Введение
<р> Несмотря на снижение заболеваемости, рак желудка до сих пор считается одной из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире. Хирургия продолжает быть основой любого медицинского лечения; Тем не менее, примерно две трети пациентов с диагнозом рака желудка у неоперабельным местно-распространенным и /или метастатическим заболеванием. 5-летняя выживаемость пациентов, которые были диагностированы с продвинутой заменяющих-регионального рака желудка и прошли лечебный резекцию остаются низкими из-за высокого риска местного рецидива или отдаленных метастазов, даже если резекция считающихся целебной. [1] Перспектива рандомизированное Intergroup (INT) -0116 исследование (556 пациентов) и ретроспективный опыт Кореи (990 пациентов) показали снижение местной частоты рецидивов с послеоперационной регионального излучения в сочетании с химиотерапией и более высокий уровень выживаемости в группе адъювантной руки. [2] радиотерапии является главный локо-региональный контроль модальность для неоперабельным раком желудка [3] Национальная Всесторонний Онкологический сеть (NCCN) директивы рекомендуют лучевую терапию в качестве стандартного лечения больных раком желудка с высоким риском рецидива. [4] Тем не менее, существуют два основных ограничения, связанные с лечением рака желудка с излучением: (1) внутреннего или приобретенной резистентности к лучевой терапии; (2) неспецифический токсичность по отношению к слизистой оболочке желудка и окружающих нормальных тканей. [2,5]
<р> Для устранения этих ограничений, научные попытки были сделаны, чтобы найти эффективный радиосенсибилизатора из трав с более низкой токсичностью и высокой эффективностью. Недавние исследования показали, что многие полученные из растений, полифенолы, в том числе куркумин, флавопиридолом, эмодина, урсоловая кислота и т.д., могут быть использованы для информирования опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам и радиотерапии путем ингибирования пути, приводящие к резистентности к лечению. [6,7, 8] Эти агенты также были признаны защитный от терапии ассоциированных с токсичностью. [5] урсоловая кислота (UA), пентациклическим тритерпеновый кислота, которая считается одним из наиболее перспективных химиопрофилактического средства для лечения рака, было показано, подсказывать противоопухолевое деятельности, включая ингибирования инициации опухоли и продвижения по службе. [9,10] Он также индуцирует дифференцировку опухолевых клеток путем регуляции экспрессии дифференцировки специфических генов в клетках тератокарциномы мыши F9. [11] Кроме того, имеются свидетельства, что демонстрации UA производства антиангиогенного эффект в куриных chorioalantoic мембраны и анти-инвазивной активности в HT1080 клеток фибросаркомы человек. [12,13]
<р> Тем не менее, предварительное исследование еще предстоит продемонстрировать, может ли UA усилить воздействие радиации в злокачественное новообразование , Эксперимент был разработан, чтобы исследовать эффекты и возможный механизм в пробирке радиосенсибилизации на UA в клеточной линии КУП-823 от человеческой аденокарциномы рака желудка, чтобы обеспечить теоретическую поддержку клинического использования.
клеточной культуре
<р> BGC-823 клетки были получены из Шанхайского института клеточной биологии (Шанхай, Китай) и хранили в среде RPMI 1640 с 10% телячьей сыворотки теленка при 37 ° C в насыщенной водой атмосфере с 5% CO <югу> 2.
Cell цитотоксичности Cell группировка и в пробирке ионизирующей радиации клоногенности выживание клеточного цикла анализа Измерение апоптоза Цитотоксические эффекты UA на BGC-823 клеток радиосенсибилизации эффекты UA в. витро UA увеличился RT индуцируется образование активных форм кислорода Обсуждение в центре лучевой терапии рака является максимизация терапевтической эффективности в опухолевой ткани при минимизации повреждения нормальных тканей. В то время как планирование и уточненной в последнее время физические методы могут безопасно увеличить дозу облучения до опухолевой ткани при одновременном снижении дозы до окружающих нормальных тканей, [18] современные методы лучевой терапии до сих пор не могут избежать травм поблизости от нормальных тканей. Далее радиотерапевтические выгода может быть найдена путем изучения биологической реакции микросреды опухоли, чтобы выявить, как увеличить чувствительность опухоли к радиации или ингибировать побочные эффекты радиации. [19] Для того, чтобы определить механизм радиосенсибилизации из UA, мы провели анализ в несколько этапов. Во-первых, мы проанализировали распределение клеточного цикла. Концентрация Суб-цитотоксичность UA не дают никакого существенного влияния на клеточный цикл, в то время как сравнить с ионизирующим излучением в одиночку, комбинированное лечение расширенной G <суб> 2 /M арест. Радиочувствительности клеток коррелирует с клеточным циклом, а соотношение выше в G <югу> 2 /M фазе и ниже в фазе S. Это может быть самой важной основной причиной повышенной радиосенсибилизации наблюдаемого в данном исследовании. Во-вторых, мы проанализировали внутриклеточные уровни ROS. Уровень РОС комбинированной группе значительно увеличилась по сравнению с контрольной группой, в группе только UA, или даже группы ионизирующей радиации. Добавление UA ионизирующее индуцированное больше образования ROS. Ионизирующее излучение индуцированное радиолиза воды, которая генерируется ROS, такие как гидроксильные радикалы и супероксида. Эти молекулы ROS играют важную роль в ионизирующее излучение индуцированных клеточных повреждений, таких как окислительное повреждение ДНК, что может привести к смерти как клоногенном и апоптоза. В-третьих, в данном исследовании мы обнаружили, что процент Ki-67 позитивных клеток комбинированной группы уменьшалась значительно по сравнению с контрольной группой или группой лучевой терапии. Ki-67 известен как клеточного цикла, связанного антигена и использована в качестве маркера пролиферации. Ki-67 уровень белка коррелирует с более высокой пролиферации и метастазирования способности. [20,21]
<р> цитотоксичность определяли с помощью МТТ исполнила опубликованные ранее. [14] Для иллюстрации, клетки высевали при 8 × 10 3 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями UA (0, 5, 6,25, 10, 12,5, 20, 40, 50 мкг /мл) в течение 48 ч в количестве не менее трех реплицировать скважин. Затем каждую лунку добавили 20 мкл МТТ, получают путем смешивания 5 мг МТТ с 1мл физиологического раствора, и инкубируют в течение еще 4 часов. Средняя в каждую лунку заменяли 150ul ДМСО. Абсорбция определяли с помощью планшет-ридере (BIP-Rad) на длине волны 490 нм. Пустые контрольные лунки использовались для обнуления абсорбцию. Степень ингибирования (ИК%) рассчитывали с использованием фоновой коррекцией абсорбцию следующим уравнением:.
<Р> Микросхема <суб> 50 была определена как концентрацию, необходимую для 50% ингибирования роста клеток
<р> Клетки были случайным образом разделены на 4 группы: контрольная группа (а), UA группа (в), лучевая терапия (RT) группа (C), и комбинированные группы (D ). Клетки КУП-823 культивировали в 6-луночных планшетах, а затем группы B и D обрабатывали UA, в то время как Группа C и D были облучены с использованием 6-МэВ линейный электронный пучок ускорителя (Elekta, Швеция).
<р> Радиочувствительность определяли клоногенности выживаемости. Клетки (500-2000 на лунку) засевали в 6-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали UA (0, 6,25 и 10ug /мл) в течение 24 ч, а затем подвергается воздействию возрастающих доз РТ (0, 2, 4, 6 и 8Gy). Через 10-14 дней инкубации колонии состояли из более чем 50 клеток не наблюдалось. Колонии были тщательно промывали, окрашивали этанол /кристаллическим фиолетовым красителем, а затем подсчитывали. Эффективность обшивки (ПЭ) рассчитывают как (среднее количество колоний /клеток высевали) и выживших фракция (SF) рассчитывали как [средняя количество колоний /(клетки высевают × PE)], где РЕ была определена как (среднее число импульсов колонии для ун-облучают Контроли /клетки высевают). D <суб> 0 значения были вычислены с помощью мульти-целевой сингл-хит модель [S = 1 - (1-е -D /D0) N], которая представляла собой среднюю дозу смертельного облучения. Коэффициент усиления сенсибилизирующим (SER) рассчитывали как D <югу> 0 соотношение между комбинированной терапии и только RT.
<р> Влияние клеточного цикла анализировали с использованием Пропидиум йодид /РНКазы буфера (BD Pharmingen, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) окрашивания в соответствии с инструкциями изготовителя. 2,5 × 10 5 клеток высевали в 6-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали UA (0 и 10ug /мл) в течение 24 ч, а затем облучают до комнатной температуры (0 и 2Gy) в течение 48 часов. Клетки собирали трипсином, фиксировали в 70% -ном этаноле при температуре от -20 ° С, промывали в PBS, ресуспендировали в 1 мл PBS, содержащего 1 мг /мл РНКазы и 50 мкг /мл пропидий йодид, инкубировали в темноте в течение 30 мин при 37 ° С, и анализировали с помощью проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, США).
<р> клетки количественное апоптозных клеток оценивали с использованием аннексина-V-FITC, устройство обнаружения Апоптоз (BD Pharmingen, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. 2,5 × 10 5 клеток высевали в 6-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали UA (0 и 10ug /мл) в течение 24 ч, а затем облучают до комнатной температуры (0 и 2Gy) в течение 48 часов. Клетки собирали трипсином, и ресуспендировали в 500ul буфера для связывания, и 5UL аннексина-V-изотиоцианат флуоресцеина (FITC), а затем добавляли 5UL из пропидийиодидом (ПИ). Анализы были выполнены с помощью проточной цитометрии.
Обнаружение активных форм кислорода (ROS) генерация
<р> Концентрации внутриклеточной ROS были обнаружены с использованием мембранных проницаемым для флуоресцентных зондов 2 ', 7'-dichlorofluorescin диацетат (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Цзянсу, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. 1 × 10 6 клетки высевают в 6-луночные планшеты и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали UA (0 и 10ug /мл) в течение 24 ч, а затем подвергали воздействию до комнатной температуры (0 и 2Gy) в течение 48 часов. Клетки собирали трипсином, ресуспендировали DCFH-DA в течение 30 мин, промывали бессывороточной средой RPMI 1640, а затем детектируется с помощью проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) представлена внутриклеточный уровень активных форм кислорода.
иммуногистохимическое окрашивание для оценки Ki-67 выражение
<р> Ki-67 экспрессии белка оценивали с помощью комплекса иммуногистохимических авидинбиотиновом (ZSGB-BIO , Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями изготовителя. 2 × 10 4 клетки высевали в 6-луночные планшеты с крышкой скольжения для каждой лунки, и позволяли закрепляться в течение ночи. Затем клетки обрабатывали UA (0 и 10ug /мл) в течение 24 ч, а затем подвергали воздействию до комнатной температуры (0 и 2Gy) в течение 24 часов. Затем Покровные стекла фиксировали в 4% параформальдегид, инкубировали с 0,5% Triton X-100 в течение 20 мин, промывали в PBS, и инкубировали с 3% Н <к югу> 2О <югу> 2 в течение 15 мин. После промывки PBS в течение трех раз, клетки, которые были прикреплены на покровных стеклах, инкубировали с Ki-67 моноклональных антител в течение 60 мин при 37 ° С, а затем снова промывали в PBS. Биотин-конъюгированные вторичные антитела в течение 20 мин при 20-37 ° С, промывали PBS в течение четырех раз, а затем окрашивали с помощью DAB Окрашивание Kit, промывают водой, а затем контрастно гематоксилином.
Статистический анализ
<р> данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, а значит сравнения проводились с помощью одностороннего ANOVA. P &л; 0,05 была принята в качестве статистически значимой. Статистический анализ проводился с использованием SPSS, v. 17.0.
Результаты
<р> цитотоксический эффект UA на BGC-823 клеток оценивали на основании МТТ-анализе. Мы обнаружили, что иа дозозависимо увеличена цитотоксичность в желудочном линии клеток рака КУП-823 (фиг.1). Полумаксимальную ингибирующая концентрация (IC <суб> 50) значения для BGC-823 был 17.5ug /мл. Незначительные цитотоксичность (&л; 15%) из UA для BGC-823, 10ug /мл, использовали для последующих планируемых экспериментов, для контроля за radioenhancement из-за прямого цитотоксического эффекта
<р> кривые выживаемости клеток, измеренные клоногенности выживаемости были проиллюстрированы на рис 2. по сравнению с RT только SF <суб> 2 РТ в сочетании с UA значительно уменьшились в КУП-823 клетки, SER значения объединенных групп были 1,180 раза и 1,315 раза. Эти результаты показали, что иа усиливается радиационный эффект BGC-823 в зависимости от дозы образом в пределах Незначительное концентраций цитотоксичности.
распределение клеточного цикла и индукция апоптоза.
<Р> Исследовать ли RT и /или лечение UA может вызвать любое возмущение клеточного цикла, анализ клеток КУП-823, обработанных 2Gy облучением и /или 10ug /мл UA проводили. По сравнению с контрольной группой, 10ug /мл UA в одиночку не дали почти никакого влияния на клеточный цикл. Тем не менее, объединенная группа UA и облучения индуцированные остановки клеточного цикла в G <югу> 1 фазы (51,87% против 60,28%, р = 0,13) и G <суб> 2 /M фазы (3,14% против 13,67%, р &л; 0,01) по сравнению с группой облучения 2Gy (рис 3А и 3В). Эти данные свидетельствуют о том, что комбинированное лечение может быть причиной G <суб> 1 фазы и G <суб> 2 /M фазы арест, который был более восприимчивыми к разрушающему воздействию радиации. Аналогичные выводы из данных клеточного цикла было доказано предыдущим исследованием. [15]
<р> Комбинация UA и облучения также может привести к более апоптотической гибели клеток, как показано на рис 3B. Доля апоптотических клеток существенно увеличена путем применения как UA и облучения в BGC-823 клеток, в отличие от UA или ИК-терапии в одиночку. (78,2% против 9,6% и 12,5%, р &л; 0,01, рис 3D)
<р> широко распространено мнение, что гибель клеток после воздействия ионизирующего излучения частично опосредовано ROS. [16] РОС анализ с использованием DCF-DA произвел среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), который представлены внутриклеточный уровень активных форм кислорода каждой группы (фиг.4А и 4В). УМФ БВС только группы, РТ только группы и группы иа + RT увеличилась на 1,15 раза, 1,53 раза и 2,09 раза по сравнению с контрольной группой. Уровень ROS комбинированной группы значительно увеличилась по сравнению с одной только группе RT, показывая, что добавление UA до комнатной температуры индуцированное больше образование активных форм кислорода, чем только RT.
Иммуногистохимическое окрашивание Ki-67
<р> Ki -67 был известен как ядерный антиген, который часто коррелирует с клеточной пролиферации. Наш эксперимент обнаружил положительную скорость белка Ki-67 путем иммуногистохимического окрашивания, а результаты показаны на рис 5. Процент Ki-67 позитивных клеток в группе, получавшей комбинированную значительно снизилась по сравнению с контрольной группой, а также группы радиационной терапии .
<р> Это исследование исследовали влияние и возможный механизм UA в качестве радиосенсибилизатора. Анализ МТТ и анализ клоногенному выживаемости показал, что в сочетании с ИК-UA был выше, чем в цитотоксичности только ИК. Этот эффект наблюдался в обеих группах с различной концентрацией суб-цитотоксичности UA, 6.25ug /мл и 10ug /мл. При этой дозе UA имела небольшое цитофототоксичностью по отношению к аденокарциномы желудка клеточной линии человеческого BGC823 и не имели существенного цитофототоксичностью по отношению к нормальной желудочной клеточной линии. [17] Это свидетельствует о том, что UA был многообещающим радиосенсибилизация в пробирке
.
<р> Нормальные ткани вокруг рака желудка, кишечника, такие как и желудка, чувствительны к ионизирующему излучению. В результате, доза ионизирующего излучения по отношению к опухолевой ткани должно быть ограничено. Кроме того, перекрывающиеся побочные эффекты ионизирующей радиации увеличит побочные эффекты лучевой терапии, и даже прерывать лечение. Концентрация Суб-цитотоксичность UA в сочетании с ионизирующим излучением, однако, может увеличить цитотоксичность ионизирующим излучением, в то время как низкая концентрация UA практически безвредны для нормальных тканей. Эта стратегия может увеличить терапевтический индекс в опухолевой ткани без увеличения дозы облучения и радиотерапевтический побочный эффект.
<р> В заключение, данное исследование является первой попыткой продемонстрировать, что UA может синергично с ионизирующим излучением против желудочных линий раковых клеток человека , Основной механизм повышения эффективности радиосенсибилизация может быть повышена G2 /M арест, увеличение ROS и вниз регулируется уровень Ki-67. Все вместе, в качестве UA продемонстрировали сильный эффект антипролиферационного и синергетический эффект, он может быть использован в качестве потенциального сенсибилизирующего лекарственного для применения лучевой терапии. Тем не менее, без сомнения, что дальнейшие исследования, необходимые для оценки возможности и преимущества использования традиционной китайской медицины, как радиосенсибилизаторами до фактического клинического применения. Дополнительные эксперименты и репликаций необходимы в других типах опухолей и в испытаниях на животных для того, чтобы подтвердить эффективность предложенной стратегии.
Оральный секс может вызвать бактериальный вагиноз
Сельская и городская микробиота отличается с юного возраста,
Иммунные клетки восстанавливают поврежденный кишечник у детей с ВЗК
Почему у пациентов с COVID-19 больше патогенных бактерий в носу
Потеря кишечного эпителиального барьера, ответственного за MIS-C, связанный с COVID-19, у детей,
Не бойтесь колоноскопии
Вибрация всего тела помогает уменьшить воспаление,
благодаря микробиому кишечника Вибрация всего тела, по-видимому, улучшает многие симптомы сахарного диабета II типа. при этом глюкоза и деструктивное воспаление нарастают. Процедура помогает организму
Нанотехнологии и диагностика и лечение COVID-19
Разработка нанобиосенсоров, вакцин и лекарств на основе наночастиц открыла новый путь к более эффективному управлению пандемией коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19). В недавно опубликованной ст
Как справиться с синдромом раздраженного кишечника
Считается, что синдром раздраженного кишечника (СРК) поражает от 25 до 45 миллионов американцев, в основном женщины в возрасте от позднего подросткового возраста до начала 40-х годов. Состояние предст