Plos ONE: Aktiviranje Transcription Factor 4 daje rezistenco fenotip do želodca raka celice skozi transaktivacije od SIRT1 izražanja

Povzetek

Ozadje

rezistenco (MDR) v raka želodca ostaja velik izziv za kliničnem zdravljenju. Aktiviranje transkripcijski faktor 4 (ATF4) je odziv stres gen vključen v homeostaze in celično zaščito. Vendar pa izraz in funkcija ATF4 na raka želodca MDR ostaja neznan. V tej študiji smo raziskali, ali ATF4 vlogo pri želodčnem MDR raka in njegovih možnih mehanizmov.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Pokazali smo, da ATF4 prekomerno podeljeni MDR fenotip do želodca rakavih celicah, rasklapanje od ATF4 v MDR medtem variante povzročil ponovno preobčutljivost. V tej študiji smo pokazali tudi, da je NAD ^{+ - odvisno histon deacetilaze SIRT1 je potrebna za-ATF4 povzroča MDR učinek v želodcu rakavih celic. Pokazali smo, da ATF4 olajšala MDR v želodčnih rakavih celic z direktno vezavo na promotor SIRT1, kar SIRT1 regulacijo navzgor. Pomembno je, da zaviranje SIRT1
jih male interferenčne RNA (siRNA) ali specifični zaviralec (EX-527) ponovno uvedel terapevtske občutljivost. Prav tako je bilo povečano Bcl-2 /Bax razmerje in MDR1 nivo izražanja našel v-ATF4 prekomerno ekspresijo celic.}

Sklepi /Pomen

Pokazali smo, da je imel ATF4 ključno vlogo pri uravnavanju MDR v želodčnih rakave celice v odziv na kemoterapijo in te ugotovitve kažejo, da lahko ciljanje ATF4 lajšanje terapevtski odpornost na raka želodca

Navedba. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et al. (2012) Aktiviranje Transcription Factor 4 daje rezistenco fenotip do želodca raka celice skozi transaktivacije za SIRT1 izraza. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10,1371 /journal.pone.0031431

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 5. september 2011; Sprejeto: 8. januar 2012; Objavljeno: 17. februar 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je bila podprta s kombiniranimi nepovratnih sredstev iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (NO.81090270, NO.81090273 in NO.81000864), kitajski Podoktorski Science Foundation (NO.20100471776), National Key in Basic program za raziskave razvoj Kitajske ( NO. 2010CB529302) in Nacionalni Občinski Science and Technology Project (2009ZX09103-667 in 2009ZX09301-009-RC06). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rezistenco je ponavadi glavni vzrok za neuspeh kemoterapije proti malignih tumorjev, vključno z rakom želodca [1] Odprta izraz rezistence je klasično uporablja za opredelitev odpornost fenotip, kjer celice postanejo odporni hkrati z različnimi zdravili, ki so brez očitno strukturno podobnost in z različnimi celičnih tarč [2]. MDR se pojavlja pogosteje pri novih zdravil, ki imajo bolj pomembno učinkovitost po prvem uporabo pri zdravljenju raka. Klinična uporabnost različnih zdravil je omejena tako naravne in pridobljene odpornosti celic tumorja, ki je skoraj vedno je več dejavnikov v naravi [3]. Dejavniki, ki lahko vplivajo na občutljivost drog, vključujejo: pospešeno izločanje drog, aktiviranje z drogami in inaktivacijo, spremembe v cilju drog, DNA metilacije, obdelavo škode zaradi droge, in izogibanje apoptoze [4]

raka želodca. je razmeroma neobčutljiv na kemoterapevtiki. Mehanizmi MDR v želodcu rakavih celic so bile v veliki meri raziskana v našem laboratoriju in drugod [1], [4], [5], ki še niso bili v celoti pojasnjeni, kar pomeni, da se drugi neznane molekule ali poti lahko sodelujejo pri razvoju MDR.

v celicah sesalcev, evkariontska prevajanje začetek faktorja 2 α podenote (eIF2α) fosforilirajo z različnimi eIF2α kinaze v odgovor na različne stresne signalov, vključno anoksije /hipoksijo, endoplazemski retikulum stresa, aminokislinski odvzem in oksidativno stres. Ta fosforilacija dogodek vodi do hitrega zmanjšanja svetovne biosinteze beljakovin istočasno z indukcijo translacijske izražanja genov, vključno s ATF4
ki deluje ublažiti poškodbe celic s stresom [6], [7]. Čeprav se lahko ATF4 igrajo pro-apoptotske vlogo v pogojih hude ali dolgotrajne stres, ATF4
je močan stres odzivno gen mislil, da imajo zaščitno vlogo, ki jo ureja celično prilagajanja neugodnih okoliščinah v odziv na integriran stresa ( ISR) [8], [9], [10]. Nedavno je bilo sporočeno, da je vidno v različnih tumorjev in za zaščito tumorske celice pred več napetosti, kot tudi vrsto raka terapevtskih sredstev [11], [12] čezmernim ATF4, [13], [14] [15] [16] [17]. Potencialni mehanizmi, ki so odgovorni za to varstvo vključujejo avtofagija indukcija, spodbujanje poškodbe DNK popravila in up-regulacije znotrajcelične glutationa [12], [13], [14], [17]. Vendar pa izraz in funkcija ATF4 na raka želodca MDR ostaja neznan.

V tej raziskavi smo poročali, da je bil ATF4 močno reguliran v odzivu MDR želodca rakavih celic v primerjavi s starševskega nadzora celic. Rasklapanje za ATF4
s siRNA precej občutljivi celice MDR do različnih kemoterapevtikov, medtem up-ureditev ATF4 v SGC7901 in AGS celic naredilo multirezistentne. Prav tako se je pokazalo, da ATF4 spodbuja raka želodca MDR delno z up-regulacijo izražanja SIRT1. In zaviranje SIRT1 lahko delno obrnilo v želodcu raka MDR fenotip ki jo posreduje ATF4. Ti podatki kažejo, da ciljanje ATF4 lahko zagotovi nov terapevtski možnost za vzvratno klinični raka želodca MDR.

Rezultati

ATF4 modulira MDR fenotip želodčnih rakavih celic

Če se ugotovi, ali ATF4 sodeluje pri razvoju MDR v želodčnih rakavih celic, so bile ravni ATF4 zazna Western blot in qPCR v SGC7901 celične linije in njeno MDR variante, SGC7901 /VCR in SGC7901 /ADR. Oba vsebnosti beljakovin in mRNA za ATF4 so v celičnih linijah, odpornih na precej višji kot pri starševskih celic (sl. 1A).

Da bi raziskali, ali je ATF4 prekomerno zadostuje za sprožanje MDR fenotip pri želodčnih rakavih celicah, ATF4
izraz cDNA je stabilno transfektirali v SGC7901 in AGS celic. Prvo, občutljivost CDDP smo testirali s testom za nastanek kolonij. Kot je razvidno iz kvantifikacijo oblikovanja testom kolonije, ATF4 čezmernim povzročila skoraj 3-kratno povečanje števila kolonij v primerjavi s praznimi vektorskih izražanje celic (sl. 1B). MTT testi navedla tudi, da je IC _{50 vrednosti SGC7901-ATF4 za ADR, VCR, CDDP in 5-FU so znatno povečal v primerjavi s praznimi vektorske transfekcije celic (sl. 1D).}

Kot ravni ATF4 so povišano MDR raka želodca celice, smo še dodatno želeli ugotoviti, ali ciljnih ATF4 lahko ponovno osveščanje celičnih linij MDR. Rasklapanje za ATF4
s siRNA v celicah SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR privedle do 2- do 3-kratno zmanjšanje števila celic, kadar se uporablja v kombinaciji z CDDP (sl. 1C). Podatki na sliki. 1E tudi kažejo, da dol ureditev ATF4
bistveno obrne odpornost SGC7901 /ARS celice kot odgovor na kemoterapijo.
Kot je zaviranje apoptoze eden od pomembnih mehanizmov MDR, smo tudi raziskovali

zmogljivost /ADR celic SGC7901 transfekciji s posebnimi ATF4
siRNA opraviti CDDP inducirano apoptozo Hoechst obarvanje in fragmentacije DNK testi. Zdravljenje SGC7901-ATF4 in SGC7901 /ADR-SCR celic z označenimi koncentracijami CDDP za 36 ur ni povzročil nobene apoptozo, kot jo je ocenil Hoechst jedrske barvanjem (sl. 1F) in fragmentacije DNK testi (sl. 1G). V nasprotju s tem, SGC7901-Vector in SGC7901 /ARS-siATF4 celice prikaže pomemben apoptozo, s pogostejšo pojavnostjo zgoščenih in razdrobljenih jeder in nastanek DNA lestvice. Poleg tega je bilo opaziti bolj očitna cepitev procaspase-3 po zdravljenju z CDDP v SGC7901-Vector in SGC7901 /ADR siATF4 celic v primerjavi z SGC7901-ATF4 in SGC7901 /ADR-SCR celic, oz (sl. 1 H).

Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da ATF4 daje MDR fenotip na želodcu rakavih celic in da ciljanje ATF4 zagotavlja metodo, ki povzroča preobčutljivost odporne celice kemične obdelave.

ATF4 up-uravnava izražanje SIRT1, MDR1 Bcl-2, in Bax v želodčnih rakavih celic

Prejšnje študije so poročali, da celice s prekomerno ekspresijo SIRT1 prikazana zmanjšana občutljivost za kemoterapijo na več načinov [18] [19] [20] [21]. Bili smo radovedni, da se ugotovi, ali SIRT1
, ki je povezan s stresom gen bistvenega pomena za razvoj MDR, je lahko cilj dolvodno od ATF4 odgovoren za posredovanje-ATF4 povzroča MDR v želodčnih rakavih celic.

ravni SIRT1 v LV-Vector in LV-ATF4 stabilno transficirane SGC7901 celice smo testirali s qPCR in Western blot. Prevelike količine ATF4 je bila povezana s povečano izražanje SIRT1 tako na transkripcijski (sl. 2A, levo) in ravni translacijskih (sl. 2B, levo). V nasprotju s tem, siRNA rasklapanje za ATF4
in SGC7901 /ARS celic je povzročilo znatno zmanjšanje endogenega SIRT1
izražanja (sl. 2A in 2B, desno). Ti rezultati kažejo, da ATF4 up regulira SIRT1
izraz v želodcu rakavih celic.

Da bi še dodatno raziskati molekularne mehanizme, ki sodelujejo pri povezanih z ATF4 MDR raka želodca, smo pregledali tudi MDR1, MRP, bcl-2, in Bax stopnje izraženosti v želodcu rakavih celic oglase. Kot je prikazano na sliki. 2B, ATF4-obvladajo celice izražena več MDR1 v primerjavi s kontrolnimi celicami. Medtem, ni bila očitna razlika v MRP izražanja najdemo v katerem koli od teh celičnih linij. Zanimivo je, da sta oba Bcl-2 in Bax ekspresijski nivoji navzgor regulirano v ATF4-obvladajo celic v primerjavi s linij nadzor celic, medtem ko je izraz Bax pokazala le majhne spremembe, kar kaže, da je navzgor regulacija Bcl-2, Bax razmerje lahko zavirajo apoptozo drog psihomotorične-ATF4 čezmerno izraženim želodca rakavih celic.

Ti rezultati kažejo, da ATF4 spodbuja MDR možnost želodčnih rakavih celic skozi več mehanizmov.

ATF4 transactivates SIRT1 promotor dejavnosti in neposredno veže na SIRT1 promotor

Če želite ugotoviti, ali ATF4 posreduje SIRT1
gen prepis, so 293T celice so-transfekciji s 1,2 kb SIRT1
promotor reporter plazmida in ATF4
plazmidov. luciferaza reporter Test je pokazalo, da je SIRT1
promotor dejavnost je izrazito aktivira ATF4 na način, ki je odvisen od doze (sl. 3A).

V poskusu, da bi pridobili poseben vpogled v mehanizme SIRT1
indukcija, smo pregledali možno indukcijo poti iz ATF4. Z analizo 5'-bočno sekvenco od SIRT1
gen z bioinformatskih programski opremi (Tfsitescan storitev, TESS in Genomatix), dve ATF4 domnevnih vezavnih mest so bile ugotovljene v bp regiji -950 do -600 od SIRT1
promotor (sl. 3B).

Če želite ugotoviti, ali em> SIRT1
je SIRT1
promotorja regiji, kar kaže, da je RNK in posledično ravni beljakovin zvišanja SIRT1
in-ATF4 izražanje celičnih linijah, so verjetno posledica neposredne povezanosti ATF4 s SIRT1
genski promotor (sl. 3C).

da bi raziskali vlogo dveh zavezujočih ATF4 mestih pri urejanju SIRT1 transaktivacije, je bil na mestu usmerjeno mutagenezo uporabimo za mutacijo teh straneh. Luciferaza novinar test je pokazal, da niti mutira vezavno mesto 1 ali vezavno mesto 2 zmanjšana aktivnost SIRT1 promotor, ki ATF4 povzročeno. Poleg tega mutacija obeh vezavnih mest odpravijo aktivnost SIRT1 promotor. Ti rezultati kažejo, da sta oba ATF4 veznih mest, vključenih v transaktivacije za SIRT1 promotorja (sl. S1).

Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da je SIRT1 neposredna transkripcijski cilj ATF4.

SIRT1
zaviral siRNA delno obrne MDR fenotip-ATF4 čezmerno izraženim želodčnih rakavih celic

identifikacija ATF4 posredovano SIRT1
poveča nivo izražanja v želodcu rakavih celic, pozove nam analizirati vlogo te poti v želodcu MDR raka. Za rešitev tega problema, smo primerjali in vitro
občutljivost drog v ATF4 stabilno transfektirali želodčne rakave celice po transfekciji SIRT1
siRNA ali umešana siRNA s tvorbo kolonij in MTT teste. Rasklapanje za SIRT1
s siRNA v SGC7901-ATF4 celic, ki so privedli do > 40% zmanjšanja števila kolonij, če se uporablja v kombinaciji z CDDP (. ​​Slika 4A, zgornji). Ta učinek so opazili tudi pri AGS-ATF4 celic (sl. 4A, nižji). Poleg tega so podatki iz MTT testom je navedeno tudi, da je rasklapanje za SIRT1
lahko ponovno senzibilizirati SGC7901-ATF4 celice do kemičnih zdravil, vendar se to ni zgodilo v umešana siRNA transfekciji celic (sl. 4b).

Če želite ugotoviti, ali SIRT1 ščiti celice pred CDDP-inducirane apoptoze, SGC7901-ATF4 transfektiranih s SIRT1
siRNA ali umešana siRNA so bili zdravljeni z CDDP in označene z aneksinom v in PI. Apoptoze celice so bile označene z označevanjem aneksin. Apoptoze odstotek SIRT1 siRNA transfektirali SGC7901-ATF4 celice je bila bistveno večja kot pri kontrolnih celic (sl. 5A, 72,8% proti 25,9%). Izgled zgoščenih in razdrobljenih jeder je povečal tudi SIRT1 siRNA transfektiranih celic v primerjavi s kontrolnimi celicami (sl. 5B). Poleg tega smo opazili cepitev procaspase-3 že po 12 h po zdravljenju s 10 mg /ml CDDP v SIRT1 siRNA transfektirana SGC7901-ATF4 celice, toda ne umešana siRNA obdelanih celic, celo po 24 urah zdravljenja CDDP (sl. 5C ). Ti rezultati kažejo, da SIRT1 prekomerno zavira CDDP-inducirano apoptozo.

Za študij vpliva zmanjšanjem števila SIRT1 s siRNA o MDR povezana molekul, smo pregledali MDR1, MRP, bcl-2, in Bax raven izražanja v SGC7901-ATF4 celice naslednji transfekciji s SIRT1 siRNA ali umešana siRNA. Navzdol ureditev MDR1 opazili pri SIRT1 siRNA obdelanih celic (sl. 5d) v primerjavi s kontrolnimi celicami. V nasprotju s tem pa je bilo ugotovljeno, ni očitna razlika MRP, Bcl-2, in stopnjah izražanja Bax med vzorci.

Te ugotovitve kažejo, da SIRT1 posreduje v-ATF4 povzroča MDR učinek v želodcu rakavih celic.

Zaviranje SIRT1 dejavnosti ponovne sensitizes ATF4 transfektirane celice agentom DNK poškodovali

da bi zagotovili dokaze, da je SIRT1 katalitična aktivnost odgovoren za MDR, SGC7901-ATF4 celic-ATF4 povzroča bile predhodno obdelane z EX-527 tudi , nov, močan in specifičen majhna molekula inhibitor SIRT1, čemur sledi obdelavo z različnimi kemičnimi drogami. Najprej smo določili bazalno citotoksičnost EX-527 v LV-Vector in LV-ATF4 stabilno transficirane SGC7901 celic. MTT test je pokazala, da EX-527 v koncentracijah do 10 mikrometrov ni zaviral, temveč nekoliko povečana sposobnost preživetja obeh celičnih linij (sl. 6a). Dalje, smo pregledali SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, bcl-2, in ravni izražanja Bax po inkubaciji 24 ur, z ali brez označenih odmerkov EX-527 v želodcu rakavih celic oglase. Samo izraz MDR1 so navzdol ureja EX-527 v odvisnosti od koncentracije način (sl. 6B). Nato smo predinkubira SGC7901-ATF4 celice z vozilom ali EX-527 (0,5, 1, 2, 4 in 10 uM), po 24 urah, nato pa CDDP- in 5-FU, posredovane celične smrti smo kontrolirali. Kot je prikazano na sliki. 6C, EX-527 bistveno izboljšala citotoksičnost obeh zdravil na način, ki je odvisen od odmerka. Ugotavljali smo tudi možni sinergijski učinek EX-527 v različnih odmerkih CDDP- in 5-FU sta zavrtje celične proliferacije v SGC7901-ATF4 celic. Kot je bilo pričakovati, 10 iM EX-527 je dovolj, da okrepi citotoksičnost obeh zdravil (sl. 6d).

Ti rezultati kažejo, da ima SIRT1 dejavnost tudi ključno vlogo pri-ATF4 povzroča želodčne MDR raka in to vloga se lahko posreduje delno z MDR1 izražanja.

Pogovor

MDR predstavlja pomembne klinične izzive za učinkovito kemoterapijo številnih človeških malignih bolezni. Mehanizmi, s katerimi celice pridobivajo odpornost so številni in zapleteni, zato širše razumevanje njih, kot tudi opredelitev novih mehanizmov za chemoresistance, bo še posebej koristno pri zagotavljanju boljših terapevtske možnosti. Ta študija je prvo poročilo, da visoka raven ATF4, pogosto videti v tumorskih celicah v stresnih okoliščinah, daje želodčne rakavih celic z MDR fenotip, in ugotovi, da je ta učinek posredovana delno z transaktivacije za SIRT1 izražanja.

ATF4
in SIRT1
so evolucijsko ohranjene odzivne gene stres, ki sodelujejo v širokem spektru bioloških procesov, od katerih so mnoge koristen za homeostaze in celično zaščito [22], [23], [ ,,,0],24]. Oba genov so inducirane v odgovor na različne napetosti, vključno pomanjkanja kisika (hipoksija /anoksije), oksidativnega stresa, poškodbe DNA, prehranske odvzem in kemotoksičnega stresa. Levenson VV et al.
Najprej poročali, da bi lahko spremembe v izražanju ATF4 igrajo vlogo pri pleiotropski odpornost na različne razrede zdravil DNK ciljanje [16]. V zadnjih letih so številne študije pokazale, da je bila ATF4 posredno ali neposredno vključeni v razvoj odpornosti na zdravilo z avtofagija je glutation odvisni od redoks sistem in poškodbe DNA popravilo [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [25] [26]. Tukaj smo pokazali, da je zaščitna sposobnost ATF4 dejansko posreduje tudi MDR fenotip pri ATF4-prekomerno ekspresijo želodčnega raka celičnih linijah odziv na kemoterapijo. Naši rezultati jasno kažejo, da je prekomerno izražanje ATF4 v želodčnih rakavih celic, povezana z več upora, medtem ko je rasklapanje od ATF4 inducirane ponovno preobčutljivost. Ti podatki kažejo, da je ATF4 verjetno pomembno nižji mediator rezistence na več načinov povzročena in je zato dragocen terapevtski cilj. Vendar, kot eden izmed najpomembnejših transkripcijskih mediatorjev ISR ki aktivira različne ciljnih genov, ki pospešujejo obnovo homeostaze lahko ATF4 posredujejo tudi odpornost na drugi mehanizmi. V naši raziskavi smo SIRT1 ugotovljeno, da je up-urejena v celicah, ATF4 čezmerno izraženim v primerjavi z vektorsko transfekcije celic. V nasprotju s tem, rasklapanje za ATF4
z ATF4 posebne siRNA privedla do zmanjšanjem števila SIRT1 v MDR raka želodca celic. Naši rezultati kažejo, da bi SIRT1 mediator na nižji stopnji od raka želodca-ATF4 povzroča MDR.

Ker ATF4 je član ATF podskupino za osnovno regije levcin zadrgo (bzip) transkripcijski faktorji [22] potencial, da deluje bodisi kot transkripcijski aktivator ali transkripcijske represorju preko ATF ali cAMP odziven element (CRE) vezavnih mest [22]. Soglasje vezavno mesto za ATF je bil opredeljen kot TGACGT (C /A) (G /A) [27], ki je zaporedje enaka CRE soglasja element (TGACGTCA) [28]. Prav tako je zelo ohranjena osrednji motiv - ACGT - lahko v večini Cres [29] vežejo na različne bzip dejavnikov, glede na spremljajoče baz osrednjega motiva [22], [30], [31]. V naši raziskavi je bilo ugotovljeno, dve domnevni ATF-CRE veznih mest na 1,2 kb SIRT1
promotor regijo in ATF4 aktivira neposredno SIRT1
prepis preko vezave na obeh zavezujočih elementov. Vendar, kako sta zavezujoči mesta igrajo svojo vlogo v skladu s podrobnimi stresnih okoliščinah ostaja neznan in zahteva dodatne preiskave.

sesalcev SIRT1
je najbližji homolog kvasovke Sir2
in najbolj obširno proučevali SIRT družinski član. To je močno vpletena v regulacijo celične procese, ki vplivajo na življenjsko dobo, vključno z anti-apoptozo nevronov zaščite in celično staranje ali staranja [32]. V zadnjem času je vedno več študij je vpleten poveča izražanje SIRT1 z odpornostjo na kemoterapijo in ionizirajočega sevanja [18], [19], [20], [33] [34] [35] [36]. Na primer, je bilo SIRT1 prekomerno najdemo v nevroblastoma odporna na zdravila, osteosarkoma, raka dojke, jajčnikov, prostate, debelega črevesa in pljučnega raka linij celic v primerjavi z njihovimi kolegi drog občutljiv. Vsi ti drog odporne na učinke SIRT1 bi lahko bilo zaradi svoje anti-apoptotske učinka [37], [38] in utišanje zaviralnih genov [39]. Končno smo lahko napovedujejo, da če je SIRT1 vpleten v-ATF4 inducirane MDR, bi zaviranje SIRT1 vplivajo na občutljivost-ATF4 prekomerno ekspresijo celic v odzivu na kemoterapijo. Kot je bilo pričakovati, tako siRNA in farmakološko zaviranje SIRT1 lahko ponovno senzibilizirati-ATF4 čezmerno izraženim celice do kemičnih zdravil. Poleg tega je naša raziskava kaže, da SIRT1 ščiti celice pred smrtjo deloma s pomočjo anti-apoptotske učinka.

To so poročali, da je bil MDR1 up-urejena v celicah s povečanim SIRT1 izražanja [18], [36]. V tej študiji smo tudi pokazali, da je MDR1 up-urejena-ATF4 prekomerno ekspresijo celic in rasklapanje od SIRT1 z SIRT1 posebne siRNA ali zavre njegovo delovanje z EX-527 lahko privede do zmanjšanjem števila MDR1, ki je v skladu z drogo -resistant vlogo SIRT1. Vendar pa je bil /Bax razmerje Bcl-2, ki je bil up-urejena v celicah, ATF4 prekomerno ekspresijo, SIRT1 neodvisen, kar pomeni, da SIRT1-neodvisni mehanizmi prav tako igrajo vlogo pri-ATF4 povzroča MDR v želodcu rakavih celic.

Če povzamemo, smo dokazati, da ATF4 daje MDR fenotip do želodca rakavih celic, in ta učinek je delno posreduje transaktivacije za SIRT1 prekomerno. Poleg tega ATF4 je veljaven cilj, v želodčnih tumorjev zdravila odpornih in razvoju učinkoviti inhibitorji ATF4 je treba upoštevati tudi v prihodnje. Te ugotovitve nove vpoglede v vlogi ATF4 pri nadzoru SIRT1 izraz in v njegovih značilnosti stresa odpornosti v tumorigeneze in kemoterapijo. To je še posebej pomembno za klinično obravnavo, saj lahko ATF4 up-ureja pomanjkanje kisika, oksidativnim stresom, hranilna pomanjkanju in skoraj vseh škodljivih stresorje so v tumorja mikrookolja, ki bi se lahko z ugrabljeno rakave celice, da se izognejo zaviranje širjenja in celične smrti v odziv na kemoterapijo. Zato se lahko posegi temeljiti na motnje povzroča stres ATF4 izraz v rakavih celicah učinkovit pri obiti ali vzvratno odpornosti na zdravila pri raku želodca.

Materiali in metode

Za podrobnejše metode, glejte Besedilo S1 .

celične kulture in reagenti

linije človekovih želodca adenokarcinom celic SGC7901 (pridobljeno na Akademiji za vojaške medicinske vede, Peking, Kitajska) in MDR variantnih, SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR (vzpostaviti in vzdrževati v našem laboratoriju) in AGS (pridobljeni iz banke celice kitajske akademije znanosti, Shanghai, Kitajska) smo kultivirali v RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (Hyclone) in penicilin /streptomicin. 293T celice (prav tako dobljene iz banke celic kitajskega Academy of Sciences) smo kultivirali v DMEM z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma. Vzdrževati MDR fenotip, adriamicin (s končno koncentracijo 0,5 g /ml) in vinkristina (s končno koncentracijo 1 ug /ml) dodamo k gojišča za SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR celic oz. EX-527 (Sigma) smo raztopili v DMSO pri navedenih koncentracijah. Adriamicin (ADR), vinkristin (VCR), cisplatin (CDDP) in 5-fluorouracil (5-FU) smo raztopili v fiziološke raztopine pri navedenih koncentracijah.

Cell transfekciji in stabilne celične linije

človek ATF4
plazmidov (pCMV5-ATF4) je prijazno, ki jih profesor Amy S. Lee [25]. Lentivirusni vektor kodiranje siRNA značilne za ATF4
in nadzor siRNA so bili ustvarjeni z uporabo PLKO.1-TRC (Addgene) in je bila imenovana za LV-siATF4 in nadzor LV-SCR, oz. Lentivirusni vektor kodira gen človeški ATF4 so bili izdelani v FUW-teto (Addgene), določen kot LV-ATF4. Prazen vektor smo uporabili kot negativno kontrolo, določena kot LV-Vector. Stabilne celične linije so bili ustvarjeni s transfekcijo prikazanih lentivirusni konstruktov, čemur sledi selekcija v puromicin ali zeocin (Invitrogen), oz. Celične transfekcije in generiranje stabilne celične linije so bile izvedene z uporabo standardnih postopkov. Sekvence so siRNA konstrukte, je mogoče najti v Text S1.

imunoblot

Zbirka beljakovinskih ekstraktov in imunoblotanju analize so bile izvedene z uporabo standardnih postopkov. Vire protiteles, glejte besedila S1.

Colony oblikovanje testa

test Nastanek kolonije je bila izvedena, kot je opisano zgoraj [40], z manjšimi spremembami (Besedilo S1).

aneksin V barvanja in FACS analizo

aneksin V obarvanje in analizo FACS so bile izvedene z uporabo standardnih postopkov. Celice negativni tako PI in aneksin madeži so razvrščene kot živih celic, celice, ki obarvajo pozitiven aneksina so razvrščene le kot zgodnjih apoptotskih celic in PI pozitivne in aneksin V pozitivne celice so celice, ki so v postopku poznih fazah apoptoze.

fragmentacije DNK test

DNK fragmenti so bili pridobljeni z DNA Ladder Extraction kompletom s Spin Column (C0008, Beyotime Co, Peking, Kitajska), v skladu s protokolom proizvajalca. Fragmente DNA ločimo z gelsko elektroforezo na 1% agaroznem gelu, ki vsebuje 0,1 g /ml etidijev bromid.

Hoechst obarvanje

Hoechst obarvanje je bila izvedena v skladu s protokolom proizvajalca (C0003, Beyotime Co. ). Celice smo prikazali z DP70 invertnega imunofluorescenčni mikroskopom (Olympus) a. Celice z zgoščeno in razdrobljenih jeder je bilo ocenjeno, da je apoptotske.

In vitro
občutljivost drog test

ADR, VCR, CDDP in 5-FU so bile vse sveže pripravljeno pred vsak poskus. Občutljivost drog smo merili z uporabo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolijevega bromida (MTT) testa po standardnem protokolu (Besedilo S1).

Kvantitativna realnem -time PCR (qPCR)

Kvantitativni PCR v realnem času smo izvedli z uporabo LightCycler sistema 480 II (Roche) in SYBR Green zaznavanja (Takara). Zaporedja oligonukleotidov je mogoče najti v Text S1.

kromatina imunoprecipitacije (chip) test

čip teste smo izvedli po protokolu proizvajalca (P2078, Beyotime Co.), z manjšimi spremembami. Kromatin raztopine smo sonicirali in inkubiramo z anti-ATF4 ali kontrolno IgG in vrti preko noči pri 4 ° C. DNA-protein križne vezi so bile odpravljene in kromatin DNA očistimo in podvržejo analizi PCR. Primerji 5'-ACC SCT CGT TTT ACA TCT-3 'in 5' TTT GGA GTC CTT CCT TTC-3 ", so bili uporabljeni za razširitev SIRT1
distalni promotorsko sekvenco (A1, nukleotidi -974 do - 843), in primerji 5'-ACC CAA CAA ACC CAT TCT-3 'in 5'-SCT SCT GGG AAG ACC TTT-3 ", smo uporabili za pomnoževanje SIRT1
proksimalni promotor sekvenco (A2, nukleotidi -781 do -647). Primerji za GAPDH
, 5'-TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG-3 'in 5'-TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA-3', smo uporabili kot negativno kontrolo. Kot pozitivne kontrole za interakcijo ATF4-DNA, primerji 5'-TGG TTG GTC CTC GCA GGC AT-3 'in 5' CGC TTA TAC CGA SCT GGC TCC T-3 ", ki so bili zasnovani, da povečujejo asparagin sintetazo ( ASNS
) promotor regija, ki vsebuje vsaj dve mesti so poročali, da se veže ATF4 [41], so bili uporabljeni tudi. Po pomnoževanju smo PCR produkti rešena na 1,5% agaroznem gelu in vizualizirali s etidijev bromid barvanjem

Reporter gene test

človeški 1,2 kb SIRT1
promotorja (. - 1100-100 bp) smo sintetizirali in klonirali v mestih Xhol in Hindlll v pGL3-Basic vektorja. Nastalo Konstrukt je potrdil zaporedja DNK. 293T Celice smo nato sočasno transfektirana z SIRT1
promotor reporterski plazmid je PRL-TK plazmid (Promega, ZDA) in pCMV5-ATF4 plazmida z Lipofectamine2000 (Invitrogen). Štirideset osem ur po transfekciji smo celice izprali trikrat s hladnim fosfat pufrom (PBS). Nato smo celice lizirali v 100 ul pasivnih liznega pufra (Promega) in stresamo 15 minut. Firefly luciferaza in luciferazne aktivnosti Renilla so bile izmerjene z uporabo Dual-luciferaza Reporter preskusnega sistema (Promega) z Varioskan Flash mikroploščnem bralcu (Thermo znanstveni). "Relativna dejavnost" je bila opredeljena kot razmerje med kresničkino luciferazne aktivnosti za Renilla luciferazno aktivnost in je bila izračunana tako, da se intenzivnost luminiscentno pridobljene s testom za kresničkino luciferazo ga da v Renilla luciferaze. Vse meritve so bile izvedene v treh izvodih in analize smo ponovili trikrat 293 T celicah.

Statistična analiza

Vsak poskus smo ponovili vsaj trikrat. Vsi podatki, ki so bili predstavljeni kot povprečne vrednosti ± SD Razlika med sredstvi smo analizirali s Studentov t test. Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo SPSS16.0 programske opreme (Chicago, IL). Pomen je bila določena v višini 5%.

Podpora Informacije
Slika S1.
Učinek mutiranih ATF4 vezavnih mest na aktivnost promotorja SIRT1. 293T celice so co-transfekciji s pCMV-ATF4 in divjega tipa SIRT1, SIRT1-MUT1, SIRT1-MUT2 ali MUT1 + MUT2 novinar in relativno luciferazno aktivnost je bila določena. Aktivnost luciferaze z modelnim skupine pCMV-Taq je bila imenovana za 1,00. Rezultati so povprečje ± S.D. treh poskusov izvedli v dvojniku. * P &0.05. Na levi strani je shematska predstavitev reporterski gen konstrukti. V bar grafi na desni strani predstavljajo relativne ravni luciferazne aktivnosti v vsakem od transfekciji vzorcev
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031431.s001
(TIF)
Besedilo S1.
Dodatne Material in metode.
doi: 10,1371 /journal.pone.0031431.s002
(DOC)

Priznanja

Zahvaljujemo profesorja Amy S. Lee nam prijazno zagotavljanje z pCMV5-ATF4 plazmida . Zahvaljujemo se tudi g Taidong Qiao in Ms Zheng Chen za odlično tehnično pomoč.

• Plos ONE: genska odpornost na CagA učinkujejo vzajemno molekul in Gene-okolje Medsebojno delovanje z fitoestrogene, dejavnik Domnevna tveganja za želodca Cancer
• Plos ONE: S100A6 Protein Negativno Uravnava CacyBP /SIP-zavrtje želodčnega raka Cell orožja in tumorigeneze