Фон
<р> множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) при раке желудка остается серьезной проблемой для клинического лечения. Активация фактора транскрипции 4 (ATF4) представляет собой ген, реакция на стресс участвует в гомеостаза и клеточной защиты. Тем не менее, выражение и функции ATF4 при раке желудка МЛУ остается неизвестной. В данном исследовании мы исследуем ли ATF4 играть определенную роль в желудочном MDR рака и его потенциальных механизмов.
Финансирование:. Это исследование была поддержана комбинированных грантов от Национального фонда естественных наук Китая (NO.81090270, NO.81090273 и NO.81000864), китайский научный фонд Постдокторское (NO.20100471776), Национальный ключ и Программа развития фундаментальных исследований Китая ( NO. 2010CB529302), а Национальный проект муниципального науки и технологии (2009ZX09103-667 и 2009ZX09301-009-RC06). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение ATF4 модулирует MDR фенотип клеток рака желудка ATF4 вверх регулирует экспрессию SIRT1, MDR1 , Bcl-2 и Вах в клетках рака желудка Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, участвующих в ATF4 связанных с МЛУ рака желудка, мы также исследовали MDR1, MRP, уровни экспрессии Bcl-2, и Bax в желудочном раковых клеток использовали выше. Как показано на рис. 2B, ATF4-опытный клетки экспрессируют более MDR1 по сравнению с контрольными клетками. В то же время, не очевидное различие в выражении MRP не было найдено ни в одной из этих клеточных линий. Интересно отметить, что оба Bcl-2 и Вах уровни экспрессии были повышающей регуляции в ATF4-опытными клетками, по сравнению с контрольной клеточной линии, в то время как экспрессия Bax показали лишь незначительные изменения, что свидетельствует о том, что повышающая регуляция на Bcl-2 к Bax отношение могло бы подавить медикаментозного апоптоз в ATF4-гиперэкспрессией клеток рака желудка. ATF4 трансактивирует SIRT1 активность промотора и напрямую связывается с SIRT1 промотор Подавление активности SIRT1 повторного сенсибилизирует ATF4 трансфицированные клетки агентов, повреждающих ДНК Обсуждение Таким образом, мы показали, что ATF4 придает фенотип MDR для клеток рака желудка, и этот эффект частично опосредуется трансактивации SIRT1 избыточной экспрессии. Кроме того, ATF4 является действительным объектом в опухолях с лекарственной устойчивостью желудка, а также разработка эффективных ингибиторов ATF4 должны быть приняты во внимание в будущем. Эти результаты дают новый взгляд на роль ATF4 в контроле экспрессии SIRT1 и в его функции стрессоустойчивость в онкогенеза и химиотерапии. Это особенно важно для клинического рассмотрения, поскольку ATF4 может быть вверх регулируется кислородное голодание, окислительный стресс, пищевые лишения и почти во всех неблагоприятных факторов стресса в микросреды опухоли, которые могут быть угнанных раковыми клетками, чтобы избежать ингибирования пролиферации и гибели клеток в ответ на химиотерапию. Поэтому вмешательство основывается на срыве стресс-индуцированной экспрессии ATF4 в раковых клетках может быть эффективным при движении задним ходом или обходя лекарственной устойчивости при раке желудка. клеточной культуры и реактивы линии желудка аденокарциномы человека SGC7901 (полученные из Академии Военно-медицинской науки, Пекин, Китай) и MDR варианты, SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR (устанавливается и поддерживается в нашей лаборатории) и AGS (полученные из клеточного банка китайской академии наук, Шанхай, Китай) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и пенициллин /стрептомицин. 293T-клетки (также полученные из клеточного банка Китайской академии наук), культивировали в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки. Для поддержания MDR фенотип, адриамицин (с конечной концентрацией 0,5 мкг /мл) и винкристин (с конечной концентрацией 1 мкг /мл) добавляли в культуральную среду для SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR клеток соответственно. ЕХ-527 (Sigma) растворяли в ДМСО при указанных концентрациях. Адриамицин (ADR), винкристин (VCR), цисплатин (CDDP), и 5-фторурацил (5-ФУ) растворяли в физиологическом растворе при указанных концентрациях. аннексина V окрашивания и FACS анализ фрагментация ДНК анализа Hoechst Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя (C0003, Beyotime Co. ). Клетки визуализировали с DP70 инвертный иммунофлюоресценции микроскопом (Olympus). Клетки с конденсированной и фрагментированных ядер были признаны апоптическая. Количественный реальный -time ПЦР (КПЦР) Репортер анализа гена Выражение признательности
<р> множественная лекарственная устойчивость, как правило, основной причиной неудач химиотерапии против злокачественных опухолей, включая рак желудка [1] .The термин множественная лекарственная устойчивость классически используется для определения устойчивости к фенотипу, где клетки приобретают устойчивость одновременно к различным наркотикам без какой Очевидно, структурное сходство и с различными клеточных мишеней [2]. МЛУ встречается чаще с новыми препаратами, которые имеют более значительную эффективность после их первого применения в лечении рака. Клиническая полезность нескольких препаратов ограничена как природного, так и приобретенной резистентности опухолевых клеток, которые почти всегда многофакторный характер [3]. Факторы, которые могут повлиять на чувствительность наркотиков включают в себя: ускоренное оттоку наркотиков, активацию и инактивацию наркотиков, изменения в мишени для лекарственного средства, метилирование ДНК, обработку повреждений медикаментозного и уклонением от апоптоза [4]
<р> рак желудка. относительно нечувствительна к химиотерапевтическим средствам. Механизмы MDR в клеток рака желудка, были широко исследованы в нашей лаборатории и в других местах [1], [4], [5], пока они полностью не выяснены, указывая, что другие неизвестные молекулы или пути могут быть вовлечены в развитие МДР
. <р> в клетках млекопитающих эукариотической перевод фактора инициации 2 α-субъединица (eIF2α) фосфорилируется различными eIF2α киназ в ответ на различные сигналы напряжения, в том числе аноксии /гипоксии, стресса эндоплазматического ретикулума, депривации аминокислоты и окислительному стресс. Это событие фосфорилирования приводит к быстрому уменьшению глобального биосинтеза белка в сочетании с индукцией трансляционной экспрессии генов, в том числе ATF4
что функция для облегчения повреждения клеток от стресса [6], [7]. Хотя ATF4 может играть проапоптотического роль в условиях сильного или продолжительного стресса, ATF4
является мощным стрессом отзывчивым ген как полагают, играет защитную роль, регулируя клеточную адаптацию к неблагоприятным обстоятельствам в ответ интегрированный стресс ( ИСР) [8], [9], [10]. В последнее время, избыточная экспрессия ATF4, как сообщалось, известный в самых разнообразных опухолей и для защиты опухолевых клеток от многочисленных стрессов, а также широкий спектр онкологических терапевтических агентов [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Потенциальные механизмы, ответственные за эту защиту включают аутофагии индукции, стимулирование восстановления повреждений ДНК, и повышающей регуляции внутриклеточного глутатиона [12], [13], [14], [17]. Тем не менее, выражение и функции ATF4 при раке желудка MDR остается неизвестной.
<Р> В этом исследовании мы сообщали, что ATF4 была значительно повышающей регуляции в ответ на МЛУ желудка раковых клеток по сравнению с клетками родительского контроля. Нокдаун ATF4
по миРНК значительно сенсибилизированные клетки с MDR к различным химиотерапевтических агентов, в то время как до регуляции ATF4 в SGC7901 и AGS клеток делает их множественной лекарственной устойчивостью. Мы также показали, что способствовало ATF4 рака желудка MDR частично через повышающей регуляции экспрессии SIRT1. И ингибирование SIRT1 может частично обратить вспять рак желудка MDR фенотип, опосредованный ATF4. Эти данные свидетельствуют о том, что таргетинг ATF4 может обеспечить новый терапевтический вариант для реверсирования клинического рака желудка MDR.
Результаты
<р> Для того, чтобы определить, является ли ATF4 участвует в развитии МЛУ в клеток рака желудка, уровни ATF4 были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга и кПЦР в SGC7901 клеточной линии и ее варианты МДР, SGC7901 /VCR и SGC7901 /ADR. Оба уровня белка и мРНК ATF4 были в клеточных линиях, устойчивых к гораздо выше, чем в родительских клетках (рис. 1А).
<Р> Для того, чтобы исследовать вопрос о том, достаточно, чтобы вызвать фенотип MDR в раковых клетках желудка ATF4 избыточная экспрессия, ATF4
кДНК экспрессии стабильно трансфицировали в SGC7901 и AGS клетки. Во-первых, чувствительность ЦДДП тестировали с использованием анализа образования колоний. Как показано с помощью количественного анализа образования колоний, ATF4 избыточная экспрессия привела к почти 3-кратное увеличение численности колоний по сравнению с пустыми векторно-экспрессирующих клеток (рис. 1, б). МТТ анализы также показали, что IC <суб> 50 значений SGC7901-ATF4 для ADR, VCR, CDDP и 5-ФУ были значительно увеличены по сравнению с пустыми вектор трансфицируют клетки (рис. 1D).
<Р> Как уровни ATF4 повышен в множественной лекарственной устойчивостью клеток рака желудка, мы также хотели, чтобы определить, является ли таргетинг ATF4 может повторно сенсибилизировать линии клеток с множественной лекарственной устойчивостью. Нокдаун <ЕМ> ATF4 Ру по миРНК в клетках SGC7901 /ADR и SGC7901 /VCR приводило к 2-х до 3-кратное снижение числа клеток при использовании в сочетании с CDDP (фиг. 1в). Данные на рис. 1E также предполагают, что понижающую регуляцию ATF4
значительно изменяет устойчивость клеток SGC7901 /ADR в ответ на химиотерапию.
<Р> Как ингибирование апоптоза является одним из важных механизмов МЛУ, мы также исследовали способность клеток к SGC7901 /ADR, трансфецированных с удельным ATF4
миРНК пройти CDDP-индуцированный апоптоз путем Hoechst окрашивания и фрагментации ДНК анализов. Лечение SGC7901-ATF4 и SGC7901 /сот ADR-SCR с указанными концентрациями CDDP в течение 36 часов не вызывали каких-либо апоптоз, как оценено с помощью Hoechst ядерного окрашивания (рис. 1F) и фрагментации ДНК анализов (рис. 1 г). В противоположность этому, SGC7901-Vector и SGC7901 /ADR-siATF4 клетки обнаруживают значительное апоптоз, с более частым появлением конденсированной и фрагментированных ядер и формирования ДНК лестничного. Кроме того, было отмечено более очевидным расщепление прокаспазы-3 после обработки CDDP в SGC7901-Vector и SGC7901 /клеток ADR-siATF4 по сравнению с SGC7901-ATF4 и SGC7901 /ADR-SCR клеток соответственно (рис. 1 H).
<р> в совокупности эти результаты указывают на то, что ATF4 дает фенотип MDR для клеток рака желудка и что нацеливание ATF4 обеспечивает способ сенсибилизации клеток, устойчивых к химической обработке.
<р> Предыдущие исследования показали, что клетки сверхэкспрессией SIRT1 отображается пониженной чувствительности к химиотерапии по нескольким механизмам [18], [19], [20], [21]. Нам было интересно, чтобы определить, является ли <ЕМ> SIRT1
, которая представляет собой ген, связанного со стрессом решающее значение для развития МЛУ, может быть ниже по течению мишенью ATF4 ответственным за опосредование ATF4-индуцированной МЛУ в клеток рака желудка.
<Р> уровни SIRT1 в LV-Vector и LV-ATF4 стабильно трансфицированные SGC7901 клетки анализировали с помощью кПЦР и Вестерн-блоттинга. Сверхэкспрессия ATF4 связана с увеличением экспрессии SIRT1 как на транскрипционном, так (рис. 2А, слева) и уровни поступательных (рис. 2В, слева). В противоположность этому, миРНК нокдаун ATF4
в клетках SGC7901 /ADR привело к значительному уменьшению эндогенного Sirt1
выражении (рис. 2А и 2В, справа). Эти результаты свидетельствуют о том, что ATF4 вверх регуляцию Sirt1
выражение в раковых клетках желудка.
<р> Эти результаты указывают на то, что способствует ATF4 MDR способность клеток рака желудка через множество механизмов.
<р> для того, чтобы определить, является ли ATF4 опосредует Sirt1
транскрипцию генов, клетки 293Т котрансфицируют с 1,2 кб Sirt1
промоутер репортер плазмида и ATF4
выражение плазмиды. Анализ люциферазы показал, что Sirt1
активность промотора заметно активизируется ATF4 в зависимости от дозы (фиг. 3, а).
<Р> В попытке получить конкретное представление о механизмах Sirt1
индукции, мы рассмотрели возможные пути индукции от ATF4. На основе анализа 5'-фланкирующей последовательность Sirt1
ген с биоинформатики программного обеспечения (Tfsitescan обслуживание, TESS и Genomatix), два места связывания ATF4 предположительные были определены в п.о. области -950 до -600 из Sirt1
промотор (рис. 3В).
<р> Чтобы определить SIRT1
является ли прямой мишенью ATF4, фишку с ATF4 антитела с использованием SGC7901-ATF4 клетки показали обогащение обоих сайты связывания внутри Sirt1
промоторной области, указывая, что РНК и последующий уровень белка увеличивается на SIRT1
в ATF4 экспрессирующих клеточных линий, вероятно, из-за прямого взаимодействия с ATF4 ген SIRT1
промотор (рис. 3C).
<р> чтобы исследовать роль этих двух сайтов связывания ATF4 в регуляции SIRT1 трансактивация, сайт-направленный мутагенез был использован для мутировать этих сайтов. Люциферазы репортер показал, что либо мутирует сайт связывания 1 или сайт связывания 2 уменьшил SIRT1 промотор активности, вызванной ATF4. Кроме того, мутации обоих сайтов связывания отменила SIRT1 активность промотора. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба ATF4 сайты связывания участвуют в трансактивации SIRT1 промотора (рис. S1).
<Р> Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что SIRT1 является прямым транскрипционной мишенью ATF4.
SIRT1
ингибирование миРНК частично изменяет фенотип MDR ATF4-гиперэкспрессией клеток рака желудка
<р> идентификация ATF4-опосредованной Sirt1
увеличивает уровень экспрессии в клетках рака желудка, побудило нам проанализировать роль этого пути в желудочном MDR рака. Для решения этой проблемы, мы сравнили в пробирке
чувствительности к лекарственным препаратам в ATF4 стабильно трансфицированных клеток рака желудка после трансфекции Sirt1
миРНК или платные каналы миРНК путем образования колоний и МТТ анализов. Нокдаун <ЕМ> SIRT1 Ру по миРНК в SGC7901-ATF4 клеток приводило к &ГТ с; уменьшение числа колоний на 40% при использовании в комбинации с ЦДДП (. Фиг.4а, верхние). Этот эффект также наблюдался в клетках AGS-ATF4 (рис. 4А, ниже). Кроме того, данные анализа МТТ также показали, что нокдаун SIRT1
может вновь привлечь внимание SGC7901-ATF4 клетки к химиопрепаратов, но этого не произошло в яичницей миРНК трансфекции клеток (рис. 4б).
<р> Для того, чтобы определить, защищает ли SIRT1 клетки от CDDP-индуцированного апоптоза, SGC7901-ATF4 клетки, трансфицированные SIRT1
миРНК или зашифрованным миРНК обрабатывали CDDP и метили аннексина V и PI. Апоптические клетки были идентифицированы с помощью аннексина V маркировки. Апоптическая процент SIRT1 миРНК трансфицируют SGC7901-ATF4 клеток была значительно выше, чем у контрольных клеток (рис. 5A, 72,8% против 25,9%). Возникновение конденсированной и фрагментированных ядер была также увеличена в SIRT1 миРНК трансфекции клеток по сравнению с контрольными клетками (рис. 5б). Кроме того, расщепление прокаспазы-3 наблюдалось уже через 12 ч после обработки 10 мкг /мл CDDP в SIRT1 миРНК трансфицируют SGC7901-ATF4 клетки, но не в закодированных миРНК обработанных клеток, даже через 24 ч лечения ЦДДП (рис. 5C ). Эти результаты свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия SIRT1 подавляет CDDP-индуцированный апоптоз.
<Р> Чтобы изучить влияние понижающей регуляции SIRT1 с помощью миРНК на МЛУ ассоциированных молекул, мы исследовали MDR1, MRP, Bcl-2 и Вах уровни экспрессии в SGC7901-ATF4 клеток после трансфекции с SIRT1 миРНК или зашифрованным миРНК. Понижающую регуляцию MDR1 наблюдалась в SIRT1 миРНК-обработанных клеток (фиг. 5D) по сравнению с контрольными клетками. В отличие от этого, не очевидное отличие от MRP, Bcl-2, а также уровни экспрессии Bax не было обнаружено между образцами.
<Р> Эти наблюдения указывают на то, что SIRT1, опосредует ATF4-индуцированной MDR эффект в клеток рака желудка.
<р> для того, чтобы представить доказательства, что SIRT1 каталитическая активность также отвечает за ATF4 индуцированных клеток MDR, SGC7901-ATF4 были предварительно обработаны с EX-527 , новым, мощным и специфический ингибитор малой молекулы SIRT1, и с последующей обработкой с различными химическими препаратами. Во-первых, мы определили базальный цитотоксичность EX-527 в LV-Vector и LV-ATF4 стабильно трансфицированные SGC7901 клеток. МТТ-анализе показал, что EX-527 в концентрации до 10 мкМ не ингибируют, а скорее слегка увеличена, жизнеспособность обеих клеточных линий (фиг. 6А). Далее, мы исследовали SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, а также уровни экспрессии Bax после инкубации 24 часов с или без указанных доз EX-527 в желудочном раковых клеток, используемых выше. Только выражение MDR1 были подавлялась при EX-527 в зависимости от концентрации (рис. 6, б). Тогда мы преинкубировали SGC7901-ATF4 клетки с транспортным средством или EX-527 (0,5, 1, 2, 4, и 10 мкМ) в течение 24 часов, а затем CDDP- и 5-ФУ-опосредованной гибели клеток контролировали. Как показано на рис. 6C, ЕХ-527 значительно усиливается цитотоксичность обоих препаратов в зависимости от дозы образом. Мы также определили возможный синергетический эффект EX-527 на различных доз CDDP- и 5-FU-опосредованного ингибирования клеточной пролиферации в клетках SGC7901-ATF4. Как и ожидалось, 10 мкМ ЕХ-527 является достаточным для потенцирования цитотоксичности обоих препаратов (рис. 6d).
<Р> Эти результаты свидетельствуют о том, что SIRT1 активность также играет решающую роль в ATF4 индуцированных желудка MDR рака и этот роль может быть опосредовано частично за счет экспрессии MDR1.
<р> MDR создает значительные клинические проблемы для эффективной химиотерапии многих злокачественных опухолей человека. Механизмы, с помощью которых клетки приобретают устойчивость многочисленны и сложны, поэтому более широкое понимание их, а также выявление новых механизмов химиорезистентности, будет особенно полезным в предоставлении лучших терапевтических возможностей. Это исследование является первым сообщением, что высокие уровни ATF4, часто наблюдается в опухолевых клетках при стрессовых обстоятельствах, наделяет желудочные раковые клетки с фенотипом МЛУ, и она определяет, что этот эффект опосредуется частично за счет трансактивации экспрессии SIRT1.
<Р> ATF4
и SIRT1
эволюционно законсервированные гены реакция на стресс, участвующих в широком спектре биологических процессов, многие из которых являются благотворным для гомеостаза и клеточной защиты [22], [23], [ ,,,0],24]. Оба этих генов индуцируются в ответ на различные нагрузки, включая лишение кислорода (гипоксия /гипоксией), окислительный стресс, повреждение ДНК, пищевой депривации и Chemotoxic стресса. Левенсон В.В. <ЕМ> и др.
Впервые сообщили, что изменения в экспрессии ATF4 может играть определенную роль в плейотропному устойчивости к различным классам ДНК-нацеливание препаратов [16]. В последние годы в ряде исследований было установлено, что ATF4 был вовлечен прямо или косвенно в развитии лекарственной устойчивости через аутофагии, глутатион-зависимой окислительно-восстановительной системы, и ремонт повреждения ДНК [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Здесь мы покажем, что защитная способность ATF4 действительно медиатором фенотип MDR в ATF4-гиперэкспрессией желудка линий раковых клеток в ответ на химиотерапию. Наши результаты ясно показывают, что избыточная экспрессия ATF4 в желудочном раковых клеток было связано с большим сопротивлением, в то время как нокдаун ATF4 индуцированной повторной сенсибилизации. Эти данные свидетельствуют о том, что ATF4, вероятно, является важным посредником вниз по течению сопротивления, вызванное различными механизмами и поэтому является ценным терапевтической мишенью. Тем не менее, в качестве одного из наиболее важных транскрипционных медиаторов ISR, который активирует различные гены-мишени, которые способствуют восстановлению гомеостаза, ATF4 может также опосредуют сопротивление другими механизмами. В нашем исследовании, SIRT1, было установлено, что вверх регулируется в ATF4-гиперэкспрессией клеток по сравнению с векторными трансфицированных клеток. В противоположность этому, нокдаун ATF4
с ATF4 специфической миРНК привело к понижающей регуляции SIRT1 в МЛУ раковых клетках желудка. Наши результаты свидетельствуют о том, что SIRT1 может быть ниже по течению посредником ATF4-индуцированного рака желудка MDR.
<Р> Как член АТФ подсемейства базового региона лейцин молнии (BZIP) факторы транскрипции [22], ATF4 имеет потенциал, чтобы действовать либо как транскрипционный активатор или репрессор транскрипции через ATF или цАМФ реагировать элемент (CRE) сайтов связывания [22]. Сайт связывания консенсуса в отношении ATF был определен как TGACGT (C /A) (G /A) [27], которая представляет собой последовательность, идентичную с CRE консенсусной элемента (TGACGTCA) [28]. Кроме того, высоко консервативны ядро мотив - ACGT - в большинстве Цреса [29] может связываться с различными факторами BZIP, в зависимости от фланговых основ основного мотива [22], [30], [31]. В нашем исследовании двух предполагаемых сайтов связывания АТФ-CRE были найдены в 1,2 кб Sirt1
область промотора и ATF4 непосредственно активируется Sirt1
транскрипции путем связывания с обоих связывающих элементов. Тем не менее, как эти два места связывания играют свою роль при детальных стрессовых условиях остается неизвестным и требует дальнейшего изучения.
<Р> млекопитающим SIRT1
ближайший гомолог дрожжей Sir2
и наиболее широко изучается член семьи СИРТ. Это в значительной степени участвует в регуляции клеточных процессов, определяющих продолжительность жизни, в том числе антиапоптоз, нейрональной защиты и клеточного старения или старения [32]. В последнее время все большее число исследований замешан повышенная экспрессия SIRT1 с устойчивостью к химиотерапии и ионизирующего излучения [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Например, SIRT1 суперэкспрессия было обнаружено в лекарственной устойчивостью нейробластома, остеосаркома, молочной железы, яичников, предстательной железы, толстой кишки и линий рака легких клеток по сравнению с их чувствительных к медикаментам коллегами. Все эти устойчивые эффекты препарата из SIRT1 могло быть связано с его антиапоптической эффект [37], [38] и молчанием генов-супрессоров опухолей [39]. И, наконец, можно было бы предсказать, что, если SIRT1 участвует в ATF4-индуцированной MDR, ингибирование SIRT1 должно влиять на чувствительность ATF4-гиперэкспрессией клеток в ответ на химиотерапию. Как и следовало ожидать, как миРНК и фармакологическое ингибирование SIRT1 может вновь привлечь внимание ATF4-гиперэкспрессией клетки к химиопрепаратов. Кроме того, наше исследование показывает, что SIRT1 защищает клетки от смерти частично через антиапоптической эффект.
<Р> Сообщалось, что MDR1 был повышающей регуляции в клетках с повышенной экспрессией SIRT1 [18], [36]. В этом исследовании мы также показали, что MDR1 вверх-регулируется в ATF4-гиперэкспрессией клеток, и нокдаун SIRT1 с SIRT1 специфической миРНК или ингибирования его активности с EX-527 может привести к понижающей регуляции MDR1, что согласуется с лекарственным средством резистентные роль по SIRT1. Тем не менее, соотношение /Вах Bcl-2, который был повышающей регуляции в ATF4-гиперэкспрессией клетках, был SIRT1-независимым, предполагая, что SIRT1-независимые механизмы также играют определенную роль в ATF4-индуцированной МЛУ в клеток рака желудка.
Материалы и методы исследования
<р> Подробную информацию о способах, смотрите текст S1 .
трансфекции клеток и стабильные клеточные линии
<р> The человек ATF4
выражение плазмида (pCMV5-ATF4) был любезно предоставлен профессором Эми С. Ли [25]. Лентивирусов вектор, кодирующий siРНК, специфичную <ЕМ> ATF4
и миРНК управления генерировались с использованием PLKO.1-TRC (Addgene) и были обозначены как LV-siATF4 и контроля LV-SCR, соответственно. Лентивирусов вектор ген, кодирующий человеческий ATF4 были построены в FUW-Teto (Addgene), обозначенный как LV-ATF4. Пустой вектор был использован в качестве отрицательного контроля, обозначенной как LV-Vector. Стабильные клеточные линии были получены путем трансфекции указанных лентивирусов конструкций, с последующим отбором на пуромицин или зеоцином (Invitrogen), соответственно. Трансфекции клеток и формирование стабильных клеточных линий были выполнены с использованием стандартных процедур. Последовательности киРНК конструкций, можно найти в текстовом S1.
иммуноблоттинг
<р> Сбор белковых экстрактов и иммуноблоттинга анализ проводили с использованием стандартных процедур. Для источников антител см Text S1.
Colony Анализ образования
<р> Анализ образования колоний проводили, как описано ранее [40], с небольшими изменениями (Text S1).
<р> аннексина V окрашивание и анализ FACS проводили с использованием стандартных процедур. Клетки отрицательные как для PI и аннексина V окрашивания были классифицированы как живые клетки, клетки, которые окрашивали позитивно для аннексина V только были классифицированы как ранних апоптотических клеток, и PI положительные и аннексина V положительные клетки клеток, подвергающихся поздних стадиях апоптоза.
<р> фрагменты ДНК экстрагировали с Extraction Kit ДНК Ladder с ротационную колонку (C0008, Beyotime Co., Пекин, Китай) в соответствии с протоколом производителя. Фрагменты ДНК разделяли с помощью гель-электрофореза на агарозном геле 1%, содержащего 0,1 мкг /мл этидий бромид.
Hoechst окрашивания
В пробирке
лекарственная чувствительность анализа
<р> ADR, VCR, CDDP и 5-ФУ были все свежеприготовленный перед тем каждый эксперимент. лекарственную чувствительность измеряли с использованием 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ) в соответствии со стандартным протоколом (текст S1).
<р> Количественная ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы LightCycler 480 II (Roche) и SYBR Green обнаружения (Takara). Последовательности праймеров можно найти в Text S1.
иммунопреципитации хроматина (ЧИП) анализ
<р> ChIP анализы проводили в соответствии с протоколом производителя (P2078, Beyotime Co.) с небольшими изменениями. Хроматина растворы обрабатывают ультразвуком и инкубируют с анти-ATF4 или с контрольным IgG, и вращали в течение ночи при температуре 4 ° С. ДНК-белковые сшивки были полностью изменены и хроматина ДНК очищали и подвергали анализу ПЦР. Праймеры 5'-ACC CCT ВКТ ТТТ АСА ТСТ-3 'и 5'-ТТТ GGA GTC CTT CCT ТТС-3' были использованы для усиления Sirt1
последовательность дистальный промотор (A1, нуклеотиды -974 до - 843), а также праймеры 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'и 5'-CCT CCT GGG AAG ACC ТТТ-3' были использованы для усиления Sirt1
проксимальный промотор последовательности (А2, нуклеотиды -781 до -647). Праймеры для GAPDH
, 5'-ТАС TAG CGG ТТТ TAC ГГГ CG-3 'и 5'-TCG AAC AGG AGG АРУ АГА ГАГ ГОС-3', были использованы в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля для взаимодействия ATF4-ДНК, праймеров 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC АТ-3 'и 5'-CGC ТТА ТАС ГОС ССТ ГГЦ ТСС Т-3', которые предназначены для усиления аспарагин синтетазы ( ASNS
) область промотора, который содержит по меньшей мере два участка, сообщенные связать ATF4 [41], также были использованы. После амплификации продукты ПЦР разделяли на агарозном геле 1,5% и визуализировали посредством окрашивания бромистым этидием
<р> 1,2 кб человек Sirt1
промоторной последовательности (. - 1100 + 100 пар оснований) был синтезирован и клонирован в сайты XhoI и HindIII в pGL3-Базового вектора. Полученная конструкция была подтверждена секвенированием ДНК. 293T-клетки затем совместно трансфецировали <ЕМ> Sirt1
промотор репортерной плазмидой, плазмиду PRL-TK (Promega, США), а pCMV5-ATF4 плазмиду, с помощью Lipofectamine2000 (Invitrogen). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки промывали три раза холодным фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Затем клетки лизируют в 100 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega) и встряхивают в течение 15 минут. Светлячок люциферазы и люциферазы деятельность Renilla измеряли с помощью двойного люциферазы системы репортер анализа (Promega) с микропланшетов читателя Varioskan вспышки (Thermo Scientific). "Относительная активность" определяется как отношение светлячка активности люциферазы в рениллы активность люциферазы и вычисляли путем деления интенсивности люминесценции, полученной при анализе для люциферазы светлячка тем самым люциферазы Renilla. Все измерения проводились в трех экземплярах, и анализы были повторены три раза в 293 Т-клеток.
Статистический анализ
<р> Каждый эксперимент повторяли по меньшей мере три раза. были представлены все данные в виде среднего значения ± S.D. Разница между средствами анализировали с помощью критерия Стьюдента. Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения SPSS16.0 (Чикаго, Иллинойс). Значение был установлен на уровне 5%.
Поддержка информации Рисунок S1
.
Влияние мутировавших ATF4 сайтов связывания на активность промотора SIRT1. 293T клетки котрансфицируют PCMV-ATF4 и дикого типа SIRT1, SIRT1-Mut1, SIRT1-Mut2 или Mut1 + Mut2 репортер, а относительная активность люциферазы была определена. Активность люциферазы из фиктивного группы PCMV-Taq была обозначена как 1,00. Результаты представляют собой среднее значение ± S.D. из трех опытов, проведенных в двух экземплярах. *, P &л; 0,05. Левая сторона представляет собой схематическое изображение гена репортерных конструкций. Гистограммы на правой стороне представляют относительные уровни активности люциферазы в каждом из трансфицированных образцов
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
Text S1.
Дополнительные Материалы и методы.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)
<р> Мы благодарим профессора Эми С. Ли за любезно предоставленные нам плазмиды pCMV5-ATF4 , Мы также благодарим г Taidong Цяо и г-жу Чжэн Чэнь за отличную техническую помощь.
Микробы могут предсказать летальный исход у пациентов с COVID-19 на ИВЛ
Пищевые продукты, улучшающие работу кишечника, могут положить конец детскому недоеданию во всем мире
Как массовые обследования помогли выявить больше случаев глютеновой болезни у детей
DeNovix объявляет победителя конкурса на спектрофотометр / флуорометр Platinum DS11 FX +
Микробы легких могут помочь предсказать исходы у тяжелобольных
Растительные диеты улучшают здоровье сердца за счет микробиома кишечника
Домашние собаки вряд ли будут передавать SARS-CoV-2,
говорят исследователи Исследователи из Испании и Германии провели исследование, показывающее, что домашние собаки вряд ли будут способствовать передаче и распространению среди населения тяжелого остро
Кесарево сечение полезно для здоровья детей?
Недавнее исследование, опубликованное Институтом экономических исследований VATT, предполагает, что незапланированная CS, выполненная по показаниям, которых, возможно, можно было избежать, имеет причи
Бактериофаги могут лечить кишечную палочку, не повреждая кишечник,
новое исследование говорит Исследователи из США разработали новую терапию, в которой для лечения инфекций, вызванных кишечной палочкой, используется уникальный бактериофаг. Было обнаружено, что бактер