [16] ROS analize pomoću DCF-dA proizveden srednji fluorescentni intenzitet (MFI), koji je predstavljao intracelularne razine ROS svake grupe (Slika 4a i 4b). MFI od UA sama grupa, RT sama grupa i UA + RT grupe porasla je za 1,15 puta, 1.53-puta i 2.09 puta u usporedbi s kontrolnom skupinom. Razina ROS u kombiniranoj skupini značajno povećala u odnosu na samo skupine RT, otkriva da dodavanjem UA na RT izazvana više stvaranja ROS od samog RT. Pregled

Imunohistokemisjko bojenje Ki-67 pregled

Ki -67 je bio poznat kao nuklearni antigen, koji se često povezuje s proliferaciju stanica. Naš pokus otkriven pozitivnu stopu Ki-67 proteina imunokemijskim metodama, a rezultati su ilustrirani na Slici 5. Postotak Ki-67 pozitivnih stanica u kombinaciji skupine smanjio značajno u usporedbi s kontrolnom skupinom, kao i terapijske skupine zračenja . pregled

Rasprava pregled

Ovo istraživanje ispituje učinke i mogući mehanizam UA kao radiosensitizer. MTT test i klonogenskog testa preživljavanja pokazala da je IR kombinaciji s UA bio superiorniji u citotoksičnosti nego samo IR. Taj efekt je zapaženo u obje skupine s različitim koncentracijama sub-citotoksičnosti UA, 6.25ug /ml te 10ug /ml. Na ovoj dozi, UA imala blagi citotoksičnost na ljudski adenokarcinom želuca rak stanične linije BGC823 i nije imao značajnu citotoksičnost za normalnu staničnu liniju želuca. [17] To je pokazao da UA bio obećavajući radiosebzibilizacija In vitro pregled.

u središtu radioterapije raka maksimizira terapijsku učinkovitost u tkivu tumora, a umanjuje oštećenja normalnog tkiva. Dok razrađen planiranje i nedavne fizičke tehnike mogu sigurno povećati dozu zračenja na tkivu tumora, a smanjenje doze na okolna normalna tkiva, [18] trenutne tehnike radioterapije i dalje ne može se izbjegne ozljeđivanje blizini normalna tkiva. Nadalje radioterapeutska prednosti mogu naći ispitivanjem biološkog odgovora mikro tumora otkriti način da se poveća osjetljivost jednog tumora zračenju ili inhibiraju nuspojave zračenjem. [19] pregled

Normalno tkivo oko karcinoma želuca, kao što su crijeva i želuca, osjetljivi su na ionizirajućeg zračenja. Kao rezultat toga, doza ionizirajućeg zračenja prema tkivu tumora mora biti ograničen. Štoviše, preklopljena nuspojave ionizirajućeg zračenja će poboljšati radioterapije nuspojave, pa čak i prekinuti liječenje. Koncentracija Pod-citotoksičnost UA u kombinaciji s ionizirajućem zračenju, međutim, može povećati citotoksičnost od ionizirajućeg zračenja, dok je niska koncentracija UA je gotovo bezopasni za normalnog tkiva. Ova strategija može povećati terapeutski indeks u tumorskom tkivu, bez povećanja doze zračenja i radioterapeutska nuspojava. Pregled

Kako prepoznati mehanizam radiosenzibilizacije UA, proveli smo analizu u više koraka. Prvo, mi smo analizirali raspodjelu staničnog ciklusa. Koncentracija Pod-citotoksičnost UA nisu donijeli nikakav značajan učinak na stanični ciklus, dok je u usporedbi s ionizirajućim zračenjem sama, kombiniranu terapiju poboljšane G _{2 /M uhićenje. Radiosenzitivnost stanica u korelaciji sa staničnom ciklusu, a korelacija je veća u G 2 /M fazi i niže u S fazi. To može biti najvažniji temeljni razlog za pojačanu radiosenzibilizacije promatrane u ovom istraživanju. Drugo, analizirali smo unutarstanične razine ROS. ROS razina kombinacija skupine znatno povećana u odnosu na kontrolnu skupinu, skupina sa samim UA, ili čak skupine ionizirajućeg zračenja. Dodatak UA zračenja izazvana više stvaranja ROS ionizirajućeg. Ionizirajuće zračenje inducira radiolizu vode, koja nastaje ROS, poput hidroksilne radikale i superoksida. Ove ROS molekula je odigrao važnu ulogu u zračenja izazvanog stanične lezije, kao što su oštećenje oksidativni DNK zračenja, potencijalno dovodi do oba klonogene smrti i apoptoze. Treće, u ovom istraživanju, pronašli smo da je postotak Ki-67 pozitivnih stanica u kombiniranoj grupi smanjio značajno u usporedbi s kontrolnom skupinom ili zračenje grupe. Ki-67 je poznata kao staničnog ciklusa povezana antigena i koristan marker proliferacije. Ki-67 razina proteina u korelaciji s višim proliferacije i metastaze sposobnosti. [20,21] pregled}

U zaključku, ova studija je prvi pokušaj da se pokaže da je UA mogao synergize ionizirajućem zračenju protiv ljudskih staničnih linija raka želuca , Temeljni mehanizam poboljšanog radiosenzibilizacije učinkovitosti mogu biti poboljšana G2 /M zastoja, povećana ROS i podregulirani Ki-67 razine. Skupno navodi kao UA pokazali snažnu antiproliferacijski učinak i sinergistički učinak, može se koristiti kao potencijalni osjetljivost lijeka za primjenu radioterapije. Međutim, to je bez sumnje da daljnja istraživanja kako bi se procijenila izvedivost i prednosti korištenja tradicionalne kineske medicine, kao radiosensitizers prije stvarne kliničke primjene. Više eksperimenti i ponavljanja, potrebne su druge vrste tumora i na životinjskim ispitivanjima kako bi se potvrdila učinkovitost predložene strategije. Pregled