PLoS ONE: Forstærkning af Stråling Effekter af Ursolic Syre i BGC-823 human adenocarcinom mavekræft cellelinje

abstrakt

Nyere forskning har antydet, at visse planteafledte polyphenoler, dvs. ursolsyre (UA), som er rapporteret at have antitumorvirkning, kan anvendes til at sensibilisere tumorceller til strålebehandling ved at hæmme pathways fører til stråleterapi modstand. Dette forsøg blev designet til at undersøge virkningerne og mulig mekanisme af strålingssensibilisering af UA i BGC-823 cellelinje fra menneskelig adenocarcinom mavekræft in vitro
. UA forårsaget cytotoksicitet på en dosis-afhængig måde, og vi anvendte en sub-cytotoksicitet koncentration på UA at teste radioenhancement effekt med UA i gastrisk cancer. Radiosensitivitet blev bestemt ved klonogene overlevelse assay. Overlevende brøkdel af den kombinerede gruppe med bestråling og sub-cytotoksicitet UA betydeligt faldt sammenlignet med bestråling gruppen. Den forbedrede radiosensibilisering Effekten var forbundet med forøget G2 /M anholdelse, øget reaktive ilt arter (ROS), nedreguleret Ki-67-niveau og forbedret apoptose. Det konkluderes, som UA demonstreret potent antiproliferative virkning og synergistisk virkning, den kunne anvendes som et potentielt lægemiddel sensibilisator for anvendelsen af ​​strålebehandling

Henvisning:. Yang Y, Jiang M, Hu J, Lv X, Yu L , Qian X, et al. (2015) Forstærkning af Radiation Effects ved Ursolic Syre i BGC-823 human adenocarcinom mavekræft Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10,1371 /journal.pone.0133169

Redaktør: Jian-Hua Mao, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, USA

Modtaget: Januar 26, 2015; Accepteret: Juni 24, 2015; Udgivet: 15 Juli 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.172.094), Top Seks Talents Projekt af Jiangsu-provinsen (Grant nr 2011ws005), og Medicinsk Videnskab og Teknologi Udviklingsprojekter af Nanjing (Grant nr ZKX10011). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af et fald i forekomsten, er mavekræft stadig betragtes som en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Kirurgi er fortsat grundpillen i enhver helbredende behandling; imidlertid ca. to tredjedele af patienter diagnosticeret med mavekræft har inoperabel lokalt fremskreden og /eller metastatisk sygdom. Det 5-års overlevelsesraten for patienter, der blev diagnosticeret med fremskreden loco-regional mavekræft og har gennemgået helbredende resektion forblive lav på grund af den høje risiko for lokalt recidiv eller fjernmetastaser selvom resektion blev menes at være helbredende. [1] Et perspektiv randomiseret Intergroup (INT) -0116 forsøg (556 patienter) og retrospektiv koreanske erfaring (990 patienter) viste en reduktion i lokalt recidiv rate med postoperativ regional stråling kombineret med kemoterapi og en højere overlevelsesrate i adjuverende arm. [2] strålebehandling er vigtigste loco-regional kontrol modalitet for inoperabel mavekræft [3] The National Comprehensive cancer Network (NCCN) retningslinjer anbefaler strålebehandling som en standard behandling for mavecancerpatienter med en høj risiko for tilbagefald.; [4] Der er dog to store begrænsninger forbundet med behandling af gastrisk cancer med stråling: (1) iboende eller erhvervet resistens mod strålebehandling; (2) uspecifik toksicitet over maveslimhinden og omgivende normale væv. [2,5]

For at løse disse begrænsninger, er blevet gjort videnskabelige forsøg på at søge efter en effektiv strålingssensibilisator fra urter med lavere toksicitet og højere effektivitet. Nyere forskning har antydet, at mange planteafledte polyphenoler, herunder curcumin, flavopiridol, emodin, ursolsyre og lignende, kan anvendes til at sensibilisere tumorceller til kemoterapeutiske midler og strålebehandling ved at hæmme vejene til behandling resistens. [6,7, 8] Disse midler er også blevet fundet at være beskyttende fra terapi-associerede toksiciteter. [5] Ursolic acid (UA), et pentacyklisk triterpen syre, hvilket betragtes som en af ​​de mest lovende kemoforebyggende middel til cancer, er blevet vist at tilskynde antitumor aktiviteter, herunder hæmme tumor initiering og promotion. [9,10] det er også induceret tumorceller differentiering ved regulering af ekspressionen af ​​differentiering-specifikke gener i mus F9 teratocarcinomaceller celler. [11] desuden har der været dokumentation for, at UA produceret en antiangiogen effekt i chick chorioalantoic membran og en anti-invasiv aktivitet i HT1080 humane fibrosarcomceller. [12,13]

Men tidligere forskning har endnu ikke vise, om UA kan forstærke stråling effekter i malign neoplasma . Forsøget blev designet til at udforske de effekter og mulig mekanisme in vitro af strålingssensibilisering af UA i BGC-823 cellelinje fra humant adenokarcinom mavekræft at give den teoretiske støtte til den kliniske anvendelse.

Materialer og metoder

Cellekultur

BGC-823 celler blev opnået fra Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina) og opbevaret i RPMI 1640 medium med 10% kalv bovint serum ved 37 ° C i en vandmættet atmosfære med 5% CO _2.

Cell cytotoksicitet assay

cytotoksicitet blev bestemt ved MTT-analysen udføres en offentliggjort tidligere. [14] For at illustrere, celler blev udsået på 8 × 10 ^{3 celler pr brønd i 96-brønds plader og fastgøres natten. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 ug /ml) i 48 timer i mindst tre replikere brønde. Hver brønd blev derefter tilsat 20 pi MTT, fremstillet ved at blande 5 mg MTT med 1 ml normalt saltvand og inkuberet i yderligere 4 timer. Medium i hver brønd blev erstattet med 150ul DMSO. Absorbans blev bestemt med en mikropladelæser (BIP-RAD) ved 490 nm. Blindprøvekontrollen brønde blev brugt til nulstilling absorbans. Inhiberingshastigheden (IR%) blev beregnet ved anvendelse baggrunden-korrigerede absorbans ved følgende ligning:.}

IC _{50 blev defineret som den koncentration, der kræves til 50% inhibering af cellevækst}

Cell gruppering og in vitro ioniserende stråling

Celler blev tilfældigt opdelt i 4 grupper: kontrolgruppe (A), UA-gruppe (B), strålebehandling (RT) gruppe (C), og kombinerede gruppe (D ). De BGC-823-celler blev dyrket i plader med 6 brønde, og derefter Gruppe B og D blev behandlet med UA, mens gruppe C og D blev bestrålet under anvendelse af en 6-MeV elektronstråle lineær accelerator (Elekta, Sverige).

klonogen overlevelse assay

radiosensitivitet blev bestemt ved klonogene overlevelse assay. Celler (500-2000 per brønd) blev udpladet i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Derefter blev cellerne behandlet med UA (0, 6,25 og 10 ug /ml) i 24 timer og derefter udsat for stigende doser af RT (0, 2, 4, 6 og 8Gy). Efter 10-14 dages inkubation kolonier bestod af mere end 50 celler blev observeret. Kolonierne blev vasket omhyggeligt, farvet med ethanol /krystalviolet farvestof, og derefter talt. Den plating effektivitet (PE) blev beregnet som (middel kolonitællinger /celler seedet), og overlevende fraktion (SF) blev beregnet som [betyde kolonitællinger /(celler podet × PE)], hvor PE blev defineret som (betyder koloni tæller for un-bestrålede kontroller /celler udsåede). D _{0 værdier blev beregnet ved en multi-target single-hit model [S = 1 - (1-e ^{-D /D0) N], som repræsenterede den gennemsnitlige dosis af en dødelig eksponering. Sensibiliserende stof enhancement ratio (SER) blev beregnet som D 0 forholdet mellem kombinationsbehandling og RT alene.}}

Cell cyklus analyse

indflydelse cellecyklus blev analyseret ved hjælp af propidiumiodid /RNase buffer (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) farvning ifølge producentens anvisninger. 2,5 × 10 ^{5-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Derefter blev celler behandlet med UA (0 og 10 ug /ml) i 24 timer og derefter udsat for RT (0 og 2Gy) i 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved trypsinering, fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C, vasket i PBS, resuspenderet i 1 ml PBS indeholdende 1 mg /ml RNase og 50 ug /ml propidiumiodid, inkuberet i mørke i 30 minutter ved 37 ° C, og analyseret ved flowcytometri (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).}

Måling af apoptose

celler kvantificering af apoptose celler blev evalueret under anvendelse af et Annexin-V-FITC apoptose Detektion Kit (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. 2,5 × 10 ^{5-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Derefter blev celler behandlet med UA (0 og 10 ug /ml) i 24 timer og derefter udsat for RT (0 og 2Gy) i 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved trypsinering og resuspenderet i 500ul bindingsbuffer, og 5 pi af Annexin-V-fluorescein (FITC), og derefter, 5 pi af propidiumiodid (PI) blev tilsat. Analyser blev udført med en flowcytometri.}

Påvisning af reaktive oxygenarter (ROS) generation

Koncentrationerne af intracellulær ROS blev påvist under anvendelse af membran-permeable fluorescerende prober 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. 1 × 10 ^{6-celler blev udpladet i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Derefter blev celler behandlet med UA (0 og 10 ug /ml) i 24 timer, og derefter udsat for RT (0 og 2Gy) i 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved trypsinbehandling, resuspenderet DCFH-DA i 30 minutter, vasket ved serumfrit RPMI 1640, og detekteres derefter ved flowcytometri. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) repræsenterede intracellulær ROS niveau.}

Immunohistokemisk farvning for vurdering Ki-67-ekspression

Ki-67-protein-ekspression blev vurderet ved avidin-biotin kompleks immunhistokemisk (ZSGB-BIO , Beijing, Kina) ifølge producentens instruktioner. 2 × 10 ^{4 celler blev udpladet i 6-brønds plader med en dækglas for hver brønd, og fik lov til at binde natten over. Derefter blev cellerne behandlet med UA (0 og 10 ug /ml) i 24 timer, og derefter udsat for RT (0 og 2Gy) i 24 timer. Derefter dækglassene blev fikseret i 4% paraformaldehyd, inkuberet med 0,5% Triton X-100 i 20 min, vasket i PBS og inkuberet med 3% H _{2O 2 for 15 min. Efter skylning med PBS i tre gange, blev celler, som blev fastgjort på dækglas inkuberet med Ki-67 monoklonale antistoffer for 60min ved 37 ° C og derefter vasket i PBS igen. Biotin-konjugeret sekundære antistoffer i 20 minutter ved 20-37 ° C, vaskes med PBS i fire gange, derefter farvet ved DAB Staining Kit, vaskes med vand, og derefter modfarvet med hæmatoxylin.}}

Statistisk analyse

dataene blev rapporteret som middelværdi ± SD, og ​​betyde sammenligninger blev udført ved envejs ANOVA. P < 0.05 blev accepteret som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS, v. 17.0.

Resultater

cytotoksiske virkninger af UA på BGC-823 celler

Den cytotoksiske effekt af UA på BGC-823 celler evalueret baseret på MTT-assayet. Vi fandt, at UA dosisafhængigt øget cytotoksicitet i det gastriske cancercellelinie BGC-823 (figur 1). Den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC _{50) værdier for BGC-823 var 17.5ug /ml. Let cytotoksicitet (< 15%) af UA for BGC-823, 10 ug /ml, blev anvendt til efterfølgende planlagte eksperimenter, for at styre for radioenhancement skyldes en direkte cytotoksisk virkning}

De strålingssensibilisering effekter af UA i. vitro

Cell overlevelseskurver målt ved klonogene overlevelse assay blev illustreret i figur 2. i forhold til RT kun, SF _{2 i RT kombineret med UA faldt betydeligt i BGC-823 celler, SER værdier af de kombinerede grupper var 1.180 gange og 1.315 gange. Disse resultater indikerede, at UA forøgede stråling effekt af BGC-823 i en dosisafhængig måde inden for et mindre cytotoksiske koncentrationer.}

cellecyklusfordeling og induktion af apoptose.

For at undersøge om RT og /eller UA behandling kan forårsage nogen forstyrrelse af cellecyklussen, en analyse af BGC-823 celler behandlet med 2Gy bestråling og /eller 10 ug /ml UA udførtes. I forhold til kontrolgruppen, 10 ug /ml UA alene gav næsten ingen virkning på cellecyklussen. Men den kombinerede gruppe af UA og bestråling induceret cellecyklusstop på G _{1 fase (51.87% VS 60,28%, p = 0,13) og G 2 /M-fase (3,14% VS 13,67%, p <0,01) sammenlignet med den 2Gy bestråling gruppen (fig 3A og 3C). Disse resultater tyder på, at kombinationsbehandlingen kan have forårsaget G 1 fase og G 2 /M-fasen anholdelse, som var mere modtagelige for de skadelige virkninger af stråling. De samme konklusioner fra cellecyklus data er blevet bevist af tidligere undersøgelse [15].}

Kombinationen af ​​UA og bestråling kan også forårsage mere apoptotisk celledød, som vist ved fig 3B. Andelen af ​​apoptotiske celler forøges væsentligt ved anvendelse af både UA og bestråling i BGC-823 celler i modsætning til UA eller IR behandling alene. (78,2% VS 9,6% og 12,5%, p < 0,01, figur 3D)

UA øget RT-induceret ROS dannelse

det er almindeligt accepteret, at celle drab efter udsættelse for ioniserende stråling er delvist medieret af ROS. [16] ROS analyse ved hjælp DCF-DA produceret den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI), som repræsenteret intracellulær ROS for hver gruppe (fig 4A og 4B). MFI'er UA alene gruppen, RT alene gruppen og UA + RT gruppe er steget med 1,15 gange, 1,53 gange og 2,09 gange sammenlignet med kontrolgruppen. Niveauet af ROS af kombinationen gruppen steget betydeligt i forhold til det alene RT gruppen, afslører, at tilføje UA til RT-induceret mere ROS-dannelse end RT alene.

immunhistokemisk farvning af Ki-67

Ki -67 var kendt som et nukleart antigen, som ofte korrelerer med celleproliferation. Vort eksperiment påvist positive rate af Ki-67-protein ved immunhistokemisk farvning, og resultaterne blev vist i fig 5. Procentdel af Ki-67 positive celler i den kombinerede gruppe faldt væsentligt i forhold til kontrolgruppen, samt stråleterapi gruppen .

diskussion

Denne forskning undersøgt virkningerne og mulig mekanisme for UA som strålingssensibilisator. MTT-assayet og klonogene overlevelse assay viste, at IR kombineret med UA var overlegne i cytotoksicitet end IR alene. Denne virkning blev observeret i begge grupper med forskellige sub-cytotoksiske koncentrationer af UA, 6.25ug /ml og 10 ug /ml. Ved denne dosis, UA havde svag cytotoksicitet til humant adenocarcinom gastrisk cancercellelinie BGC823 og havde ikke signifikant cytotoksicitet til normal gastrisk cellelinje. [17] Dette viste, at UA var en lovende strålingssensibilisering in vitro
.

Centralt for kræft strålebehandling er maksimering terapeutisk effektivitet til tumorvæv og samtidig minimere skade på normalt væv. Mens uddybet planlægning og seneste fysiske teknikker trygt kan øge dosis stråling til tumorvæv og samtidig reducere dosis til omgivende normale væv, [18] nuværende strålebehandling teknikker kan stadig ikke komme til skade nærliggende normale væv. Yderligere radioterapeutisk fordel kan findes ved at undersøge det biologiske respons af tumormikromiljøet at afdække hvordan man kan øge en tumor følsomhed over for stråling eller inhibere bivirkninger ved stråling. [19]

Normalt væv omkring mavekræft, såsom intestinal og gastrisk, er følsomme over for ioniserende stråling. Som følge heraf skal dosis ioniserende stråling i retning tumorvæv begrænses. Desuden vil de overlappede bivirkninger af ioniserende stråling forbedre strålebehandling bivirkninger, og endda afbryde behandlingen. Sub-cytotoksicitet koncentration af UA kombineret med ioniserende stråling, dog kan øge cytotoksicitet ved ioniserende stråling, mens lav koncentration UA ​​er næsten uskadelig for normale væv. Denne strategi kan øge det terapeutiske indeks til tumorvæv uden at øge strålingsdosis og radioterapeutisk bivirkning.

For at identificere den mekanisme af radiosensibilisering af UA, vi udførte analyser i flere trin. Først, vi analyserede fordelingen cellecyklus. Sub-cytotoksicitet koncentration af UA gav ikke nogen signifikant effekt på cellecyklus, mens sammenligne med ioniserende stråling alene, den kombinerede behandling forbedret G _{2 /M anholdelse. Den radiosensitivitet af celler er korreleret til cellecyklus, og korrelationen er højere i G 2 /M-fase og lavere i S-fase. Dette kan være den vigtigste underliggende årsag til den forøgede radiosensibilisering observeret i denne undersøgelse. For det andet, vi analyserede de intracellulære ROS-niveauer. ROS niveau af kombinationen gruppen signifikant forøget sammenlignet med kontrolgruppen, den alene UA gruppe eller endda den ioniserende stråling gruppen. Tilsætningen af ​​UA for ioniserende stråling inducerede mere ROS-dannelse. Ioniserende stråling inducerede radiolyse af vand, som genereres ROS, såsom hydroxylradikaler og superoxid. Disse ROS molekyler spiller en vigtig rolle i ioniserende stråling-induceret cellulære læsioner, såsom oxidativ DNA-skader, der kan føre til både klonogene død og apoptose. For det tredje, i denne undersøgelse fandt vi, at procentdelen af ​​Ki-67 positive celler af kombinationen gruppen faldt betydeligt sammenlignet med kontrolgruppen eller stråleterapi gruppen. Ki-67 er kendt som en cellecyklus-associeret antigen og en nyttig proliferationsmarkør. Ki-67 protein-niveau er korreleret med højere spredning og metastaser evne. [20,21]}

Som konklusion er den foreliggende undersøgelse er den første forsøg på at vise, at UA kunne synergieffekter med ioniserende stråling mod human gastrisk cancer cellelinjer . Den underliggende mekanisme i forbedrede strålingssensibilisering effekt kan være den forbedrede G2 /M anholdelse, øget ROS og nedreguleret Ki-67 niveau. Kollektivt, som UA demonstreret potent antiproliferative virkning og synergistisk virkning, den kunne anvendes som et potentielt lægemiddel sensibilisator for anvendelsen af ​​strålebehandling. Men det er uden tvivl, at der er behov for yderligere forskning for at vurdere mulighederne og fordelene ved at bruge traditionel kinesisk medicin som radiosensibilisatorer før egentlige kliniske anvendelser. er behov for flere eksperimenter og gentagelser ved andre tumorer og i dyreforsøg for at bekræfte effektiviteten af ​​den foreslåede strategi.

• PLoS ONE: MicroRNA-206: Effektiv Hæmning af gastrisk kræft Progression gennem c-Met Pathway
• PLoS ONE: kliniske betydning af MLH1 Methylering og CpG Island Methylator Fænotype som prognostiske markører i patienter med gastrisk Cancer