PLOS ONE: aumento dos efeitos da radiação por ácido ursólico em Linha celular BGC-823 Adenocarcinoma Humano Câncer Gástrico

Sumário

A pesquisa recente tem sugerido que certas polifenóis derivados de plantas, ou seja, ácido ursólico (UA), que são referidos como tendo actividades anti-tumorais, pode ser utilizado para sensibilizar células de tumor à terapia de radiação pela inibição das vias conduzindo à resistência a terapia de radiação. Este experimento foi concebido para investigar os efeitos e possível mecanismo de radiossensibilização pela UA na linha de células BGC-823 de cancro gástrico adenocarcinoma humano in vitro
. UA causada citotoxicidade de uma forma dependente da dose, e utilizou-se uma concentração sub-citotoxicidade de UA para testar a eficácia radioenhancement com UC em cancro gástrico. Radiossensibilidade foi determinada por ensaio de sobrevivência clonogénica. Fracção sobrevivente do grupo combinado com irradiação e sub-citotoxicidade UA diminuiu significativamente em comparação com o grupo de irradiação. A eficácia radiossensibilização melhorou foi associada com um aumento G2 /M detenção, o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), regulada para baixo Ki-67 nível e melhorou a apoptose. Em conclusão, demonstrou como UA efeito antiproliferação e potente efeito sinergético, que poderia ser utilizado como um sensibilizador de droga potencial para a aplicação de radioterapia

citação:. Yang Y, Jiang H, J, Hu, Lv X, L Yu , X Qian, et al. (2015) aumento dos efeitos da radiação por ácido ursólico em Linha celular BGC-823 Adenocarcinoma Humano câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169

editor: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Estados Unidos

Recebido: 26 Janeiro, 2015; Aceito: 24 de junho de 2015; Publicação: 15 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Suportado por concessões do National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81.172.094), Top seis talentos Projeto da província de Jiangsu (Grant No. 2011ws005), e da Ciência e Tecnologia médica Projetos de desenvolvimento de Nanjing (Grant No. ZKX10011). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar de um declínio da incidência, o câncer gástrico ainda é considerada uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A cirurgia continua a ser o esteio de qualquer tratamento curativo; No entanto, cerca de dois terços dos pacientes diagnosticados com câncer gástrico têm a doença localmente avançada e /ou metastática irressecável. A taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes que foram diagnosticados com câncer gástrico loco-regional avançada e foram submetidos a ressecção curativa permanecem baixas devido ao alto risco de recorrência ou distantes metástases locais, mesmo se a ressecção foi acreditado para ser curativa. [1] Uma perspectiva randomizado Intergroup (INT) -0116 estudo (556 pacientes) e retrospectivo experiência coreana (990 pacientes) mostrou uma redução na taxa de recorrência local com radiação regional de pós-operatório combinado com quimioterapia e uma taxa de sobrevivência superior no braço adjuvante. [2] a radioterapia é o principal modalidade de controle loco-regional para câncer gástrico irressecável [3] A Comprehensive Rede Nacional do câncer (NCCN) recomendam radioterapia como tratamento padrão para pacientes com câncer gástrico com um alto risco de recorrência.; [4] No entanto, existem dois limites importantes associados com o tratamento de cancro gástrico com radiação: (1) resistência intrínseca ou adquirida à radioterapia; (2) toxicidade não específica no sentido de mucosa gástrica e tecidos normais circundantes. [2,5]

Para resolver estas limitações, tentativas acadêmicas têm sido feitos para procurar um radiossensibilizador eficaz de ervas com menor toxicidade e maior eficácia. Pesquisas recentes têm sugerido que muitos polifenóis derivados de plantas, incluindo a curcumina, flavopiridol, emodina, ácido ursólico e etc, pode ser utilizado para sensibilizar células tumorais aos agentes quimioterapêuticos e a terapia de radiação através da inibição das vias que levam à resistência ao tratamento. [6,7, 8] Estes agentes também têm sido encontrados para ser protetor de toxicidades associadas a terapia. [5] ácido ursólico (UA), um ácido triterpeno pentacíclico, que é considerado um do agente quimiopreventivo mais promissores para o cancro, foi mostrado para levar antitumoral actividades, incluindo inibição de iniciação e promoção do tumor. [9,10] É também induziu diferenciação das células do tumor por regulação da expressão de genes específicos da diferenciação das células de teratocarcinoma F9 rato [11]. Além disso, tem havido evidência que demonstra que UA produzido um efeito anti-angiogénico no pinto membrana chorioalantoic e uma actividade anti-invasiva em células de fibrossarcoma humano HT1080. [12,13]

no entanto, pesquisas anteriores ainda tem de demonstrar se UA pode aumentar os efeitos da radiação no tumor maligno . O experimento foi concebido para explorar os efeitos e possível mecanismo in vitro de radiossensibilização pela UA na linha de células BGC-823 de cancro gástrico adenocarcinoma humano para fornecer o suporte teórico para o uso clínico.

Materiais e métodos

cultura celular

células BGC-823 foram obtidas a partir de Shanghai Institute of Cell Biology (Xangai, China) e armazenadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro de vitelo de bovino a 37 ° C numa atmosfera saturada de água com 5% de CO _2.

citotoxicidade celular ensaio

a citotoxicidade foi determinada por um ensaio MTT realizada previamente publicada. [14] Para ilustrar, as células foram plaqueadas a 8 × 10 ^{3 células por poço em placas de 96 poços e deixadas fixar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com várias concentrações de ácido úrico (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) durante 48h em um mínimo de três cavidades replicadas. Cada cavidade foi depois adicionado 20 ul de MTT, preparado através da mistura de 5 mg de MTT com 1 ml de solução salina normal, e incubou-se durante 4 h adicionais. Meio em cada poço foi substituído com DMSO 150ul. A absorvância foi determinada com um leitor de microplacas (BIP-RAD) a 490 nm. Os poços de controlo em branco foram usadas para fazer o zero de absorvância. A taxa de inibição (% IR) foi calculada utilizando a absorvência corrigida-fundo pela equação seguinte:.}

O IC _{50 foi definido como a concentração necessária para uma inibição de 50% do crescimento celular}

agrupamento celular e in vitro radiação ionizante

As células foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: grupo controle (a), o grupo UA (B), radioterapia (RT) grupo (C), e grupo combinado (D ). As células BGC-823 foram cultivadas em placas de 6 poços, e, em seguida, Grupo B e D foram tratadas com UC, enquanto o Grupo C e D foram irradiadas usando uma 6-MeV acelerador linear de feixe de electrões (Elekta, Suécia).

clonogênica ensaio de sobrevivência

Radiosensibilidade foi determinada pelo ensaio de sobrevivência clonogênica. As células (500-2000 por poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com UC (0, 6,25 e 10 ug /ml) durante 24 h e, em seguida, expostos a doses crescentes de RT (0, 2, 4, 6 e 8Gy). Após 10-14 dias de incubação, colónias consistiu em mais do que 50 células foram observadas. As colônias foram lavados cuidadosamente, corados com corante violeta etanol /cristal, e depois contados. A eficiência de plaqueamento (PE) foi calculada como (média de contagens de colónias /células semeadas), e sobrevivendo fração (SF) foi calculado como [média da contagem das colónias /(células semeadas × PE)], onde PE foi definido como (média da contagem das colónias para un-irradiada controles /células seeded). D _{0 valores foram calculados por um modelo multi-target-hit single [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], o que representou a dose média de uma exposição letal. relação de reforço sensibilizador (SER) foi calculada como D 0 rácio entre o tratamento da combinação e RT isoladamente.}}

ciclo celular análise

A influência do ciclo celular foi analisada utilizando tampão de iodeto de propídio /ARNase (BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) de coloração de acordo com as instruções do fabricante. 2,5 × 10 ^{5 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com UC (0 e 10 ug /ml) durante 24 h e depois exposta a RT (0 e 2 Gy) durante 48 h. As células foram recolhidas por tripsinização, fixadas em 70% de etanol a -20 ° C, lavadas em PBS, ressuspensas em 1 ml de PBS contendo 1 mg /ml de RNase e 50 ug /mL de iodeto de propídio, incubadas no escuro durante 30 min a 37 ° C, e analisadas por citometria de fluxo (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EUA).}

Medição da apoptose

células quantificação de células de apoptose foi avaliada utilizando uma anexina V-FITC apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. 2,5 × 10 ^{5 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com UC (0 e 10 ug /ml) durante 24 h e depois exposta a RT (0 e 2 Gy) durante 48 h. As células foram recolhidas por tripsinização, e ressuspenso em 500 ul de tampão de ligação, e 5 ul de isotiocianato de Anexina-V-fluoresceína (FITC), e, em seguida, foram adicionados 5 ul de iodeto de propídio (PI). As análises foram realizadas com uma citometria de fluxo.}

A detecção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração

As concentrações de ROS intracelular foram detectados utilizando as sondas fluorescentes membrana permeável 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetato (DCFH-dA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, China) de acordo com as instruções do fabricante. 1 × 10 ^{6 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com UC (0 e 10 ug /ml) durante 24 h, e em seguida exposta a RT (0 e 2 Gy) durante 48 h. As células foram recolhidas por tripsinização, ressuspensas DCFH-DA, durante 30 min, lavou-se por RPMI 1640 sem soro, e depois detectada por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência média (MFI) representada nível ROS intracelular.}

coloração imuno-histoquímica para avaliar Ki-67

Ki-67 expressão da proteína foi avaliada pela imuno-histoquímica complexo avidina-biotina (ZSGB-BIO , Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. 2 × 10 ^{4 células foram plaqueadas em placas de 6 poços com uma lamela de cobertura para cada cavidade, e deixadas a ligar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com UC (0 e 10 ug /ml) durante 24 h, e em seguida exposta a RT (0 e 2 Gy) durante 24 h. Em seguida as lamelas foram fixadas em paraformaldeído a 4%, incubadas com 0,5% de Triton X-100 durante 20 min, lavadas em PBS, e incubou-se com 3% H _{2O 2 durante 15 min. Após lavagem com PBS três vezes, as células que foram ligados nas lamelas foram incubadas com Ki-67 anticorpos monoclonais durante 60 min a 37 ° C, e, em seguida, lavou-se de novo em PBS. anticorpos-biotina secundário conjugado durante 20 minutos a 20-37 ° C, lavaram-se com PBS durante quatro vezes, em seguida, coradas por coloração DAB Kit, lavado com água, e depois contra-coradas com hematoxilina.}}

A análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± SD, e significa comparações foram feitas pela ANOVA one-way. P < 0,05 foi aceito como estatisticamente significativo. A análise estatística foi realizada usando SPSS, 17,0 v..

Resultados

efeitos citotóxicos da UA sobre BGC-823 células

O efeito citotóxico da UA na BGC-823 células foi avaliada com base no ensaio com MTT. Descobrimos que UA dependente da dose, aumentou a citotoxicidade na linha celular de cancro gástrico BGC-823 (Figura 1). A concentração inibitória de metade do máximo (IC _{50) para valores BGC-823 foi 17.5ug /ml. citotoxicidade ligeira (< 15%) da UA para BGC-823, 10 ug /ml, foi utilizado para experiências planejadas subsequentes, para controlar a radioenhancement devido a um efeito citotóxico direto}

Os efeitos radiossensibilização de UA em. vitro

curvas de sobrevivência celular medidos pelo ensaio de sobrevivência clonogênica foram ilustrados na figura 2. em comparação com RT somente, _{2 de RT combinado com UA diminuiu significativamente em células SF BGC-823, valores SER dos grupos combinados eram 1.180 vezes e 1.315 vezes. Estes resultados indicaram que UA aumentou o efeito de radiação BGC-823 de uma forma dependente da dose, dentro de pequenas concentrações de citotoxicidade.}

a distribuição do ciclo celular e a indução de apoptose.

Para investigar se a TA e /ou tratamento UA poderia causar qualquer perturbação do ciclo celular, uma análise de BGC-823 células tratadas com irradiação e /ou 2 Gy de 10 ug /ml de AI foi realizada. Em relação ao grupo de controlo, 10 ug /ml de AI sozinho produziu quase nenhum efeito sobre o ciclo celular. No entanto, o grupo combinado da UA e irradiação induzida paragem do ciclo celular no G _{1 fase (51,87% VS 60,28%, p = 0,13) eo G 2 /M fase (3,14% VS 13,67%, p < 0,01) em comparação com o grupo de 2 Gy de irradiação (Figura 3A e 3C). Estes resultados sugerem que o tratamento combinado pode ter causado G 1 fase e G 2 /M detenção fase, que era mais suscetíveis aos efeitos nocivos da radiação. As conclusões semelhantes a partir dos dados do ciclo celular tem sido comprovada por estudo anterior [15].}

A combinação de UA e irradiação também poderia causar a morte celular por apoptose mais como mostrado pela Fig 3B. A proporção de células em apoptose aumentada substancialmente pela aplicação de ambos UA e irradiação em BGC-823 células, em oposição a UC ou IR tratamento sozinho. (78,2% versus 9,6% e 12,5%, p < 0,01, figura 3D)

UA aumentou RT induzida a formação de ROS

é amplamente aceito que a morte celular após a exposição à radiação ionizante, é parcialmente mediada por ROS. [16] a análise ROS usando DCF-dA produzida a intensidade de fluorescência média (IFM), que representado ROS nível intracelular de cada grupo (Fig 4A e 4B). IFM da UA grupo sozinho, só grupo RT e grupo UA + RT aumentou em 1,15 vezes, 1,53 vezes e 2,09 vezes em comparação com o grupo controle. O nível de ROS do grupo combinação aumentou significativamente em relação ao grupo sozinho RT, revelando que a adição UA para RT induzida mais formação de ROS que sozinho RT.

coloração imuno-histoquímica de Ki-67

Ki -67 foi conhecido como um antígeno nuclear, que muitas vezes está correlacionado com a proliferação celular. A nossa experiência detectada a taxa positiva de proteína Ki-67 por coloração imuno-histoquímica, e os resultados foram ilustrados na Figura 5. Percentagem de Ki-67 de células positivas para o grupo combinado diminuiu significativamente em comparação com o grupo de controlo, bem como o grupo de terapia de radiação .

Discussão

Esta pesquisa analisou os efeitos e possível mecanismo de UA como radiossensibilizador. O ensaio de MTT e ensaio de sobrevivência clonogénica demonstrado que a radiação ionizante combinado com UC foi superior em citotoxicidade do que sozinho IR. Este efeito foi observado em ambos os grupos com diferentes concentrações sub-citotoxicidade da UA, 6.25ug /ml e 10 ug /ml. Nesta dose, UA teve ligeira citotoxicidade para gástrica linha de células de adenocarcinoma humano BGC823 e não têm citotoxicidade significativa para a linha celular gástrica normal. [17] Isto demonstrou que UA foi uma radiossensibilização promissora in vitro
.

Central à radioterapia do cancro é maximizar a eficácia terapêutica para o tecido do tumor, enquanto minimizando os danos para os tecidos normais. Enquanto o planejamento elaborado e técnicas físicas recentes pode com segurança aumentar a dose de radiação para o tecido do tumor, reduzindo a dose nos tecidos normais circundantes, [18] técnicas de radioterapia atuais ainda não pode evitar ferir os tecidos vizinhos normais. Radioterapêutico benefício adicional pode ser encontrada através da análise da resposta biológica do microambiente do tumor para descobrir como para aumentar a sensibilidade de um tumor à radiação ou inibir os efeitos colaterais por radiação. [19]

tecidos normais ao redor de cancro gástrico, tais como intestinal e gástrica, são sensíveis à radiação ionizante. Como resultado, a dose de radiação ionizante no sentido de tecido de tumor deve ser restrito. Além disso, os efeitos secundários de radiação ionizante sobrepostas irá aumentar os efeitos colaterais da radioterapia, e até mesmo interromper o tratamento. concentração sub-citotoxicidade de UA combinada com radiação ionizante, no entanto, podem aumentar a citotoxicidade de radiação ionizante, enquanto a baixa concentração de UC é quase inofensivo para os tecidos normais. Esta estratégia pode aumentar o índice terapêutico de tecido de tumor sem aumentar a dose de radiação e efeito colateral radioterapêutico.

Para identificar o mecanismo de radiossensibilização de AI, foi realizada a análise de múltiplos passos. Em primeiro lugar, analisamos a distribuição do ciclo celular. concentração do Sub-citotoxicidade da UA não deu qualquer efeito significativo sobre o ciclo celular, enquanto que compara com radiação ionizante só, o tratamento combinado reforçada G _{2 /M detenção. A radiossensibilidade de células está correlacionada com a do ciclo celular, e a correlação é mais elevada no G 2 /H de fase e inferior em fase S. Este pode ser o motivo subjacente mais importante para a radiossensibilizaçào melhorada observada neste estudo. Em segundo lugar, foram analisados ​​os níveis de ROS intracelulares. O nível de ROS do grupo combinação aumentou significativamente em comparação com o grupo controle, o grupo sozinho UA, ou até mesmo o grupo de radiação ionizante. A adição de UA a radiações ionizantes induzida mais formação de ROS. A radiação ionizante induziu a radiólise da água, o que gerou ERO, tais como os radicais hidroxilo e superóxido. Estas moléculas ROS desempenhou um papel importante nas lesões celulares induzidos por radiação, tais como dano oxidativo ao DNA ionizante, levando potencialmente a tanto a morte clonogênica e apoptose. Em terceiro lugar, neste estudo, descobrimos que percentagem de Ki-67 células positivas do grupo combinação diminuiu significativamente em comparação com o grupo controle ou o grupo de terapia de radiação. Ki-67 é conhecida como um antigénio associado do ciclo celular e um marcador de proliferação útil. nível de proteína Ki-67 está correlacionado com maior capacidade de proliferação e metástases. [20,21]}

Em conclusão, o presente estudo é a primeira tentativa de demonstrar que UA poderia sinergia com radiação ionizante contra linhas celulares de cancro gástrico humano . O mecanismo subjacente a eficácia de radiossensibilização melhorada pode ser o reforçada G2 /M de captura, aumentada de ROS e regulada para baixo nível de Ki-67. Colectivamente, como demonstrado UA efeito antiproliferação e potente efeito sinergético, que poderia ser utilizado como um sensibilizador de droga potencial para a aplicação de radioterapia. No entanto, é sem dúvida que é necessária mais investigação para avaliar a viabilidade e os benefícios do uso de medicina tradicional chinesa como radiosensitizers antes aplicações clínicas reais. Mais experiências e repetições são necessários em outros tipos de tumores e em ensaios com animais, a fim de confirmar a eficácia da estratégia proposta.

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