PLoS ONE: Verhoging van de gevolgen van straling door Ursolzuur in BGC-823 Human Darmkanker Gastric Cancer Cell Line

Samenvatting

Recent onderzoek heeft gesuggereerd dat bepaalde plantaardige polyfenolen, dwz ursolinezuur (UA), die naar verluidt antitumor activiteiten, kunnen worden gebruikt om tumorcellen voor bestraling gevoelig door remming trajecten waardoor bestralingstherapie weerstand. Dit experiment werd ontworpen om de effecten en mogelijk mechanisme van radiosensitisatie door UA in BGC-823 cellijn uit menselijke adenocarcinoom maagkanker onderzoeken In vitro
. UA veroorzaakte cytotoxiciteit op een dosisafhankelijke wijze, en we gebruikten een sub-cytotoxiciteit concentratie UA radioenhancement werkzaamheid UA testen bij maagkanker. Stralingsgevoeligheid bepaald door klonale overleving assay. Overlevende fractie van de gecombineerde groep met bestraling en sub-cytotoxiciteit UA aanzienlijk gedaald ten opzichte van de bestraling groep. De verbeterde radiosensitisering werkzaamheid werd geassocieerd met een verbeterde G2 /M arrestatie, toegenomen reactive oxygen species (ROS), down-gereguleerd Ki-67 niveau en verbeterde apoptose. Tot slot, zoals getoond UA krachtige antiproliferatie effect en synergistisch effect, kan worden gebruikt als een potentieel geneesmiddel sensibilisator voor de toepassing van radiotherapie

Citation:. Yang Y, M Jiang, Hu J, Lv X, Yu L Qian X, et al. (2015) Verbetering van de Radiation Effects door Ursolzuur in BGC-823 Human Darmkanker Gastric Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169

Editor: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, Universiteit van Californië, Berkeley, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 26 januari 2015; Aanvaard: 24 juni 2015; Gepubliceerd: 15 juli 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81172094), Top Zes talents-project van de provincie Jiangsu (Grant No. 2011ws005), en de medische wetenschap en technologie ontwikkeling Projecten van Nanjing (Grant No. ZKX10011). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Ondanks een daling van de incidentie, is maagkanker nog steeds beschouwd als een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Chirurgie blijft de steunpilaar van elke curatieve behandeling; echter ongeveer tweederde van de patiënten met maagkanker hebben inoperabele lokaal gevorderde en /of metastatische ziekte. De 5-jaarsoverleving van de patiënten die met geavanceerde locoregionale maagkanker werden gediagnosticeerd en curatieve resectie hebben ondergaan laag blijven als gevolg van het hoge risico op een lokaal recidief of metastasen op afstand, zelfs als resectie werd verondersteld curatief te zijn. [1] Een perspectief gerandomiseerde Intergroup (s) -0116 trial (556 patiënten) en retrospectief Koreaanse ervaring (990 patiënten) vertoonden een daling van lokaal recidief tarief met postoperatieve regionale straling in combinatie met chemotherapie en een hogere overlevingskans in de adjuvante arm. [2] Radiotherapie is de main loco-regionale controle modaliteit voor inoperabele maagkanker [3] De National Comprehensive Cancer Network (NCCN) richtlijnen bevelen radiotherapie als een standaard behandeling voor maagkanker patiënten met een hoog risico van herhaling.; [4] Er zijn echter twee belangrijke behorende bij de behandeling van maagkanker met straling: (1) intrinsiek of verworven resistentie tegen radiotherapie; (2) niet-specifieke toxiciteit richting maagslijmvlies en omringende normale weefsels. [2,5]

Om deze beperkingen te pakken, zijn wetenschappelijke pogingen ondernomen om te zoeken naar een effectieve Stralingssensibilisator van kruiden met lagere toxiciteit en hogere werkzaamheid. Recent onderzoek heeft aangetoond dat veel plantaardige polyfenolen, waaronder curcumine, flavopiridol, emodine ursolinezuur en etc, kunnen worden gebruikt om tumorcellen aan chemotherapeutica en bestraling sensibiliseren door remming van de routes die leiden tot resistentie tegen behandeling. [6,7, 8] Deze middelen zijn ook gevonden afdekplaatje van therapie geassocieerde toxiciteit te zijn. [5] Ursolinezuur (UA), een pentacyclisch triterpeen zuur, dat wordt beschouwd als een van de meest veelbelovende chemopreventieve middel voor kanker, is aangetoond antitumor prompt activiteiten, zoals het remmen van de tumor initiatie en promotie. [9,10] ook veroorzaakte tumorcel differentiatie door regulatie van de expressie van differentiatie-specifieke genen in muizen F9 teratocarcinoomcellen. [11] Daarnaast is er bewijs dat aantoont dat de UA geproduceerd een anti-angiogene werking in kuiken chorioalantoic membraan en anti-invasieve werking in menselijke fibrosarcoom HT1080 cellen. [12,13]

voorafgaand onderzoek moet nog blijken of de UA stralingseffecten in maligne neoplasma kan verbeteren . Het experiment werd ontworpen om de effecten en mogelijke mechanisme van radiosensitisatie vitro door UA in BGC-823 cellijn van menselijke adenocarcinoom maagkanker onderzoeken om de theoretische ondersteuning voor de klinische gebruik ervan.

Materialen en werkwijzen

Celkweek

BGC-823-cellen werden verkregen van Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, China) en bewaard in RPMI 1640 medium met 10% kalfsserum runderserum bij 37 ° C in een met water verzadigde atmosfeer met 5% CO _2.

Cel cytotoxiciteit assay

De cytotoxiciteit werd bepaald door MTT-bepaling uitgevoerd een eerder gepubliceerd. [14] Ter illustratie, de cellen werden met 8 x 10 ^{3 cellen per putje in 96 putjes platen en een nacht hechten. Daarna werden de cellen behandeld met verschillende concentraties UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) gedurende 48 uur in minimaal drie herhalingsputjes. Elk putje werd vervolgens toegevoegd 20ul MTT, bereid door 5 mg MTT met 1 ml fysiologische zoutoplossing, en gedurende nog eens 4 uur. Medium in elk putje werd vervangen door 150ul DMSO. De absorptie werd bepaald met een microplaat reader (BIP-RAD) bij 490 nm. De blanco controleputjes werden voor nulstelling absorptie. Het percentage remming (IR%) werd berekend met de achtergrond gecorrigeerde absorptie door de volgende vergelijking:.}

De IC _{50 werd gedefinieerd als de concentratie vereist voor 50% remming van de celgroei}

Cell groeperen en in vitro ioniserende straling

De cellen werden willekeurig verdeeld in 4 groepen: controle groep (A), UA groep (B), bestralingstherapie (RT) (C), en gecombineerde groep (D ). BGC-823 cellen werden gekweekt in 6-puts platen en vervolgens groep B en D werden behandeld met UA, terwijl groep C en D werden bestraald onder toepassing van een 6-MeV elektronenbundel lineaire versneller (Elekta, Zweden).

klonale overleving assay

stralingsgevoeligheid bepaald door klonale overleving assay. Cellen (500-2000 per putje) werden uitgeplaat in 6-well platen en overnacht hechten. Daarna werden cellen behandeld met UA (0, 6,25 en 10 ig /ml) gedurende 24 uur en vervolgens blootgesteld aan toenemende doses RT (0, 2, 4, 6 en 8Gy). Na 10-14 dagen incubatie kolonies bestonden uit meer dan 50 cellen waargenomen. De kolonies werden zorgvuldig gewassen, gekleurd met ethanol /kristalviolet kleurstof, en vervolgens geteld. De beplating efficiëntie (PE) werd berekend als (gemiddelde kiemgetal /cellen gezaaid), en overlevende fractie (SF) werd berekend als [bedoel kiemgetal /(cellen gezaaid × PE)], waarbij PE werd gedefinieerd als (gemiddelde kolonie telt voor un-bestraalde controles /cellen gezaaid). D _{0 waarden werden berekend door een multi-target single-hit model [S = 1 - (1-e ^{D /D0) N], waarin de gemiddelde dosis van een dodelijke blootstelling vertegenwoordigd. Sensibilisator enhancement ratio (SER) werd berekend als D 0 verhouding tussen combinatiebehandeling en RT alleen.}}

Cell cycle analysis

De invloed van de celcyclus werd geanalyseerd met behulp van propidiumjodide /RNase buffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) kleuring volgens de instructies van de fabrikant. 2,5 x 10 ^{5 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen en overnacht hechten. Vervolgens werden de cellen behandeld met UA (0 en 10 ig /ml) gedurende 24 uur en vervolgens blootgesteld aan RT (0 en 2GY) gedurende 48 uur. Cellen werden verzameld door trypsinisatie, in 70% ethanol gefixeerd bij -20 ° C in PBS gewassen, opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS dat 1 mg /ml RNAse en 50 ug /ml propidiumjodide, geïncubeerd in het donker gedurende 30 min bij 37 ° C, en geanalyseerd door flow cytometrie (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).}

Meting van apoptose

cellen kwantificering van apoptose cellen werd geëvalueerd met behulp van een annexine-V-FITC apoptose Detectie Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. 2,5 x 10 ^{5 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen en overnacht hechten. Vervolgens werden de cellen behandeld met UA (0 en 10 ig /ml) gedurende 24 uur en vervolgens blootgesteld aan RT (0 en 2GY) gedurende 48 uur. De cellen werden verzameld door behandeling met trypsine en opnieuw gesuspendeerd in 500 ui bindingsbuffer en 5 ul van annexine-V-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), en vervolgens, 5 ul propidiumjodide (PI) toegevoegd. Analyses werden uitgevoerd met flowcytometrie.}

Detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) generation

De concentratie van intracellulair ROS werden gedetecteerd met de membraan-permeabele fluorescerende probes 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetaat (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, China) volgens de instructies van de fabrikant. 1 x 10 ^{6 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen en overnacht hechten. Vervolgens werden de cellen behandeld met UA (0 en 10 ig /ml) gedurende 24 uur en vervolgens blootgesteld aan RT (0 en 2GY) gedurende 48 uur. De cellen werden verzameld door behandeling met trypsine, geresuspendeerd DCFH-DA 30 min gewassen met serumvrij RPMI 1640 en vervolgens gedetecteerd met flow cytometrie. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) vertegenwoordigd intracellulaire ROS-niveau.}

Immunohistochemische kleuring voor het beoordelen van Ki-67 expressie

Ki-67-eiwit expressie werd geëvalueerd door de avidine-biotine complex immunohistochemische (ZSGB-BIO , Beijing, China) volgens de instructies van de fabrikant. 2 × 10 ^{4 cellen werden uitgeplaat in 6-well platen met een dekglas voor elk putje en liet men een nacht hechten. Daarna werden cellen behandeld met UA (0 en 10 ig /ml) gedurende 24 uur en vervolgens blootgesteld aan RT (0 en 2GY) gedurende 24 uur. Dan de dekglaasjes werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, geïncubeerd met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 min in PBS gewassen en geïncubeerd met 3% H _{2O 2 15 min. Na spoelen met PBS driemaal, werden cellen die zijn bevestigd aan de dekglaasjes geïncubeerd met Ki-67 monoklonale antilichamen 60 min bij 37 ° C, en vervolgens in PBS gewassen weer. Biotine-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 20 min bij 20-37 ° C, gewassen met PBS vier maal, vervolgens gekleurd met DAB Staining Kit, gewassen met water en vervolgens tegengekleurd met hematoxyline.}}

Statistische analyse

De gegevens werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD en gemiddelde vergelijkingen werden uitgevoerd door ANOVA. P < 0,05 werd als statistisch significant aanvaard. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS, v. 17.0.

Resultaten

cytotoxische effecten van UA op BGC-823 cellen

De cytotoxische effecten van UA op BGC-823 cellen geëvalueerd op basis van de MTT-bepaling. We vonden dat UA dosis-afhankelijk de cytotoxiciteit in maagkanker cellijn BGC-823 (Figuur 1). De half-maximale remmende concentratie (IC _{50) waarden voor BGC-823 was 17.5ug /ml. Geringe cytotoxiciteit (< 15%) van de UA BGC-823, 10 ig /ml, werd gebruikt voor daaropvolgende experimenten gepland, om te controleren voor de radioenhancement door een direct cytotoxisch effect}

De radiosensitisering effecten van UA. vitro

de celoverleving curves gemeten klonale overleving assay zijn geïllustreerd in figuur 2. in vergelijking met RT alleen, SF _{2 RT gecombineerd met UA significant afgenomen BGC-823 cellen, SER waarden van de gecombineerde groepen was 1,180 keer en 1,315 maal. Deze resultaten gaven aan dat UA versterkte straling effect van BGC-823 in een dosis-afhankelijke wijze bij een geringe cytotoxiciteit concentraties.}

celcyclusverdeling en inductie van apoptose.

Onderzoeken of RT en /of UA behandeling konden geen verstoring van de celcyclus, een analyse van BGC-823 cellen behandeld met 2GY bestraling en /of veroorzaken 10ug /ml UA uitgevoerd. Ten opzichte van de controlegroep, 10 ig /ml UA alleen gaf vrijwel geen effect op de celcyclus. Echter, de gecombineerde groep van de UA en bestraling geïnduceerde celcyclus bij de G _{1 fase (51,87% vs 60,28%, p = 0,13) en de G 2 /M fase (3,14% vs 13,67%, p <0,01) ten opzichte van de bestraling 2GY groep (figuur 3A en 3C). Deze bevindingen suggereren dat de combinatiebehandeling kan hebben veroorzaakt G 1 fase en G 2 /M fase, die gevoeliger zijn voor de schadelijke effecten van straling was. Soortgelijke conclusies van de celcyclus gegevens bewezen door eerdere studie. [15]}

De combinatie van bestraling en UA kan ook apoptotische celdood veroorzaakt zoals getoond in Fig 3B. Het aandeel van de apoptotische cellen aanzienlijk verhoogd door de toepassing van zowel de UA en bestraling in BGC-823 cellen in tegenstelling tot UA of IR-behandeling alleen. (78,2% vs 9,6% en 12,5%, p < 0,01, figuur 3D)

UA toegenomen RT-geïnduceerde ROS vorming

het is algemeen aanvaard dat het doden van cellen na blootstelling aan ioniserende straling wordt gedeeltelijk gemedieerd door ROS. [16] ROS analyse met behulp van DCF-DA produceerde de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI), die vertegenwoordigd intracellulair ROS niveau van elke groep (figuur 4A en 4B). MFI's van de UA groep die uitsluitend, RT alleen groep en UA + RT groep steeg met 1,15-voudig, 1,53 maal en 2,09-voudig in vergelijking met de controlegroep. Het niveau van de ROS van de combinatiegroep aanzienlijk toegenomen ten opzichte van de RT alleen groep, waaruit blijkt dat het toevoegen van UA naar RT meer ROS vorming geïnduceerd dan RT alleen.

Immunohistochemische kleuring van Ki-67

Ki -67 werd bekend als nucleair antigen, die vaak correleert met celproliferatie. Ons experiment gedetecteerd de positieve verhouding van Ki-67 eiwit door immunohistochemische kleuring en de resultaten zijn weergegeven in figuur 5. Percentage van Ki-67 positieve cellen van de gecombineerde groep gedaald vergeleken met de controlegroep en de groep radiotherapie .

Discussie

Dit onderzoek onderzocht de effecten en de mogelijke mechanisme van de UA als radiosensitizer. De MTT assay en klonale overleving assay toonde dat in combinatie met IR UA was superieur in cytotoxiciteit dan IR alleen. Dit effect werd waargenomen in beide groepen met verschillende sub-cytotoxiciteit concentraties UA, 6.25ug /ml en 10ug /ml. Bij deze dosis UA had lichte cytotoxiciteit voor de menselijke adenocarcinoom maagkanker cellijn BGC823 en geen significante cytotoxiciteit voor normale maag cellijn niet. [17] Dit toonde aan dat UA was een veelbelovende radiosensitisatie In vitro
.

Centraal kanker radiotherapie maximale therapeutische werking tumorweefsel, terwijl het minimaliseren van de schade aan normale weefsels. Terwijl de uitgewerkte plannen en recente fysische technieken veilig de stralingsdosis kan oplopen tot tumorweefsel, terwijl het verminderen van de dosis aan omringende normale weefsels, [18] huidige radiotherapie technieken nog steeds niet kan voorkomen dat verwonden nabijgelegen normale weefsels. Verdere radiotherapeutische voordeel kan worden gevonden door het onderzoeken van de biologische reactie van de tumor micro-omgeving te ontdekken hoe de gevoeligheid van een tumor te verhogen straling of neveneffecten remmen door bestraling. [19]

Normale weefsels rond maagkanker, zoals intestinale en maag, zijn gevoelig voor ioniserende straling. Dientengevolge moet de dosis ioniserende straling aan tumorweefsel beperkt. Bovendien zal de overlappende bijwerkingen van ioniserende straling radiotherapie bijwerkingen verbeteren, en zelfs de behandeling te onderbreken. Sub-cytotoxiciteit concentratie UA combinatie met ioniserende straling kan echter de cytotoxiciteit te verhogen door ioniserende straling, terwijl lage concentratie UA vrijwel onschadelijk voor normale weefsels. Deze strategie kan de therapeutische index tumorweefsel zonder verhoging stralingsdosis en radiotherapeutische bijwerking verhogen.

Om het mechanisme van radiosensitisatie van UA identificeren, voerden we functies van meerdere stappen. Eerst analyseerden we de celcyclusverdeling. Sub-cytotoxiciteit concentratie van UA leverde geen significant effect op de celcyclus opleveren, terwijl vergelijken met ioniserende straling alleen, de gecombineerde behandeling verbeterde G _{2 /M arrestatie. De gevoeligheid van de cellen is gecorreleerd celcyclus en de correlatie hoger de G 2 /M fase en lager in de S-fase. Dit kan de belangrijkste onderliggende oorzaak van de verbeterde radiosensitisatie waargenomen in deze studie. Ten tweede, analyseerden we de intracellulaire ROS levels. ROS niveau van de combinatiegroep significant toegenomen in vergelijking met de controlegroep, de groep UA alleen, of zelfs de ioniserende straling groep. De toevoeging van de UA aan ioniserende straling veroorzaakte meer ROS vorming. Ioniserende straling geïnduceerde radiolyse het water, dat ROS geproduceerd, zoals hydroxyl radicalen en superoxide. Deze ROS moleculen een belangrijke rol gespeeld bij ioniserende straling geïnduceerde cellulaire lesies, zoals oxidatieve DNA schade kan leiden tot zowel klonogene dood en apoptose. Ten derde, in deze studie bleek dat het percentage van Ki-67 positieve cellen van de combinatiegroep gedaald vergeleken met de controlegroep of bestralingstherapie groep. Ki-67 is bekend als een celcyclus geassocieerde antigen en een nuttige proliferatie merker. Ki-67 eiwitgehalte is gecorreleerd met een hogere proliferatie en uitzaaiingen vermogen. [20,21]}

Tot slot, de huidige studie is de eerste poging om aan te tonen dat de UA kan synergie met ioniserende straling tegen menselijke maagkanker cellijnen . Het onderliggende mechanisme van de verbeterde radiosensitisatie werkzaamheid kan de verbeterde G2 /M arrestatie zijn toegenomen ROS en down-gereguleerd Ki-67-niveau. Collectief, als UA aangetoond krachtige antiproliferatie effect en synergistisch effect, kan worden gebruikt als een potentieel geneesmiddel sensibilisator voor de toepassing van radiotherapie. Echter, het is zonder twijfel dat verder onderzoek nodig is om de haalbaarheid en de voordelen van het gebruik van de traditionele Chinese geneeskunde als radiosensitizers voordat de werkelijke klinische toepassingen te evalueren. Meer experimenten en replicaties nodig in andere tumorsoorten en dierproeven teneinde de doeltreffendheid van de voorgestelde strategie bevestigen.

• PLoS ONE: MicroRNA-206: Effectieve Remming van maagkanker Progression door de c-Met Pathway
• PLoS ONE: Klinische betekenis van MLH1 methylatie en CpG Island methylator fenotype als prognostische merkers bij patiënten met Gastric Cancer