PLoS One: aktiváló transzkripciós faktor 4 ruházza multidrog fenotípus gyomorrák sejtek révén transzaktivációját SIRT1 Expression

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A több szerrel szembeni rezisztenciát (MDR) a gyomorrák továbbra is jelentős kihívás a klinikai kezelést. Aktiváló transzkripciós faktor 4 (ATF4) egy stresszválasz szerepet játszó gén homeosztázis és celluláris védelmet. Azonban a kifejezés és funkciója ATF4 gyomorkarcinómában MDR továbbra is ismeretlen. Ebben a tanulmányban azt vizsgáljuk, hogy ATF4 szerepet játszanak a gyomorrák MDR és annak lehetséges mechanizmusait. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

Kimutattuk, hogy ATF4 túltermelése confered az MDR-fenotípus gyomorrák sejtek, míg kiütése ATF4 az MDR variánst indukált újra túlérzékenységet. Ebben a tanulmányban azt is kimutatta, hogy a NAD ^{+ - függő hiszton dezacetiláz SIRT1 volt szükség ATF4 indukált MDR hatás a gyomor rákos sejteket. Kimutattuk, hogy ATF4 megkönnyítette MDR gyomorrákban sejtek közvetlen kötődés a SIRT1 promoter, ami SIRT1 up-szabályozás. Jelentősen gátlása SIRT1 katalógusa kis interferáló RNS (siRNS), vagy egy specifikus inhibitor (EX-527) újból terápiás érzékenység. Emellett fokozott Bcl-2 /Bax arány és MDR1 expresszió szintjét találták ATF4 overexpresszáló sejtek. Katalógusa}

Következtetések /Jelentés katalógusa

Kimutattuk, hogy ATF4 kulcsszerepe volt a rendelet a MDR a gyomorrák sejtek válasz kemoterápia és ezek az eredmények arra utalnak, hogy célozza ATF4 enyhítheti terápiarezisztencia gyomorrákban. katalógusa

Citation: Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang, H Xu W, Hu H, et al. (2012) aktiváló transzkripciós faktor 4 ruházza multidrog fenotípus gyomorrák sejtek révén transzaktivációját SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431 katalógusa

Szerkesztő: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Fogadott szeptember 5-én, 2011; Elfogadva: január 8, 2012; Megjelent: február 17, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Zhu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatott kombinált támogatást a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (NO.81090270, NO.81090273 és NO.81000864), a kínai posztdoktori Science Foundation (NO.20100471776), a Nemzeti Key and Basic Research Development Program of China ( NO. 2010CB529302), valamint a Nemzeti Városi Tudományos és Technológiai Project (2009ZX09103-667 és 2009ZX09301-009-RC06). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a több szerrel szembeni rezisztencia általában a fő oka a hiba a kemoterápia elleni rosszindulatú daganatok, beleértve a gyomorrák [1] .A távú multidrog klasszikusan meghatározására használják ellenállás fenotípus, ahol a sejtek rezisztenssé válnak egyidejűleg különböző drogok nélkül nyilvánvaló szerkezeti hasonlóság és a különböző sejten belüli célpontok [2]. MDR fordul elő gyakrabban az új gyógyszerek, amelyek jelentősebb hatékonyságát után az első alkalmazás a rák kezelésében. A klinikai hasznosságát különböző drogok korlátozza mind a természetes és a szerzett tumorsejt ellenállás, amely majdnem mindig multifaktoriális jellegűek [3]. Azok a tényezők, amelyek befolyásolhatják a hatóanyag-érzékenység a következők: felgyorsult efflux, a kábítószer-aktiválás és inaktiválása, módosított hatóanyag cél DNS metiláció, feldolgozása, kábítószer okozta károkat, és adócsalás apoptózis [4]. Katalógusa

A gyomorrák viszonylag érzéketlen a kemoterápiás. Az MDR mechanizmusok gyomorrák sejtek már nagyjából vizsgálták laboratóriumi és másutt [1], [4], [5], de még nem teljesen tisztázott, jelezve, hogy más, ismeretlen molekulák vagy útvonalak is be lehet vonni a fejlesztési MDR.

emlőssejtek, eukarióta transzlációs iniciációs faktor 2 α alegység (eIF2α) foszforilálja különböző eIF2α kinázok válaszul különböző stressz jeleket, beleértve anoxia /hypoxia, endoplazmatikus retikulum stressz, aminosav nélkülözés, és az oxidatív feszültség. Ez a foszforiláció esemény vezet gyors csökkenés globális fehérje bioszintézis egyidejű indukálását transzlációs gének expressziójának, beleértve a ATF4
hogy működnek, hogy enyhítse a sejtkárosodást a stressz [6], [7]. Bár ATF4 játszhat pro-apoptotikus szerepe körülmények között súlyos vagy tartós stressz, ATF4 katalógusa hatásos stressz-érzékeny gént úgy gondolják, hogy védő szerepe szabályozása által celluláris alkalmazkodás kedvezőtlen körülmények, az integrált stresszválasz ( ISR) [8], [9], [10]. Nemrégiben overexpressziója ATF4 jelentették, hogy kiemelkedő a sokféle daganatok és védelmére tumorsejtek ellen többszörös feszültségek, valamint egy sor rák terápiás szerek [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. A lehetséges mechanizmusok felelősek ezért védelmet biztosíthat az autofágia indukció elősegítése DNS sérülés javítására, és fel-szabályozás az intracelluláris glutation [12], [13], [14], [17]. Azonban a kifejezés és funkciója ATF4 gyomorkarcinómában MDR továbbra is ismeretlen.

Ebben a vizsgálatban azt jelentette, hogy ATF4 szignifikánsan felülszabályozott az MDR válasz gyomorrák sejtek összehasonlítva a szülői kontroll sejtek. Kiütése ATF4
siRNS jelentősen érzékenyített sejtek MDR, hogy a különböző kemoterápiás szerekkel, míg a fel-regulációja ATF4 a SGC7901 és AGS sejtek kiolvasztott őket multirezisztens. Azt is kimutatták, hogy ATF4 támogatni gyomorrák MDR részben up-expresszióját szabályozó SIRT1. És SIRT1 gátlás részben fordított a gyomorrák MDR-fenotípus által közvetített ATF4. Ezek az adatok arra utalnak, hogy célozza ATF4 esetleg egy új terápiás lehetőség az irányváltó klinikai gyomorrák MDR. Katalógusa

Eredmények katalógusa

ATF4 modulálja a MDR-fenotípus gyomorrák sejtek katalógusa

Annak meghatározására, hogy ATF4 részt vesz a fejlesztési MDR gyomorrákban sejtekben ATF4 szinteket Western blot és qPCR a SGC7901 sejtvonal és MDR változatok, SGC7901 /VCR és SGC7901 /ADR. Mindkét fehérje és mRNS-szintje ATF4 sokkal magasabb volt a rezisztens sejtvonalak, mint a szülői sejtekben (1A.).

Annak vizsgálatára, hogy ATF4 túltermelődése elegendő indukálni MDR fenotípus gyomorrák-sejtek, ATF4 katalógusa kifejezés cDNS stabilan transzfektáljuk SGC7901 és AGS sejteket. Először is, a CDDP érzékenység teszteltük egy telepképző assay. Amint azt a számszerűsítését a telepképző assay, ATF4 overexpresszió eredményezett közel 3-szoros növekedését kolónia számok képest üres vektorral-kifejező sejtek (ábra. 1B). MTT assay is jelezte, hogy az IC _{50-értéke SGC7901-ATF4 ADR, VCR, CDDP, és az 5-FU szignifikánsan megnövekedett összehasonlítva üres vektor transzfektált sejtek (ábra. 1D). Katalógusa}

ATF4 szintek emelkedettek MDR gyomorrák-sejtek, akkor a további akarta meghatározni, hogy célzási ATF4 lehetett újra érzékennyé az MDR-sejtvonalak. Kiütése ATF4
által siRNS a SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR sejtek vezetett 2- és 3-szoros csökkenés a sejtek számát, amikor kombinációban alkalmazzák CDDP (ábra. 1C). Ábra adatainak. 1E is sugallják, hogy down-regulációja ATF4
jelentősen megfordítja az ellenállást a SGC7901 /ADR sejtek válasz kemoterápiát.

Mivel az apoptózis gátlása az egyik fontos mechanizmusok az MDR, mi is vizsgáltuk a kapacitás a SGC7901 /ADR transzfektált sejtek a specifikus ATF4
siRNS alávetni CDDP-indukált apoptózis a Hoechst-festéssel és a DNS-fragmentáció vizsgálatokban. Kezelése SGC7901-ATF4 és SGC7901 /ADR-SCR sejteket a megjelölt koncentrációjú CDDP 36 óra hosszat nem indukált apoptózist, mint értékelni Hoechst sejtmag megfestésére (ábra. 1F) és a DNS-fragmentáció assay (ábra. 1G). Ezzel szemben SGC7901-vektor és SGC7901 /ADR-siATF4 sejtek jelennek meg jelentős apoptózist, a gyakoribb megjelenése sűrített és fragmentált magok és a DNS létra képződését. Sőt, inkább nyilvánvaló hasítása prokaszpáz-3 volt megfigyelhető kezelés után a CDDP a SGC7901-vektor és SGC7901 /ADR-siATF4 sejtek összehasonlítva SGC7901-ATF4 és SGC7901 /ADR-SCR-sejtek, illetve (ábra. 1 H).

Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy ATF4 ruházza MDR-fenotípus a gyomor rákos sejteket, és hogy célzási ATF4 eljárást biztosít érzékenyítő rezisztens sejtek kémiai kezelések.

ATF4 up-expresszióját szabályozza SIRT1, MDR1 a Bcl-2, és Bax a gyomor rákos sejtekben

Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a sejtek overexpresszáló SIRT1 megjelenített csökkent érzékenységet a kemoterápia által többszörös mechanizmusok [18], [19], [20], [21]. Voltunk kíváncsiak annak meghatározására, hogy SIRT1 katalógusa, amely egy stresszel kapcsolatos gén kritikus MDR fejlődés, lehet a downstream célpontja ATF4 felelős közvetítésére ATF4 indukált MDR gyomorrákban sejtekben.

SIRT1 szint LV-vektor és LV-ATF4 stabilan transzfektált SGC7901 sejteket vizsgáltuk qPCR és Western blot. A túltermelése ATF4 volt összefüggésbe hozható a megnövekedett SIRT1 expressziója mind transzkripciós (2A. Ábra, balra) és transzlációs szinten (ábra. 2B, balra). Ezzel ellentétben, az siRNS kiütése ATF4
SGC7901 /ADR sejtek eredményezett szignifikáns csökkenését endogén SIRT1 katalógusa kifejezés (2A. És 2B, jobbra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy ATF4 up-szabályoz SIRT1 katalógusa kifejezés a gyomorrák sejtek. Katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a szerepet játszó molekuláris mechanizmusok ATF4 kapcsolatos MDR gyomorrák azt is megvizsgáltuk, MDR1, MRP, Bcl-2, és Bax expressziójának szintje a gyomor rákos sejtek fent alkalmaztunk. Ábrán látható. 2B, ATF4-jártas sejtek expresszálták több MDR1, mint a kontroll sejtek. Eközben nincs nyilvánvaló különbség a MRP expressziót találtunk bármelyik ezen sejtvonalak. Érdekes módon, mind a Bcl-2 és a Bax expressziós szinteket up-szabályozott ATF4-jártas sejtek, míg a kontroll sejtvonalak, míg a kifejezés a Bax mutatott csak csekély változásokat, jelezve, hogy egy up-regulációja a Bcl-2 és Bax arány lehet, elnyomja a kábítószer-indukált apoptózist ATF4 overexpresszáló gyomor rákos sejteket.

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy ATF4 elősegíti MDR képességét gyomorrák-sejtek révén több mechanizmusokat.

ATF4 transzaktiválja SIRT1 promoter aktivitását és közvetlenül kötődik a SIRT1 promoter

Annak meghatározására, hogy ATF4 közvetít SIRT1
gén transzkripcióját, 293T sejteket együtt transzfektáltunk a 1,2 kb a SIRT1
promoter riporter plazmiddal és a ATF4 katalógusa expressziós plazmidot. A luciferáz riporter vizsgálat kimutatta, hogy a SIRT1 katalógusa promoter aktivitását jelentősen aktiválja ATF4 dózis-függő módon (3A.). Katalógusa

A kísérlet, hogy megszerezzék különleges betekintést mechanizmusok SIRT1 katalógusa indukció, megvizsgáltuk a lehetséges útvonalakat, indukciós ATF4. Elemezve az 5'-szegélyező szekvenciáját a SIRT1
gént bioinformatikai szoftverekkel (Tfsitescan szolgáltatás, Tess, és Genomatix), két ATF4 feltételezett kötőhelyeket azonosítani az -950 hogy -600 bp régióban a SIRT1 katalógusa promoter (ábra. 3B). katalógusa

Annak megállapításához, hogy SIRT1 katalógusa közvetlen célpontja a ATF4, chip a ATF4 ellenanyagot SGC7901-ATF4 sejtek mutattak dúsítása mindkét kötőhelyek belül a SIRT1
promoter régiót, jelezve, hogy az RNS-t és az ezt követő fehérje szint növekszik a SIRT1
ATF4-expresszáió sejtvonalak valószínű oka, hogy egy közvetlen kölcsönhatása ATF4 a SIRT1 katalógusa gén promoter (3C.). katalógusa

Annak vizsgálatára, a szerepe a két ATF4 kötőhelyek szabályozásában SIRT1 transzaktivációs, helyspecifikus mutagenezis alkalmaztunk mutáció ezeket a területeket. Luciferáz riporter vizsgálat azt mutatta, hogy akár mutálódik a kötőhely 1 vagy 2 kötőhely csökkentette a SIRT1 promoter aktivitását által kiváltott ATF4. Továbbá mutáció mindkét kötőhely eltörölte a SIRT1 promoter aktivitását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind a ATF4 kötőhelyek vesznek részt a transzaktivációs SIRT1 promoter (ábra. S1).

Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a SIRT1 közvetlen transzkripciós célpontja ATF4.

SIRT1 katalógusa gátlása siRNS részben megfordítja a MDR fenotípus ATF4 overexpresszáló gyomorrák sejtek katalógusa

az azonosító ATF4 közvetített SIRT1 katalógusa expressziós szintjének emelkedése gyomorrák sejtek, kéri elemezni tudjuk a szerepe ennek útvonal gyomorrák MDR. Ennek megoldására, összehasonlítottuk a in vitro katalógusa drog iránti érzékenységet ATF4 stabilan transzfektált gyomorrák sejtek transzfekciója után SIRT1 katalógusa siRNS vagy rántotta siRNS kolónia kialakulása és MTT assay. Kiütése SIRT1
által siRNS SGC7901-ATF4 sejtek vezetett > 40% -os csökkentése kolónia számát, amikor kombinációban alkalmazzák CDDP-t (4a., Felső). Ez a hatás is megfigyelhető volt AGS-ATF4 sejtek (4a., Alacsonyabb). Ezen túlmenően az adatokat a MTT assay is jelezték, hogy kiütése SIRT1
lehetett újra érzékennyé SGC7901-ATF4 sejtek kémiai gyógyszerek, de ez nem fordul elő kódolt siRNS transzfektált sejtek (ábra. 4B).

Annak meghatározására, hogy a SIRT1 védi a sejteket a CDDP-indukált apoptózisra, SGC7901-ATF4 transzfektált sejtek SIRT1
siRNS vagy kódolt siRNS kezeltük CDDP és jelölt Annexin V és PI. Az apoptotikus sejteket azonosítani annexin V címkézés. Az apoptotikus százalékos SIRT1 siRNS transzfektált SGC7901-ATF4 sejtek szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll sejtek (ábra. 5A, 72,8% vs. 25,9%). A megjelenése sűrített és fragmentált sejtmagok szintén emelkedett a SIRT1 siRNS transzfektált sejtek összehasonlítva a kontroll sejtek (ábra. 5B). Továbbá hasítása prokaszpáz-3 volt megfigyelhető már 12 órával a kezelés után 10 ug /ml CDDP a SIRT1 siRNS transzfektált SGC7901-ATF4 sejtek, de nem a kódolt siRNS kezelt sejtekben, még 24 óra után a CDDP kezelés (ábra. 5C ). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a SIRT1 túltermelése szuppresszálja a CDDP-indukált apoptózis.

hatásának vizsgálatára down-regulációja SIRT1 siRNS a MDR kapcsolódó molekulákat, megvizsgáltuk MDR1, MRP, Bcl-2, és Bax expressziós szinteket SGC7901-ATF4 sejtekben transzfekciót SIRT1 siRNS vagy kódolt siRNS. Down-regulációja MDR1 volt megfigyelhető a SIRT1 siRNS-kezelt sejtekben (ábra. 5D), mint a kontroll sejtek. Ezzel szemben nem nyilvánvaló különbség az MRP, a Bcl-2 és Bax expressziójának szinteket találtak a minták között.

Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a SIRT1 közvetíti a ATF4 indukált MDR hatás gyomor rákos sejtekben.

gátlása SIRT1 aktivitás újbóli érzékennyé ATF4 transzfektált sejtek DNS-károsító ágensek

Ahhoz, hogy a bizonyíték arra, hogy a SIRT1 katalitikus aktivitás is felelős a ATF4 indukált MDR, SGC7901-ATF4 sejteket előkezelt EX-527 , egy újszerű, hatékony és specifikus kis molekulájú inhibitora SIRT1, és ezt követi a kezelés különböző kémiai szerek. Először is, mi határozza meg a bazális citotoxicitásához EX-527 LV-vektor és LV-ATF4 stabilan transzfektált SGC7901 sejteket. Az MTT assay során kiderült, hogy az EX-527-ig terjedő koncentrációban 10 jiM nem gátolta, hanem kis mértékben nőtt, életképességét mindkét sejtvonal (ábra. 6a). Ezután megvizsgáltuk a SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, és a Bax expressziós szintek 24 óra után 'inkubáció együtt vagy anélkül a jelzett dózisokban az EX-527 A gyomorrák-sejtek fent alkalmaztunk. Csak a kifejezés a MDR1 alulszabályozott által EX-527 egy koncentráció-függő módon (ábra. 6b). Aztán előinkubáltuk SGC7901-ATF4 sejtek vivőanyaggal vagy Ex-527 (0,5, 1, 2, 4, és 10 uM) 24 órán át, majd CDDP- és az 5-FU-közvetített sejthalál követtük nyomon. Ábrán látható. 6C, EX-527 szignifikánsan fokozta a citotoxicitást mindkét gyógyszer dózis-függő módon. Azt is megállapítottuk, a lehetséges szinergetikus hatása EX-527 különböző dózisaival CDDP- és az 5-FU-közvetített gátlását sejtproliferáció SGC7901-ATF4 sejteket. Ahogy az várható volt, 10 jim EX-527 elegendő ahhoz, hogy potencírozzák citotoxicitás mindkét gyógyszer (ábra. 6D).

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a SIRT1 aktivitás szintén kritikus szerepet játszik a ATF4 indukált gyomorrák MDR, és ez a szerepe lehet közvetített részben MDR1 expressziója. katalógusa

Vita katalógusa

MDR jelent jelentős klinikai kihívások hatékony kemoterápia számos humán rosszindulatú daganatok. A mechanizmus, amellyel a sejtek rezisztenssé sokrétű és bonyolult, így szélesebb körű megértését őket, valamint azonosítása új mechanizmusok kemorezisztenciájának, akkor különösen hasznos, hogy jobb terápiás lehetőségeket. Ez a tanulmány az első jelentés, amely a magas szintű ATF4, gyakran megfigyelhető a daganat sejtek alatt stresszes körülmények között ruházza gyomorrák sejteket egy MDR-fenotípus, és azonosítja, hogy ez a hatás közvetíti részben transzaktivációs SIRT1 kifejezés.

ATF4 katalógusa és SIRT1 katalógusa vannak evolúciósan konzerválódott stresszválasz gének széles spektrumú biológiai folyamatok, amelyek közül sok üdvös homeosztázis és a celluláris védelem [22], [23], [ ,,,0],24]. Mindkét gének adott válaszként indukálódik, hogy a különböző feszültségek, beleértve oxigénhiány (hipoxia /anoxia), oxidatív stressz, DNS-károsodás, táplálkozási nélkülözés, és kemotoxikus stressz. Levenson VV et al.
Első számolt be, hogy változások expressziója ATF4 szerepet játszhat a pleiotróp rezisztenciát különböző osztályok a DNS-t célzó gyógyszerek [16]. Az utóbbi években számos tanulmány úgy találta, hogy ATF4 részt közvetve vagy közvetlenül a fejlesztés a gyógyszer-rezisztencia révén autofágia, a glutation-függő redox rendszer, és a DNS sérülés javítására [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Itt megmutatjuk, hogy a védő képességét ATF4 valóban közvetít egy MDR fenotípus ATF4 overexpresszáló gyomor rákos sejtvonal válaszul kemoterápia. Eredményeink egyértelműen azt mutatják, hogy túltermelése ATF4 gyomorrákban sejtek járt nagyobb ellenállást, míg kiütése ATF4 indukált újra túlérzékenységet. Ezek az adatok azt sugallják, hogy ATF4 valószínűleg fontos downstream mediátora rezisztencia által okozott többszörös mechanizmusok és ezért értékes terápiás célpont. Mégis, mint az egyik legfontosabb transzkripciós mediátorai az ISR, amely aktiválja a különböző megcélzott gének, amelyek elősegítik a helyreállítása homeosztázis, ATF4 is közvetít rezisztencia más mechanizmusok. Vizsgálatunkban SIRT1 találták, hogy up-szabályozott ATF4 overexpresszáló sejtek összehasonlítva vektorral transzfektált sejtekben. Ezzel szemben, a kiütése ATF4
azzal ATF4 specifikus siRNS vezetett down-regulációja SIRT1 MDR gyomor rákos sejtekben. Eredményeink azt sugallják, hogy a SIRT1 lehet egy későbbi közvetítője ATF4 indukált gyomorrák MDR. Katalógusa

tagjaként az ATF alcsalád az alap-régió leucin cipzár (Bzip) transzkripciós faktorok [22], ATF4 van potenciális eljárni, mint akár egy transzkripciós aktivátor vagy egy transzkripciós represszor keresztül ATF vagy cAMP-re reagáló elem (CRE) kötőhelyeket [22]. A konszenzus kötőhelye ATF definiáltuk TGACGT (C /A) (G /A) [27], amely a szekvencia azonos a CRE konszenzus elem (TGACGTCA) [28]. Továbbá, az erősen konzervált mag motívum - ACGT - a legtöbb CRES [29] kötődni képes különböző bzip tényezők, attól függően, a szegélyező bázisok a mag motívum [22], [30], [31]. Tanulmányunkban két vélt ATF-CRE kötőhelyek találtak a 1,2 kb SIRT1 katalógusa promoter régiót, és ATF4 közvetlenül működteti SIRT1 katalógusa transzkripció útján való kötődés mindkét kötőelemeket. Azonban, hogy a két kötőhely játszani szerepüket alatt részletes feszültség körülmények továbbra is ismeretlen, és további vizsgálatot igényel. Katalógusa

Az emlős SIRT1 katalógusa van a legközelebb homológ az élesztő Sir2 katalógusa és a legszélesebb körben tanulmányozott SIRT családtag. Ez erősen érintett a szabályozás a celluláris folyamatok, amelyek meghatározzák a hosszú élettartam, beleértve az anti-apoptosis, neuronális védelem, és a celluláris öregedés vagy öregedés [32]. A közelmúltban, egyre több tanulmány játszanak fokozott expressziója SIRT1 ellenállás a kemoterápiával és az ionizáló sugárzás [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Például SIRT1 overexpressziója találtak a gyógyszer-rezisztens neuroblasztóma, oszteoszarkóma, emlő, petefészek, prosztata, vastagbél és tüdő rákos sejtvonalakban képest a szer-érzékeny társaik. Mindezek a gyógyszer-rezisztens hatásait SIRT1 esetleg az oka, hogy az anti-apoptotikus hatását [37], [38] és a silencing tumor szuppresszor gének [39]. Végül, talán azt jósolják, hogy, ha a SIRT1 részt vesz a ATF4 indukált MDR gátlása SIRT1 sem érinti a érzékenységét ATF4-overexpresszáló sejtek válasz kemoterápia. Ahogy az várható volt, mind a siRNS és farmakológiai gátlása SIRT1 lehetett újra érzékennyé ATF4 overexpresszáló sejtek kémiai szerek. Ezen felül, a tanulmány azt mutatja, hogy a SIRT1 védi a sejteket a halál részben egy anti-apoptotikus hatását.

Leírták, hogy az MDR1 volt, akár szabályozott sejtekben megnövekedett SIRT1 expressziója [18], [36]. Ebben a vizsgálatban azt is kimutattuk, hogy az MDR1 up-szabályozott ATF4 overexpresszáló sejtek, és kiütése SIRT1 a SIRT1 specifikus siRNS vagy gátolva annak aktivitását EX-527 vezethet down-regulációja MDR1, ami összhangban van a kábítószer ellenálló szerepet SIRT1. Azonban a Bcl-2 /Bax aránya, amely volt, akár szabályozott a ATF4 overexpresszáló sejtek, volt SIRT1-független, ami arra utal, hogy a SIRT1-független mechanizmusok is szerepet játszanak a ATF4 indukált MDR gyomorrákban sejtekben.

Összefoglalóan azt bizonyítják, hogy ATF4 ruházza MDR fenotípus gyomorrák sejtek, és ez a hatás részben közvetíti transzaktivációját SIRT1 túltermelése. Sőt, ATF4 érvényes cél a gyógyszer-rezisztens gyomor tumorok, és a fejlődő hatékony inhibitorai ATF4 kell figyelembe venni a jövőben. Ezek az eredmények új betekintést a szerepét ATF4 szabályozásában SIRT1 expressziója és a stressz-rezisztencia jellemzői a tumorok és a kemoterápia. Ez különösen fontos a klinikai venni, mivel ATF4 lehet akár szabályozott által oxigénhiány, oxidatív stressz, táplálkozási nélkülözés és szinte az összes káros stressz egy tumor mikrokörnyezetében, amelyet fel lehetne eltérített rákos sejtek, hogy elkerüljék a proliferáció gátlása, és sejthalált válasz a kemoterápiára. Ezért beavatkozások meghatározná károsító stressz által kiváltott ATF4 kifejezés a rákos sejtek lehetnek hatékonyak megkerülését, illetve tolatás a gyógyszer-rezisztencia gyomorrákban. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

A részletes módszer, lásd szöveg S1 .

Sejtkultúrák és reagensek katalógusa

az emberi gyomor adenokarcinóma sejtvonalak SGC7901 (nyert Akadémia Katonai Orvostudományi, Peking, Kína), valamint az MDR-változatok, SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR (létre és tartják fenn a laboratórium), és AGS (nyert sejtbank a kínai Tudományos Akadémia, Shanghai, Kína) RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati marhaszérummal (Hyclone) és penicillin /sztreptomicinnel. 293T-sejtek (szintén nyert sejtbank a kínai Tudományos Akadémia) DMEM-ben tenyésztjük, kiegészítve 10% magzati borjúszérumot. Ahhoz, hogy a MDR-fenotípus, adriamicin (a végső koncentráció 0,5 ng /ml) és a vinkrisztin (a végső koncentráció 1 ng /ml) adtunk a táptalajok SGC7901 /ADR és SGC7901 /VCR sejtek, ill. EX-527 (Sigma) DMSO-ban oldottuk a megadott koncentrációban. Adriamicin (ADR), vinkrisztin (VCR), ciszplatin (CDDP), és az 5-fluor-uracil (5-FU) oldottunk fiziológiás sóoldatban a jelzett koncentrációkban.

Cell transzfekció és stabil sejtvonalakat

Az emberi ATF4 katalógusa expressziós plazmidot (pCMV5-ATF4) volt szíves rendelkezésünkre professzor Amy S. Lee [25]. Lentivirális kódoló vektor specifikus siRNS ATF4 katalógusa és kontroll siRNS keletkezett használatával PLKO.1-TRC (Addgene) és jelölték LV-siATF4 és LV-SCR vezérlés, ill. Lentivirális kódoló vektor emberi ATF4 gént építettek FUW-tető (Addgene), kijelölt LV-ATF4. Az üres vektort alkalmaztuk negatív kontrollként, kijelölt LV-vektor. Stabil sejtvonalakat generáltunk transzfekciójával jelzett lentivirális konstrukciók majd szelekció puromicin vagy Zeocin (Invitrogen), ill. Cell transzfekció és generációs stabil sejtvonalak alkalmazásával végeztük standard eljárásokkal. Szekvenciáit az siRNS-konstrukciókat is található szöveg S1.

immunoblot

A gyűjtemény a fehérje kivonatok és immunoblotting analízist végeztünk standard eljárások alkalmazásával. Ellenanyag források, lásd szöveg S1. Katalógusa

telepképző assay katalógusa

A telepképző assay-t végeztek, a leírtak szerint [40], kisebb módosításokkal (szöveg S1). Katalógusa

Annexin V festéssel és FACS-analízis

Annexin V festéssel és FACS-analízist végeztünk standard eljárások alkalmazásával. Cells negatív mind a PI és annexin V festés sorolták élő sejtek, hogy festett pozitív annexin-V csak sorolták korai apoptotikus sejtek és PI pozitív és annexin V pozitív sejteket áteső sejtekben késői szakaszában az apoptózist. Katalógusa

DNS fragmentáció assay

a DNS-fragmenseket extraháltuk a DNS-t létra Extraction Kit spin Column (C0008, Beyotime Co., Peking, Kína), a gyártó protokollja szerint. A DNS-fragmenseket elválasztottuk felhasználásával gél elektroforézissel 1% -os agaróz gélen, amely 0,1 ug /ml etidium-bromidot tartalmaz.

Hoechst festést

Hoechst festést végeztünk a gyártó utasításai szerint protokoll (C0003, Beyotime Co. ). A sejteket láthatóvá egy DP70 invert Immunfluoreszcens mikroszkóp (Olympus). Sejtek sűrített és töredezett magok ítélték apoptotikus. Katalógusa

In vitro katalógusa gyógyszerérzékenységi teszt katalógusa

ADR, VCR, CDDP, és az 5-FU mind frissen készített, mielőtt minden egyes kísérletben. Kábítószer-érzékenység mértük 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) vizsgálat szerint a standard protokoll (Szöveg S1).

kvantitatív valós -time PCR (qPCR)

kvantitatív valós idejű PCR-t végeztünk egy LightCycler 480 II rendszer (Roche) és SYBR Green érzékelés (TaKaRa). Szekvenciái primerek megtalálható szöveg S1.

A kromatin immunprecipitáció (chip) assay

ChIP vizsgálatokat végeztünk, a gyártó protokollja (P2078, Beyotime Co.), kisebb módosításokkal. A kromatin oldatokat ultrahanggal kezeltük és inkubáltuk anti-ATF4 vagy kontroll IgG-t, és elforgatott éjszakán át 4 ° C-on. DNS-fehérje keresztkötések fordított és a kromatin DNS-t tisztítunk, és vetjük alá PCR-analízissel. A primereket 5'-ACC CCT CGT TTT ACA TCT-3 'és 5'-TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3' amplifikálására alkalmaztuk SIRT1
disztális promoterszekvencia (A1, nukleotidok -974 to - 843), és a primerek 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'és 5'-CCT CCT GGG AAG ACC TTT-3' amplifikálására alkalmaztuk a SIRT1
proximális promoter szekvencia (A2, nukleotidok -781 hogy -647). A primerek GAPDH katalógusa, 5'-TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG-3 'és 5'-TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3', használtuk negatív kontrollként. Pozitív kontrollként a ATF4-DNS kölcsönhatás, a primerek 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'és 5'-CGC TTA TAC CGA CCT GGC TCC T-3', amelyek célja, hogy amplifikáljuk az aszparagin szintetáz ( ASN
) promoter régió, amely legalább két helyen számoltak kötődni ATF4 [41], szintén használhatók. Az amplifikáció után a PCR-termékek megoldódott egy 1,5% -os agaróz gélen és etidium-bromid festéssel.

riportergénvizsgálati eljárás

A 1,2 kb humán SIRT1
promoter szekvenciát (- 1100-100 bp) szintetizáltuk és klónoztuk a XhoI és HindIII helyek a pGL3-Basic vektorba. Az így kapott konstrukciót DNS-szekvenálással igazoltuk. 293T sejteket ezután kotranszfektáltuk a SIRT1
promoter riporter plazmid, PRL-TK plazmid (Promega, USA), és a pCMV5-ATF4 plazmid felhasználásával Lipofectamine2000 (Invitrogen). Negyvennyolc órával a transzfekció után a sejteket háromszor mostuk hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). Ezután a sejteket lizáltuk 100 ul Passzív Lysis Buffer (Promega), és 15 percig rázzuk. A szentjánosbogár luciferáz és Renilla luciferáz tevékenységek mértük a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) egy Varioskan Flash-mikrolemez leolvasó (Thermo Scientific). "Relatív aktivitás" úgy definiáljuk, mint az arány a szentjánosbogár luciferáz aktivitást a Renilla luciferáz aktivitást, és kiszámítani, hogy a lumineszcencia intenzitás kapott az assay szentjánosbogár luciferáz által, hogy a Renilla luciferáz. Minden mérést három párhuzamossal végzett, és a vizsgálatokat háromszor ismételtük 293 T-sejtekben.

Statisztikai analízis

Valamennyi kísérletet megismételjük legalább három alkalommal. Az összes adatot átlag érték ± S.D. A különbség az eszközök analizáltuk a Student-féle t-teszt. Minden statisztikai analízist végeztük SPSS16.0 szoftver (Chicago, IL). Szignifikancia 5% -os szinten. Katalógusa

Támogató információ
ábra S1.
hatása mutált ATF4 kötőhelyek a tevékenység a SIRT1 promoter. 293T-sejteket együtt transzfektáltunk pCMV-ATF4 és a vad típusú SIRT1, SIRT1-MUT1, SIRT1-MUT2, vagy MUT1 + MUT2 riporter, és a relatív luciferáz aktivitást meghatározzuk. A luciferáz aktivitást az ál pCMV-Taq csoport jelölték 1.00. Az eredmények az átlag ± S.D. A három kísérlet párhuzamosban hajtjuk végre. *, P < 0,05. A bal oldalon egy sematikus ábrázolása a riporter gén konstrukciókat. Az oszlopdiagram a jobb oldalon képviseli a relatív szintje luciferázaktivitásának egyes transzfektált minták. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s001 katalógusa (TIF) hotelben szöveg S1.
Kiegészítő Anyagok és módszerek.
doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002 katalógusa (DOC) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönjük professzor Amy S. Lee kedves számunkra a pCMV5-ATF4 plazmid . Mi is köszönjük Mr. Taidong Qiao és Ms. Zheng Chen a kiváló technikai segítséget. Katalógusa

• PLoS One: genetikai hajlam a CagA kölcsönható molekulák és a gén-környezet interakciót fitoösztrogének: A feltételezett kockázati tényező gyomorrák
• PLoS One: S100A6 Protein negatívan szabályozza CacyBP /SIP-gátlást gyomorrák sejt proliferáció és tumorogenezisben