PLoS ONE: IGFBP3, transkripcijos Tikslinės homeozinis genas D10, koreliuoja su skrandžio vėžio Prognozė

Anotacija

homeozinis genas D10 (HoxD10) vaidina svarbų vaidmenį dėl embrioninių ląstelių ir progresavimo krūties vėžio diferenciacijos. Mūsų ankstesnės ataskaitos parodė, kad į insuliną panašaus augimo faktoriaus surišančio baltymo-3 (IGFBP3) reglamentavo HoxD10 skrandžio vėžio ląsteles; Tačiau, funkciniai vaidmenys ir pagrindinės mechanizmai IGFBP3 skrandžio vėžio lieka neaiški. Čia, mes nustatėme, kad IGFBP3 išraiška buvo aktyvinama po negimdinio išraiška HoxD10 skrandžio vėžio ląsteles. Chromatino imunoprecipitacijos tyrimas parodė, kad HoxD10 privalo trys potencialūs regionų IGFBP3 rengėjas. Egzogeninė HoxD10 gerokai sustiprino liuciferazės reporteris, kuriame šiuos privalomus regionus skrandžio vėžio ląstelių aktyvumą. Kiti duomenys parodė, kad visų šių jungimosi vietų turėjo Hox privalomas elementas "TTAT". Imunohistocheminiais dažymo rezultatai atskleidė, kad IGFBP3 išraiška buvo žymiai downregulated 86 skrandžio adenokarcinomų audinių, palyginti su jų gretimų nevėžinės audinių (p < 0,001). Be to, IGFBP3 išraiška buvo žymiai mažesnis skrandžio naviko su limfmazgių metastazių palyginti su tuo be limfmazgių metastazių (p = 0,045). Pacientai, sergantys didelio ekspresijos lygį IGFBP3 parodė teigiamą 5 metų bendras išgyvenamumas (p = 0,011). Nokdaunas iš IGFBP3 paspartino skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija ir sukeliama invazinių veiksnių, įskaitant MMP14, UPA ir uPAR išraiška. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad HoxD10 orientuojasi genas IGFBP3 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių invaziją ir skatina skrandžio vėžiu sergančių pacientų išgyvenimo

nurodomoji dalis:. Xue M Fang Y Saulė G Zhuo W Zhong J Qian C, ir kt. (2013) IGFBP3, transkripcijos Tikslinės homeozinis genas D10, koreliuoja su skrandžio vėžio prognozę. PLoS ONE 8 (12): e81423. Doi: 10,1371 /journal.pone.0081423

redaktorius: DunFa Peng, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: birželio 21, 2013; Priėmė: Balandis 13, 2013 m Paskelbta gruodžio 27 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Xue ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Nacionalinis pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (973 programa) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) ir mokslinių tyrimų fondas doktorantūros programa aukštojo mokslo Kinijos (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj~~HEAD=pobj). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir šiuo metu yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. Beveik pusė skrandžio CANER pacientų jau pasistūmėjo į vėlai su limfinės ar tolimoje metastazių diagnostikai ir prarasti galimybę operuoti [2]. Šie pacientai turi prastą rezultatą ir penkerių metų išgyvenamumas tiems, kurie toli metastazių yra mažesnis nei 5% [3]. Skrandžio vėžio progresavimas yra laikoma multi-žingsnis procesas, apimantis onkogenų ir nukenksminimo navikų supresorinių genų aktyvinimo. Mes jau anksčiau atskleidė, jog homeozinis genas D10 (HoxD10) tarnavo kaip naviko slopintuvas kurį slopina naviko augimą ir invaziškumo, kuris buvo epigenetically tylėti skrandžio vėžio [4].

HoxD10 genų priklauso homeozinis genas superfamily, kuris koduoja transkripcijos veiksnių ir daryti funkcijas daugiausia per aktyvinimo ar represijų tolesniems tikslinių genų [5]. Amino-terminalas rankos Hox homeodomain turi keletą pagrindinių konsensuso privalomas aspektus, įskaitant TTAT, TAAT ir TTAC [6,7]. Pavyzdžiui, HoxC8 jungiasi prie šių elementų prie promotoriaus regionuose ir moduliuoja transkripcijos veiklą pedf, Ncam, Zac1, OPN ir Cdh11, kaip nustatyta aukštos visoje chromatino Imunoprecipitacijos tyrimų ir pasaulio HoxC8 DNR surišimo vieta analizę [7]. Tyrimai parodė, kad HoxD10 slopina angiogenezėje ir ląstelių judrumą endometriumo vėžio (EB) [8] ir susilpnina ląstelių invazinis skrandžio ir krūties vėžio [4,9]. Tačiau mažai žinoma apie tai, kaip HoxD10 daro savo funkcijas kancerogenezės ir naviko progresavimo mechanizmus. Mes sistemingai tikrinami galimus tikslus HoxD10 iki kDNR microarray ir nustatė kelis genus, įskaitant insuliną panašus augimo faktorius surišančio baltymo-3 (IGFBP3), kuri gali būti atsakinga už naviko slopina poveikį HoxD10 skrandžio vėžio [4].

IGFBP3 yra pagrindiniai IGFBP rūšys apyvartą, privalomas daugiau kaip 75% cirkuliuojančio insulino augimo faktoriaus I (IGF-I) [10]. Jis gali slopinti ląstelių proliferaciją ir indukuoja ląstelių apoptozę kelių tipų vėžio, įskaitant prostatos ir skrandžio vėžio [11,12]. Keletas tyrimų patvirtino, kad IGFBP3 slopina gimdos gleivinės vėžiu yra invazinis (EB) saugos standartus [13], metastazių į prostatos vėžio [14], ir angiogenezę galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma (HNSCC) [15]. Ji paprastai buvo manoma, kad IGFBP3 gali blokuoti surišanti sritis IGF-I jos receptoriaus IGF-IR, tokiu būdu panaikinti IGF /IGF-IR ašies poveikį. Be to, kad IGF /IGF-IR ašies priklausomybė egzistuoja alternatyvius IGF /IGF-IR nepriklausomas ir branduolinių Translocation būdų [10]. Daug veiksnių buvo išaiškinta reguliuoti IGFBP3 išraišką, įskaitant retino rūgšties, naviko nekrozės faktoriaus alfa, trichostatin A, uodegos tipo homeozinis genas 2 (CDX2) ir metilinimo statuso savaime [10,16]. Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad IGFBP3 buvo aktyvinama į AGS ir MKN28 ląstelių ekspresija HoxD10 [4]. Atsižvelgiant promotoriaus regione IGFBP3 turi keletą galimų privalomų svetaines HoxD10, prognozuojama PROMO, programa, dėl transkripcijos faktorius jungimosi vietų [17] prognozavimas, HoxD10 gali tiesiogiai sąveika su IGFBP3 į skrandžio vėžio ląstelių invaziją reglamentą. Išaiškinimas šio tinklo būtų suteikti daugiau įžvalgų apie IGFBP3 vaidmenį skrandžio vėžio.

Šiame tyrime mes nustatė, kad HoxD10 galėjo tiesiogiai jungiasi rengėjas regionus IGFBP3 potencialiai per TTAT elementas, todėl transkripciškai reguliuoja savo išraišką skrandžio vėžio. Be to, išraiška lygis IGFBP3 dažnai downregulated skrandžio vėžio audiniuose ir susijęs su bendram išgyvenamumui, o tai rodo, kad IGFBP3 vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimą. Funkciškai, IGFBP3 gali slopinti migracija ir invazija skrandžio vėžio ląstelių, bent jau iš dalies, per šių invazinių veiksnių reguliavimo, įskaitant metaloproteinazės-14 (MMP14) ir urokinazė-tipo plazminogeno aktyvatoriaus (ÚPA).

medžiagos ir metodai

ląstelių kultūros

Aštuoni skrandžio vėžio ląstelių linijas (MAA, MKN28, MKN45, NVI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 ir SGC7901) buvo gauti iš Riken genų banke (Tsukuba, Japonija) ir Amerikos tipas Kultūrų rinkinys (Manasasas, JAV). Vienas nepiktybinių skrandžio ląstelių linija (GES-1) buvo gauta iš Pekino vėžio tyrimų instituto (Pekinas, Kinija). Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpė (Invitrogen, Carlsbad, JAV) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, Sijiqing, Huzhou, Kinija) ir inkubuojama 5% CO _{2, 37 ° C ir 95% drėgmės.}

Statybos IGFBP3 liuciferazės reporteris plazmidžių

Trys skirtingi fragmentai promotoriaus regione IGFBP3, įskaitant -2282 iki 56 bp (2.3 kB, pIGFBP3) -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 privalomas puslapį Aš, HBSI) ir -1727 ~ -943 BP (HBSII), buvo papildyta PGR naudojant genomo išskirtą DNR iš HEK-293T laukinių ląstelių kaip šabloną. HBSI apima HBS1 ir 2 HBSII yra iš HBS3, 4 ir 5, kuriame HBS1-5 yra prognozuojama PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS pradmenų sekas buvo taip: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'ir 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'ir 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'ir 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. PGR fragmentai buvo susiūta į PGM-T vektoriaus (Tiangen, Pekinas, Kinija), suardomas KpnI /BgIII (PROMEGA, Madison, JAV) ir tada subklonuotas į Knpl /BgIII svetainių pGL3 bazinis vektorius (Promeg) generuoti pGL3-pIGFBP3 bazinis liuciferazė Reporter plazmidės, ir pGL3-rengėjas vektorius (Promega) generuoti pGL3-HBSI (II) -promoter liuciferazės reporteris plazmidžių. Visi konstruktai buvo patvirtinta DNR sekos.

Statybos liuciferazės reporteris plazmidės iš HBSs

susintetinti oligonukleotidai su prognozuojama Hox jungimosi vietų (HBSs) į promotoriaus regionuose IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) ir kiekvienas su vieno taško mutantas svetainėje (A → C), oligonukleotidai buvo taip: Rīga,

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'ir 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

mutantas HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'ir 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'ir 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

mutantas HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'ir 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'ir 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

mutantas HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'ir 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

dukart per dideles HBSs buvo atkaitinimo ir įterpiamas į pGL3-promotoriaus vektoriaus Upstream generuoti liuciferazės reporteris plazmidžių [18]. Visi konstruktai buvo patvirtinta DNR sekos.

Mobilusis transfekcija

Skrandžio cacner ląstelės (BGC823 ir SGC7901) buvo pernešta su pcDNA3.1-HoxD10 ar pcDNA3.1 tuščias vektoriaus naudojant Fugene HD (PROMEGA) , Generuoti stabilias HoxD10 raiška ląstelių linijas, virš Transfekuoti ląstelės buvo atrinkti 400 mikrogramų /ml G418 (Merck, Darmstadt, Vokietija) dar 14 dienų. Dėl siRNA tarpininkaujant genų triuškinantis, BGC823 ir SGC7901 ląstelės buvo pernešta su neigiamos kontrolės siRNA ar IGFBP3 orientuojasi siRNR (Qiagen, Hilden, Vokietija), HGC27 ląstelės buvo pernešta su neigiamos kontrolės siRNA arba HoxD10 orientuojasi siRNR (Genepharma, Šanchajus, Kinija) naudojant Lipofectamine RNAiMAX reagentas (Invitrogen).

liuciferazės veikla tyrimas

1,0 × 10 ^{5 BGC823 ir SGC7901 ląstelės buvo pasėjamos į 24-duobučių lėkštelėse 24h, tada transfektuotose 0.4μg pcDNA3.1 tuščias vektoriumi ar pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-Basic (rengėjas) tuščias vektorius arba pGL3-pIGFBP3 (HBS) -basic (rengėjas) ir 0.004μg PRL-TK vektorius (Promega), kuriame yra nuoroda kontrolės renilla naudojant Fugene HD [18]. Liuciferazė veikla buvo analizuojami dvejopo liuciferazė reporterio testą sistema po 48h pagal gamintojo protokolai (PROMEGA).}

Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP)

stabili HoxD10 ekspresija BGC823 ir SGC7901 ląstelių linijas, chromatino buvo immunoprecipitated su HoxD10 monokloninis antikūnas (triušis, Santa Cruz biotechnologijos Inc, Santa Krusas, Jungtinės Amerikos Valstijos) [19] arba normalus triušio IgG (neigiamas kontrolė) pagal paprastąjį ChIP Fermentinis chromatino IP Kit (Mobilusis Signalizacijos Technology Inc, Danvers , JAV). Nusodintas DNR arba 2% paramai mėginiai su genomo DNR iš HEK-293T laukinių ląstelių buvo papildyta su Taq DNR polimerazė (TAKARA, Otsu, Japonija) [20,21]. Keturi gruntai apimančios HBSs skirtingose ​​vietose IGFBP3 rengėjas buvo suprojektuoti taip: A1 (-2251 ~ -2073 BP, už HBS1 ir 2), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 "ir 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3"; A2 (-1765 ~ -1633 bp, už HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'ir 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp, už HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'ir 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 formato (-1153 ~ -877bp, už HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 "ir 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3".

atvirkštinės transkripcijos-PGR

Viso RNR buvo išskirta su Trizol reagentas (Cwbiotech, Pekinas, Kinija). Atvirkštinės transkripcijos (RT), -PCR buvo nustatyta su M-MLV atvirkštinės transkriptazės (TAKARA) ir Taq DNR polimerazė. Šie pradmenys buvo naudojami amplifikacijos:

GAPDH, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'ir 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'ir 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'ir 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'ir 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'ir 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'ir 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'ir 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

audinių inhibitorius metaloproteinazės-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'ir 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ";

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'ir 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

ÚPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'ir 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'ir 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Imunoblotingo

Iš viso baltymai buvo išgauti naudojant Ripa lizės buferiniame tirpale (Beyotime, Haimen, Kinija). Triton X-100 lizės buferio buvo naudojama išgauti tirpus E-cad ir SS-kateninai SDS lizės buferio buvo naudojama išgauti netirpių El cad /SS-kateninai kompleksas [22]. Lizatai išspręstas SDS-PAGE metodu ir perkelti į PVDF membranų (Millipore ", Bedford, JAV). Į dėmės buvo tyrinėjo su HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnologijos Inc), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnologijos Inc), E-cad (1: 1000, Mobilusis Signalizacijos Technology Inc), SS-kateninai ( 1: 1000, Mobilusis signalines Technology Inc) arba GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) antikūnai. Į dėmės buvo ryškinamos naudojant liuminescencijos su Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokijas, Japonija). Santykinis tankis baltymų buvo kiekybiškai su vaizdo J. programinės įrangos ir standartizuoti GAPDH [20].

Žaizdų gijimo Bandymo

BGC823 ir SGC7901 ląstelės buvo pernešta su IGFBP3 siRNA arba kontroliuoti neigiamas siRNA į šešių duobučių lėkšteles ir tada subraižyti su P10 pipetės galiuką sukurti spragą. Šuliniai buvo skalaujami PBS pašalinti perkeltų ląstelių ir Fresh Media (1% FBS už BGC823 ir serumo nemokamai SGC7901) buvo pridėta. Trys atsitiktiniai atvaizdai subraižyti srityse buvo imtasi (× 40 priartinimas) per 0h, 12h ir 24h [23].

Transwell migracija ir invazija tyrimai

Mobilusis migracija ir invazija buvo įvertinti modifikuotos Boyden transwell kameros (Corning Inc. "," Corning ", JAV), padengtas (dėl kišimosi) arba be (migracijos) Matrigel (BD biomokslų, Franklin ežerų, JAV). siRNA transfekciją ir bado ląstelės buvo padengtas į viršutinę kamerą mitybinės terpės sudėtyje yra 1% FBS (BGC823) arba be FBS (SGC7901), terpė su 15% FBS buvo įtraukta į apatinę kamerą, ląstelės viršutiniame kambaryje buvo kruopščiai pašalinti po inkubacijos už 16h (migracijos) arba 36 val (už invaziją). Migravo ląstelės buvo tamsintas su 0.5μg /ml, DAPI dažymo tirpalo (Roche Penzberg, Vokietija). Mobilieji numeriai buvo atsitiktinai skaičiuojami penkių laukų (× 400 priartinimas) [24]. Įsiveržė ląstelės buvo inkubuojami su Mobilusis Stain Sprendimas (miliporų) ir fotografavo (× 200). Dažų mišinys plauti ekstrahuojant buferis ir perkeltas į 96-Na kolorimetrinę matavimo metu 560nm į mikroplokštelės skaitytojui (Thermo, Bostonas, JAV) [25,26].

Pacientai ir jų pavyzdžiai

86 chirurgijos pacientai skrandžio adenokarcinoma buvo įtraukti nuo 2007 m gegužės mėn iki 2008 m vasario pasirašius informuoto sutikimo. Šis tyrimas buvo patvirtintas klinikinių tyrimų etikos komiteto seras Run Run Shaw ligoninės Zhejiang University. buvo gauti Sutampa navikų audiniuose ir gretimų naviko be audiniai. Pacientų klinikos duomenys, įskaitant lytį, amžių, TNM etapais ir patologinių klasių buvo gaunami iš medicininių įrašų. Tolesni buvo atlikta už 1 metų intervalu po operacijos, medicinos istorija buvo užfiksuotas, kai pacientas atėjo vėliau apsilankymo. Tolesnių Apipjaustymas laikas buvo 2012 Rugpjūtis, o mediana tolesnių laikas buvo 35 mėnesiai (diapazonas, 1-63 mėn.)

Audinių Mikrogardelė ir imunohistocheminį dažymo

šerdys matavimo 1.5mm į didžiausias matmuo buvo perforuoti iš ne nudžiūvusiuose sričių suderintų navikų audiniuose bei gretimų naviko be audiniuose. Audinių mikrogardeliq skaidres, kuriuose 4μm storas microarray skyrius buvo pastatyti naudojant standartinius metodus (bendradarbiaujant su Šanchajaus Superchip Company Ltd, Šanchajus, Kinija). Skaidres buvo inkubuojamos su IGFBP3 antikūno (1: 100, Santa Cruz biotechnologijos Inc.) per naktį 4 ° C temperatūroje, ir tada inkubuojami su EnVision-plius aptikimo sistema (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Copenhagen, Danija). Skyriai buvo sukurta 3,3'-diaminobenzidinas tirpalu pagal mikroskopinio stebėjimo ir counterstained hematoksilinu [27]. Audiniai progresavusiu krūties vėžiu buvo tamsintas kaip teigiamos kontrolės [28]. Teigiamų ląstelių dalis kiekvienoje egzempliorius buvo nurodyta pagal mikroskopu ir suskirstyti į keturias grupes. 0: 0-5% teigiamų ląstelių; 1: 6% iki 50% teigiamos ląstelės; 2: 51% iki 75% teigiamos ląstelės ir 3: 76-100% teigiamos ląstelės. Iš IGFBP3 dažymo intensyvumas buvo rūšiuojami taip: nieko dažymo = 0; silpnas dažymo = 1; vidutinio dažymo = 2; tanki dažymo = 3. intensyvumo, pridėjus teigiamą dažymo proporcingai rezultatas buvo apibrėžtas kaip IGFBP3 dažymo rezultatą. 0-3 buvo laikomas mažos raiškos ir 4-9, nes aukštos raiškos.

Statistinė analizė

skirtumas išraiška IGFBP3 tarp navikinių audinių ir ne navikinio audinio nulėmė Mann-Whitney U-testą. Chi-kvadrato testas buvo naudojamas analizuoti tarp klinikos funkcijų ir IGFBP3 dažymo rezultatus santykius. Iš bendro išgyvenamumo tikimybė buvo apskaičiuojamas Kaplan-Meier metodu ir tarp kreivių skirtumas buvo įvertintas su log-rank testą. A p <nukirpimas 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

HoxD10 upregulates iš IGFBP3
plataus Genomo-

analizės išraiška parodė, kad daug genų, įskaitant IGFBP3 buvo reguliuojami. iki HoxD10 skrandžio vėžio ląstelių mūsų ankstesniame tyrime (4). Norėdami nustatyti, ar HoxD10 gali transkripciškai reguliuoti IGFBP3 išraišką skrandžio vėžio ląsteles, mes nustatėme, ekspresijos lygį IGFBP3 po stabiliai įvedant HoxD10 geną į BGC823 ir SGC7901 ląstelių arba laikinai numušti iš HoxD10 į HGC27 ląsteles. AT-PGR ir Imunoblotingo rezultatai nuosekliai parodė, kad IGFBP3 išraiška buvo žymiai aktyvinama į HoxD10 ekspresija ląstelių (1a pav ir 1B), o downregulated po slopinimo ir HoxD10 į HGC27 ląstelių (1c ir 1D pav.)

2,3 kb seka (-2282 iki 56 bp) tuo tiekėjų regione IGFBP3 buvo klonuotas į pGL3 bazinis vektorius ir naudojamas įvertinti liuciferazės veiklą dvejopo liuciferazės reporteris tyrimus. Rezultatai parodė, kad IGFBP3 rengėjas veikla BGC823 ir SGC7901 ląstelių buvo sustiprintas 4.2 ir 3.8 raukšlės atitinkamai po bendro perkeltų su pcDNA3.1-HoxD10 palyginti su pcDNA3.1 vektoriaus transfectants (p < 0,01, 1E pav.) Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad HoxD10 gali transkripciškai upregulate į IGFBP3 išraišką skrandžio vėžio ląsteles.

Cheminės naujų reguliavimo regionų IGFBP3 promotoriaus, atsakingų už HoxD10

Kitas išanalizavo galimą HoxD10 privalomas svetaines IGFBP3 rengėjas. 2,3 kb prieš seka IGFBP3 geno buvo įvestas į PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), programa, dėl transkripcijos veiksnio jungimosi vietų į vieną seką arba A susijusių sekų grupės prognozės (17 ), ir 5 galimų HoxD10 privalomas svetainės (HBS1 ~ 5) buvo prognozuojama, (lentelė S1). Kaip parodyta 2A pav, tai penkių HBSs buvo lokalizuota -2191 ~ -2182bp (HBS1) -2111 ~ -2102bp (HBS2) -1700 ~ -1691bp (HBS3) -1418 ~ -1409bp (HBS4) ir -953 ~ -944bp (HBS5) atitinkamai. Be stabilios HoxD10 ekspresija BGC823 ir SGC7901 ląsteles, privalomas regionuose pagal IGFBP3 rengėjas buvo tiriamas Chip tyrimus. Mes nustatyta, kad chromatino nusodinti HoxD10 specifinių antikūnų buvo papildyta naudojant A2, A3 ir A4 pradmenis, kurie apima HBS3, HBS4 ir HBS5 atitinkamai, o ne amplifikacija buvo pastebėtas su A1 gruntai, apimančių HBS1 ir 2 (2b pav.)

Norėdami gauti toliau į reguliavimo segmentų IGFBP3 rengėjo pagal HoxD10, mes klonuoti 2 skirtingus DNR fragmentus, kurie apima HBSI (HBS1, 2) ir HBSII (HBS3, 4 ir 5), atitinkamai, į SV40 rengėjas liuciferazės žurnalistams. Rezultatai parodė, kad bendrai transfekuota su HoxD10, HBSII sustiprintas SV40 promotoriaus aktyvumą 4.0 kartus, lyginant su šių tuščių vektoriaus transfectants į BGC823 ląstelių (P < 0,01, 3A pav). Priešingai, HBSI neparodė reikšmingos įtakos SV40 promotoriaus veiklos (3a pav.) Panašūs rezultatai buvo atskleista dar nepriklausomų SGC7901 ląstelių, SV40 promotorinės veiklos pokyčiai buvo 3.3 ir 0.9 karto pagal HBSII ir HBSI (atitinkamai S1A figūra Failų S1).

HBS3, 4 ir 5 bendromis privalomas elementas "TTAT", o HBS1 arba HBS2 nė vienas iš šių elementų. Mes hipotezę, kad HoxD10 tiesiogiai jungiasi prie IGFBP3 Steigėją "TTAT" svetainėse. Norėdami patvirtinti, mes susintetinti 10bp oligonukleotidai, kurių sudėtyje yra su HBS3, HBS4 ir HBS5 sekas atitinkamai. Kaip parodyta 3B paveiksle, SV40 promotorinės veikla buvo sustiprintas 1,8, 2,0 ir 2,7 raukšlės atitinkamai, kai bendrai perkeltų su HoxD10 plazmidžių į BGC823 ląstelių, o taškas mutantai HBS3, HBS4 ir HBS5 neparodė jokių reikšmingų pokyčių. Mes atgaminti panašius rezultatus SGC7901 ląstelių (S1B pav Failų S1).

Bendrai Šie rezultatai rodo, kad IGFBP3 yra tiesioginis tikslas HoxD10 skrandžio vėžio ląsteles. Mes nustatė tris funkcines apkaustai svetainių tarp -1727 ~ -943bp į IGFBP3 geno, atsakingo už HoxD10 Upstream. HoxD10 galėjo tiesiogiai surišti IGFBP3 rengėjas potencialiai per Hox privalomu elementu "TTAT".

IGFBP3 yra downregulated skrandžio vėžio ir susijusius su pacientų prognozę

Norėdami nustatyti išraiška modelio IGFBP3 skrandžio vėžiu, 86-pair chirurginiai egzemplioriai žmogaus skrandžio vėžio ir pagal šalia noncancerous skrandžio buvo nagrinėjami audiniai. Iš IGFBP3 dažymo intensyvumas buvo įmuštas kaip 0 (neigiamas), 1 (silpnai), 2 (vidutinio) arba 3 (tankus), kaip nustatyta nepriklausomai du patologai (pav S2 Failų S1). Rezultatai parodė, kad pasakymas lygis IGFBP3 naviko audiniuose buvo gerokai mažesnis nei gretimose naviko be audinių (p < 0,001, 4a paveikslas ir 4B). Be to, IGFBP3 išraiška buvo vertinami atsižvelgiant į klinikos ypatybių pacientams. IGFBP3 išraiška buvo žymiai mažesnis skrandžio naviko su limfmazgių metastazių (p = 0,045). Be to, aukštos IGFBP3 išraiška nedidelio dydžio navikai (T1 + T2 8/12) buvo dažniau pastebėti lyginant su kad didžiųjų (T3 + T4, 36/74), nors su reikšmingai nesiskyrė (p = 0,062) , Taip pat nebuvo reikšminga koreliacija tarp IGFBP3 saviraiškos ir klinikos funkcijų, įskaitant lytį, amžių ir patologinės klasėje (1 lentelė).
IGFBP3 imunodažymu intensyvumą
klinikinių klasifikacija
Viso
Low (skaičius) Viesbutis High (numeris)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Lytis, amžius ir klinikos ypatumai ir imunohistocheminis rezultatai skrandžio naviko audinių pavyzdžių.
CSV Atsisiųsti CSV

Mes taip pat analizavo tarp IGFBP3 išraiška ir bendras išgyvenamumas skrandžio vėžio ryšį pacientai. Aukštojo išraiška IGFBP3 buvo susijęs su ilgesniu išgyvenimo kartą per 5 metus tolesnių (p = 0,011, Kaplan-Meier išgyvenamumo log-rank testas) (4C pav.)

triuškinantis iš IGFBP3 geno skatina skrandžio vėžio ląstelių migracija ir invazija

Jei įvertinti funkcinį vaidmenį IGFBP3 skrandžio vėžio, mes ištirti ląstelių migraciją ir invazija po knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 buvo selektyviai knockdowned pagal RNR kišimosi į BGC823 ir SGC7901 ląstelių (5a pav ir 5b), kuris turėjo palyginti aukštą endogeninio IGFBP3 į skrandžio ląstelių linijas (pav S3 Failų S1) skydelyje. Rezultatai parodė, kad triukšmo slopinimo išraišką IGFBP3 gerokai padidinti ląstelių migracija tiek transwell migracijos tyrimai (5c ir 5D pav) ir įbrėžimams bandymas (S4 pav Failų S1), kai, palyginti su neigiamos kontrolės siRNA. Be to, knockdowning IGFBP3 rodomas žymiai didesnį aktyvumą ląstelių invaziją į transwell tyrimai (5e ir 5f pav).

IGFBP3 moduliuoja MMP14, UPA ir uPAR
išraiškos

Jei išsiaiškinti galimus mechanizmus, kaip IGFBP3 reguliuoti skrandžio vėžio ląstelių invazinis, mes išnagrinėjome iRNR lygius MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, UPA ir jo receptorių uPAR, kurie visi yra invazija susiję veiksniai, ypač skrandžio vėžio. Po laikinai perkeltų su IGFBP3 siRNA už 72 val į BGC823 ir SGC7901 ląsteles, mRNR ekspresijos lygis MMP14, UPA ir uPAR padidėjo, o iš MMP2, MMP7, MMP9 ar TIMP1 /TIMP2 nėra reikšmingas pokytis buvo stebimas (6a pav.) El cad, SS-kateninai ir E-cad /SS-kateninai kompleksas buvo paimti naudojant skirtingus lizatais, jų lygiai neturėjo prasmingą pokytis po slopinimo IGFBP3 į BGC823 ląstelių (pav S5 Failų S1). Šie rezultatai parodė, kad IGFBP3 slopina skrandžio vėžio ląstelių invaziją per, bent jau iš dalies, moduliuoja MMP14, ÚPA ir uPAR (6B pav) išraiškos.

Aptarimas

Hox superšeimai yra grupė svarbiausių transkripcijos veiksnių, galinčių reguliuoti platinimu ir diferenciaciją embronic ląstelių [29,30]. Be to, netipinė išraiška Hox taip pat vaidina svarbius vaidmenis kelių tipų vėžio [31] progresavimą. Hox baltymai turi didelį pasroviui reguliavimo tinklą ir daryti savo funkcijas daugiausia per šių tikslinių genų [5]. Genomo analizė buvo atlikta ekranas tolesnius genus HoxD10 per nugaros smegenų vystymuisi ir skrandžio vėžio ląstelių [4,32]. Mes ir kiti atskleidė vieną bendrą tikslą genų IGFBP3, kuris buvo pranešta tarnauti kaip naviko slopintuvas [10].

Mūsų tyrimai suteikė pirmąją įrodymų, kad HoxD10 tiesiogiai jungiasi IGFBP3 vykdytoją aktyvuoti IGFBP3 išraišką skrandžio vėžio ląsteles. HoxD10 baltymas gali būti įdarbinti į specifinis promotorius regione IGFBP3 geno, nurodant, kad HoxD10 galėjo tiesiogiai jungiasi prie IGFBP3 geno. Liuciferazės veikla su laukiniais, o ne mutantas, HBS3, HBS4 arba HBS5 buvo gerokai sustiprintas Padidėjusi HoxD10, tai rodo, kad HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) ir HBS5 (CTTTATTATT) buvo trys funkciniai HoxD10 jungimosi vietų promotoriaus regione IGFBP3. Kaip ir tikėtasi, išraiška lygis IGFBP3 mRNR ir baltymų buvo aktyvinama priverstinio išraiška HoxD10 įvairių skrandžio vėžio ląstelių linijoms [4]. Tyrimai parodė, kad Hox baltymai turi keletą pagrindinių konsensuso privalomus elementus, įskaitant TTAT, TAAT ir TTAC [7]. Punktas mutacija su "TTAT" į "TTCT" arba "TCTT" į "TATT" į promotoriaus regione IGFBP3 šioje tyrimo rezultatai parodė, kad "TTAT" arba "TATT" yra svarbūs privalomi svetainių HoxD10. Hox baltymai gali tiesiogiai reguliuoti transkripcijos procesą tolesniems tikslinių genų kaip monomerų arba homodimerami [33]. Nuo DNR surišantis kompetencija savaime Hox baltymų yra palyginti mažas [34], sąveika su kofaktoriais kaip extradenticle (Exd) /PBX ir Homothorax (HTH) /meis baltymai kaip heterodimerus ar heterotrimers yra labai svarbūs tikslinei selektyvumą Hox baltymų [33, 35]. Kitos transkripcijos veiksniai, įskaitant PTEN ir p53 gali reguliuoti IGFBP3 išraišką tuo transkripcijos lygio skrandžio ir storosios žarnos karcinoma ląstelių [36,37]. reikia patikslinti ateityje Tikslios HoxD10 reguliavimo mechanizmai ir dalyvaujančios IGFBP3 reguliavimo kofaktoriai.

iš IGFBP3 išraiška buvo downregulated 86 skrandžio adenokarcinomų audinių, palyginti su jų gretimuose normaliuose audiniuose, ir mažai išraiška IGFBP3 taip pat koreliavo su pažangiomis limfmazgių metastazių, tolimos metastazės ir prastos bendro išgyvenamumo. Mūsų išvados atitiko ankstesnėje ataskaitoje teigiama, kad gerai vidutinio diferencijuoti skrandžio adenokarcinoma buvo žymiai didesnis procentas IGFBP3 dažymo naviko audiniuose nei tie, neturtingose ​​diferencijuoti tuos [38]. Be to, hypermethylation į IGFBP3 rengėjas buvo dažnai aptinkama skrandžio navikų audiniuose [16,39,40]. Funkciniai IGFBP3 SNP (rs2854744 ir rs2960436) nustatydama aukštą IGFBP3 koncentraciją kraujyje buvo susiję su palankios prognozės pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu teikiama paliatyvi chemoterapija [41]. Tačiau kitas tyrimas parodė gana priešingus rezultatus, o tai rodo, kad IGFBP3 išraiška buvo didesnis navikų mėginiuose, nei įprastai gleivinės (54 navikų mėginiuose ir 20 gretimuose normaliuose mėginiai, nesiderino) ir teigiamas išraiška IGFBP3 buvo susijęs su pažangiomis histologinių kokybės, limfmazgių metastazės ir tolima metastazės be didelių skirtumų [42]. Iš intratumor heterogeniškumo ir mokosi kriterijus galimybė gali sukelti skirtingus rezultatus skirtingose ​​klinikinių tyrimų metu. Dideli populiacijos ir perspektyviniai tyrimai buvo leista įvertinti galimą naudingumą IGFBP3 kaip skrandžio vėžio progresavimo biologinis žymuo.

Jei toliau nustatyti IGFBP3 vaidmenį skrandžio vėžio metastazių, mes įvertino savo vaidmenį tolygiam migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles. Paaiškėjo, kad triukšmo slopinimo išraiška IGFBP3 lėmė sparčiai gijimą įbrėžimams žaizdos ir padidėja ląstelių migruojančių per transwell membranos skaičius ar dengta su arba be Matrigel. Ankstesni tyrimai daugiausia dėmesio skiriama IGFBP3 funkcijos ląstelių proliferaciją ir apoptozės. Tik keli tyrimai pranešė, kad buvo susijęs su metastazėmis EB, prostatos vėžio ir HNSCC [13-15]. Triukšmo slopinimo išraišką IGFBP3 gali sukelti ląstelių migraciją, invazija ir metastazes EB [13]. IGFBP3 nokautas pelių patinams dažnis buvo didesnis metastazių plaučiuose ir pirminių prostatos vėžinių ląstelių buvo padidintas daugiau nei 3 kartus invazinis, palyginti su tuo laukinių tie [14]. Adenovirusiniai ir rekombinantinis IGFBP3 slopinamas vaskuliarizacijos bei angiogenezę stimuliuojančio veiklą HNSCC ir slopina kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) gamybą [15]. Migracija ir invazija palengvina daugelio veiksnių, galinčių paskatinti epitelio-mezenchiminių perėjimo (EMT) skaičius, kaip ir E-cad, SS-kateninai ir veiksnių suyrančios tarpląsteliniame užpilde, įskaitant MMP, UPA ir tt [43]. EB ląsteles, siRNR orientacija IGFBP3 padidina MMP2 [13] išraiška.

• PLoS ONE: cisplatinos arba Ne išplitusiu skrandžio vėžiu: sisteminė apžvalga ir meta-Analysis
• PLoS ONE: Optimalus trukmė fluorouracilu-Based palaikomoji chemoterapija Pacientų rezektabilus Skrandžio Cancer