PLoS One: IGFBP3, a transzkripciós Target of Homeobox D10, korrelál a gyomorrák prognózisa

absztrakt katalógusa

Homeobox D10 (HoxD10) fontos szerepet játszik a differenciálódását embrionális sejtek és a progresszió a mellrák. A mi korábbi jelentés feltárta, hogy az inzulin-szerű növekedési faktor kötő fehérje-3-ból (IGFBP3) szabályozták HoxD10 gyomorkarcinómában sejtekben; azonban a funkcionális szerepek és az alatta mechanizmusai IGFBP3 gyomorrákban továbbra sem tisztázott. Itt azt találtuk, hogy a kifejezés a IGFBP3 arra serkentett után ektópiás expressziója HoxD10 a gyomor rákos sejtekben. A kromatin immunprecipitációs vizsgálat azt mutatta, hogy HoxD10 kötődik a három potenciális régióiban IGFBP3 promóter. Exogén HoxD10 szignifikánsan fokozta az aktivitást a luciferáz riporter ezeket tartalmazó kötő régiók gyomor rákos sejtekben. További adatok azt mutatták, hogy az összes ilyen kötőhelyek volt Hox kötelező elem "TTAT". Az immunhisztokémiai eredmények azt mutatták, hogy az IGFBP3 expressziója szignifikánsan csökkent expressziót 86 gyomor adenocarcinoma szövetek képest a szomszédos, nem rákos szövetekben (p < 0,001). Sőt, az IGFBP3 expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a gyomor tumor nyirokcsomó-metasztázis képest, hogy anélkül, nyirokcsomó-metasztázis (p = 0,045). A betegek nagy expressziós szint IGFBP3 megmutatta kedvező 5 éves teljes túlélés (p = 0,011). Kiütése IGFBP3 gyorsított gyomorrák sejt migrációs és behatolás és az indukált expressziója invazív tényezőket, többek között MMP14, uPA és uPAR. Így adataink szerint HoxD10 célzott gén IGFBP3 elnyomhatja gyomorrák sejtek invázióját, és előnyben részesíti a túlélés gyomorrákos betegek. Katalógusa

Citation: Xue M, Fang Y, V G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, egy transzkripciós Target of Homeobox D10, korrelál a gyomorrák prognózisa. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423 katalógusa

Szerkesztő: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: június 21, 2013; Elfogadva: október 13, 2013; Megjelent: december 27, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Xue et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), a Nemzeti Alap Research Program of China (973 program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) és Kutatási Alap Doktori Program Felsőoktatási Kína (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb rák, és jelenleg a második vezető oka a rák okozta halál világszerte [1]. Közel fele a gyomor caner betegek már a fejlett, hogy a késői szakaszban nyirok vagy a távoli áttét a diagnózis felállításakor és elveszítik a lehetőséget a műtét [2]. Ezek a betegek a rossz eredményt, és az ötéves túlélési arány azoknak a távoli metasztázis kevesebb, mint 5% [3]. Progresszióját gyomorrák kell tekinteni egy többlépcsős folyamat, amely magában aktiválását onkogének és inaktiválása tumor szuppresszor gének. Korábban már bemutattuk, hogy homeobox D10 (HoxD10) szolgált tumorszuppresszor azáltal, hogy elnyomja a tumor növekedését és invazivitását, melyet epigenetikusan hangtompítós gyomorrákban [4].

HoxD10 gén tartozik a homeobox szupercsaládba amely transzkripciós faktorokat kódolnak, és gyakoroljunk funkciók elsősorban az aktiválás vagy elnyomása downstream target gének [5]. Amino-terminális kar a Hox homeodomain több mag konszenzus kötelező elemek, beleértve a TTAT, Taat és TTAC [6,7]. Például HoxC8 kötődik ezeket az elemeket a promóter régiók és modulálja a transzkripciós tevékenységét pedf, NCAM, Zac1, OPN és Cdh11 által meghatározott, magas egész kromatin immunprecipitációs vizsgálatok és a globális HoxC8 DNS-kötő hely elemzés [7]. Vizsgálatok kimutatták, hogy HoxD10 gátolja a angiogenezis és a sejtmozgás és endometrium rák (Ec) [8] és rontja a sejt behatolásra gyomor- és emlőrák [4,9]. Azonban keveset tudunk a mechanizmusok hogyan HoxD10 fejti ki funkcióit karcinogenezissel és a tumor progresszióját. Mi már rendszeresen ellenőrzik a potenciális célpontjai HoxD10 cDNS microarray és az azonosított több gén, köztük az inzulin-szerű növekedési faktor kötő fehérje-3-ból (IGFBP3), hogy lehet felelős a tumor gátló hatását HoxD10 gyomorrákban [4].

IGFBP3 jelentős IGFBP faj forgalomban, kötő több mint 75% a keringő inzulin növekedési faktor-I (IGF-I) [10]. Ez lehet gátolja a sejtproliferációt és indukálja sejt apoptózis számos típusú rák, beleértve a prosztata- és a gyomor rák [11,12]. Számos tanulmány igazolta, hogy az IGFBP3 elnyomja a invazivitását endometrium rák (Ec) sejtek [13], metasztázis prosztatarákban [14], és az angiogenezis fej-nyaki pikkelysejtes karcinóma (HNSCC) [15]. Ez általában úgy vélik, hogy az IGFBP3 blokkolhatják a kötő régióját az IGF-I a saját receptor IGF-IR, és így megszünteti a hatás az IGF /IGF-IR tengely. Emellett a függőség IGF /IGF-IR tengely létezik alternatív IGF /IGF-IR független és nukleáris transzlokációt módon [10]. Számos tényező már tisztázták, hogy szabályozza a kifejezés a IGFBP3, beleértve a retinsav, a tumor nekrózis faktor-α, Trichostatin A, kaudális típusú homeobox 2 (CDX2), és a metilációs állapotát maga [10,16]. A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az IGFBP3-ben fokozódik AGS és MKN28 sejtek overexpresszáló HoxD10 [4]. Tekintettel promóter régiójában IGFBP3 számos potenciális kötőhelyek HoxD10, megjósolta PROMO, a program előrejelzése transzkripciós faktor kötőhelyek [17], HoxD10 amely közvetlenül kapcsolatban vannak IGFBP3 szabályozásában gyomorrák sejtek invázióját. Megvilágítása Ez a hálózat további betekintést a szerepét IGFBP3 gyomorrákban.

A jelen tanulmányban azt állapította meg, hogy HoxD10 amely közvetlenül kötődik a promóter régiójában IGFBP3 potenciálisan keresztül TTAT elem, így a transzkripció szabályozza a kifejezés a gyomorrák. Ezen felül, expressziós szintjének IGFBP3 gyakran downregulált gyomorkarcinómában szövetek és kapcsolódik a teljes túlélés, ami arra utal, hogy az IGFBP3 fontos szerepet játszik a gyomorrák progresszió. Funkcionálisan IGFBP3 lehetett elnyomják a migrációs és behatolás a gyomor rákos sejtek, legalábbis részben, a szabályozás e invazív tényezőt, beleértve metalloproteináz-14 (MMP14) és az urokináz-típusú plazminogén aktivátor (uPA).

anyagok és módszerek katalógusa

Sejtkultúra katalógusa

nyolc gyomor rákos sejtvonalak (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 és SGC7901) kaptuk Riken Génbank (Tsukuba, Japán) és az American Type Culture Collection (Manassas, amerikai Egyesült Államok). Egy nem-malignus gyomor sejtvonal (GES-1) kapjuk a pekingi Institute for Cancer Research (Peking, Kína). A sejteket RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen, Carisbad, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS, Sijiqing, Huzhou, Kína), és inkubáljuk, 5% CO _{2, 37 ° C-on és 95% -os páratartalom mellett.}

építése IGFBP3 luciferáz riporter plazmid

Három különböző fragmensek promoter régiójában IGFBP3, beleértve -2.282-56 bp (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 kötőhely I, HBSI) és -1727 ~ -943 bp (HBSII), PCR-rel amplifikáltuk használatával genomiális DNS-t kivonjuk a HEK-293T vad sejteket templátként. HBSI felöleli HBS1 és 2. HBSII tartalmaz a HBS3, 4. és 5., amelyben HBS1-5 az előrejelzések szerint PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS primer szekvenciák a következők voltak: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'és 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'és 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'és 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. A PCR-fragmenseket ligáltuk PGM-T-vektorba (Tiangen, Peking, Kína), emésztettük KpnI /Bglll (Promega, Madison, USA), majd szubklónoztuk a KpnI /BglII helyek a pGL3-basic vektor (Promeg) generálására pGL3-pIGFBP3-alap luciferáz riporter plazmidok, és a pGL3-promoter vektorba (Promega) generálására pGL3-HBSI (II) -promoter luciferáz riporter plazmid. Minden konstrukciókat DNS-szekvenálással igazoltuk.

Építőipari luciferáz riporter plazmidok HBSS

szintetizált oligonukleotidok megjósolt Hox kötőhelyek (HBSS) promoter régióiban IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp), és minden egyes ponton a mutáns helyén (A → C), oligonukleotidok a következők voltak:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'és 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

mutáns HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'és 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'és 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

mutáns HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'és 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'és 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

mutáns HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'és 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

A kétszálú HBS összeforrasztjuk, és beiktatjuk a upstream pGL3-promoter vektorba, létrehozva a luciferáz riporter plazmid [18]. Minden konstrukciókat DNS-szekvenálással igazoltuk.

Cell transzfekció

Gyomor cacner sejtek (BGC823 és SGC7901) transzfektáltunk pcDNA3.1-HoxD10 vagy pcDNA3.1 üres vektort Fugene HD (Promega) . A generál stabil HoxD10 overexpresszió sejtvonalak fenti transzfektált sejteket szelektáltuk 400 ug /ml G418-at (Merck, Darmstadt, Németország), egy másik 14 nap. Az siRNS-közvetített gén knockdown, BGC823 és SGC7901 sejteket transzfektáltunk negatív kontroll siRNS vagy IGFBP3 célzott siRNS (Qiagen, Hilden, Németország), HGC27 sejteket transzfektáltunk negatív kontroll siRNS vagy HoxD10 célzott siRNS (Genepharma, Shanghai, Kína) Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen).

A luciferáz-aktivitás assay

1,0 × 10 ^{5 BGC823 és SGC7901 sejteket szélesztettünk 24 üregű lemezeken 24 órás, majd transzfektált 0.4μg pcDNA3.1 üres vektorral vagy pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-alap (promoter) üres vektorral vagy pGL3-pIGFBP3 (HBS) -basic (promoter), és 0.004μg pRL-TK vektor (Promega) tartalmazó referencia ellenőrzés renilla Fugene HD [18]. A luciferáz aktivitást analizáltuk a kettős luciferáz riporter vizsgálati rendszer követően 48 órával, a gyártó protokollja szerint (Promega).}

A kromatin immunprecipitáció (chip)

stabil HoxD10 overexpresszált BGC823 és SGC7901 sejtvonalak, a kromatin volt immunoprecipitáltuk HoxD10 monoklonális antitesttel (nyúl, santa Cruz Biotechnology Inc., santa Cruz, USA) [19] vagy normál nyúl IgG-t (negatív kontroll) a Simple ChIP enzimatikus kromatin IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , USA). A kicsapott DNS-ek vagy 2% bemeneti minták genomi DNS-HEK-293T vad sejteket amplifikáltuk Taq DNS-polimerázt (TaKaRa, Otsu, Japán) [20,21]. Négy primerek felölelő HBS-ben a különböző helyszíneken a IGFBP3 promoter terveztünk a következő: A1 (-2251 ~ -2073 bp, a HBS1 és 2.), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'és 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 bp, az HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'és 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp számára HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'és 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp számára HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'és 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

reverz transzkripciós PCR

Teljes RNS-t izoláltunk Trizol reagens (Cwbiotech, Peking, Kína). Reverz transzkripció (RT) -PCR határoztuk M-MLV reverz transzkriptáz (TaKaRa), és Taq DNS-polimeráz. A következő primereket használtuk amplifikáció:

GAPDH, 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'és 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'és 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'és 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'és 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'és 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'és 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'és 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

szöveti inhibitora metalloproteináz-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'és 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'és 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'és 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'és 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Western blot katalógusa

Az összes fehérjéket kivontuk RIPA lízis puffer (Beyotime, Haimen, Kína). Triton X-100 lízis puffert használt kivonat oldható E-cadherin és az SS-catenin, SDS lízis puffert alkalmaztunk a kivonat oldhatatlan E-cadherin /SS-catenin komplex [22]. A lizátumokat megoldódott SDS-PAGE gél, és átvittük PVDF-membránokra (Millipore, Bedford, USA). A blotokat próbaként HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), az IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-cadherin (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), SS-catenin ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) vagy a GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) antitestekkel. A foltokat tettük láthatóvá kemilumineszcenciás Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokió, Japán). A relatív sűrűsége fehérjéket mennyiségileg fényképek J. szoftvert és normalizáljuk GAPDH [20].

sebgyógyító assay

BGC823 és SGC7901 sejteket transzfektáltunk IGFBP3 siRNS vagy kontroll negatív siRNS hat lyukú lemezekre, majd karcos egy p10 pipetta hegyét, hogy rés keletkezzen. Az üregeket öblítjük PBS eltávolítására kényszerült sejteket és friss tápközeggel (1% FBS BGC823 és szérummentes számára SGC7901) adunk hozzá. Három randomizált képek a karcos területeket vettük (× 40 nagyítás) felett 0h, 12h és 24h. [23] katalógusa

Transwell migrációs és behatolás vizsgálatokban katalógusa

Cell migrációs és behatolás értékelték módosított Boyden transwell kamrák (Corning Inc., Corning, USA), bevonata (invázió) vagy anélkül (migrációs) Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNS transzfekció és az éhezés sejteket a felső kamrába tápközegben, amely 1% FBS-t (BGC823), vagy nem FBS (SGC7901), táptalaj, 15% FBS-t adtunk az alsó kamrába, a sejteket a felső kamrában óvatosan eltávolítjuk inkubáció után 16 óra (migráció), vagy 36h (invázió). A migrált sejteket megfestettük 0,5 jig /ml DAPI-festés oldat (Roche, Penzberg, Németország). A sejtek számát véletlenszerűen számítani öt területen (× 400-szoros nagyítás) [24]. Megtámadta sejteket Cell Stain Solution (Millipore), és fényképezett (× 200). A színezék elegyet mostuk Extraction Buffer és átvisszük egy 96-lyukú kolorimetrikus mérés 560nm egy mikrotiterlemez-leolvasó (Thermo, Boston, USA) [25,26].

A betegek és a mintákat

86 sebészeti betegek gyomor adenokarcinóma vontak a 2007 májusa és 2008 februárja után aláírásával beleegyezésüket adták. Ez a tanulmány által jóváhagyott Clinical Research Etikai Bizottsága Sir Run Run Shaw Kórház Zhejiang University. Egyező tumor szövetek és a szomszédos tumormentes szöveteket kapunk. A betegek klinikopatológiai adatok, beleértve a nem, az életkor, a TNM szakaszok és patológiai fokozat kerestek vissza az orvosi feljegyzések. A nyomon követés végeztünk egy 1 éves intervallumban a műtét után, a kórtörténetet értek el, amikor a beteg jött későbbi látogatást. A nyomon követés kikapcsolási ideje volt 2012. augusztus, és a medián követési idő 35 hónap volt (tartomány: 1-63 hónap).

Tissue microarray és immunhisztokémiai festéssel katalógusa

erek mérése 1,5 mm a legnagyobb mérete vágtunk a nem nekrotikus területek kiegyenlített tumorszövetmintákból szomszédos tumormentesen szövetekben. Tissue microarray diák tartalmazó 4μm vastag microarray metszeteket standard technikák alkalmazásával szerkeszthetünk (együttműködve Shanghai Superchip Company, Ltd., Shanghai, Kína). A lemezeket inkubáltuk IGFBP3 antitesttel (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd inkubáljuk a Envision-plus érzékelő rendszer (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Koppenhága, Dánia). A metszeteket kifejlesztett 3,3'-diaminobenzidin megoldás értelmében mikroszkópos megfigyelés és hematoxilinnel ellenfestettük [27]. Szövetei előrehaladott emlőrák festettük a pozitív kontrollal [28]. A pozitív sejtek arányát minden egyes minta mennyiségileg mikroszkóp alatt, és négy csoportba sorolhatók. 0: 0-5% pozitív sejtek; 1: 6% és 50% pozitív sejtet; 2: 51% -ról 75% pozitív sejteket, és 3: 76-100% -ban pozitív sejteket. Az intenzitás IGFBP3 festést osztályozni, mint a következő: nincs festés = 0; gyenge festődés = 1; mérsékelt festődés = 2; sűrű festés = 3. A pontszám az intenzitás és a pozitívak aránya festés definiáltuk IGFBP3 festés pontszámot. A pontszám 0-3 tekintettük alacsony expressziója és 4-9 magas kifejezés.

Statisztikai analízis

A differenciális expresszióját IGFBP3 között a tumoros szövetekben és a nem tumoros szövetekben határoztuk meg Mann-Whitney U-teszt. Chi-négyzet tesztet használják, hogy elemezzék a kapcsolatok között klinikopatológiai jellemzők és IGFBP3 festés pontszámok. Annak a valószínűsége, a teljes túlélés számoltuk a Kaplan-Meier-módszerrel, és a különbség görbék értékeltük a Log-rank teszt. A cutoff p < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

HoxD10 upregulálja kifejezése IGFBP3 katalógusa

genomot elemzés kimutatta, hogy több gén beleértve IGFBP3 szabályozták által HoxD10 a gyomorrák sejtek a korábbi tanulmány (4). Annak meghatározására, hogy HoxD10 lehetett transzkripció expresszióját szabályozzák IGFBP3 gyomor rákos sejtekben, azt figyeltük meg az expressziós szintjének IGFBP3 után stabil bejuttatását HoxD10 génnek BGC823 és SGC7901 sejtek, vagy tranziensen bontani a HoxD10 a HGC27 sejtekben. RT-PCR és Western blot eredmények következetesen azt mutatták, hogy a kifejezés a IGFBP3 szignifikánsan emelkedett a HoxD10 overexpresszált sejtekben (ábra az 1A és 1B), míg downregulált után csendesítése HoxD10 a HGC27 sejtekben (ábra 1c és 1d).

Egy 2,3 kb-szekvenciát (-2.282-56 bp) a upstream régióját IGFBP3 klónoztuk pGL3-basic vektor és értékelésére használt luciferázaktivitást kettős luciferáz riporter vizsgálati eljárásokban. Eredmények igazolták, hogy az IGFBP3 promotor aktivitást BGC823 és SGC7901 sejtek fokozza a 4.2 és 3.8 redők rendre után kotranszfektáltuk pcDNA3.1-HoxD10 viszonyítva pcDNA3.1 vektorral transzfektánsok (p < 0,01, ábra 1E). Összefoglalva, ezek az adatok arra utalnak, hogy HoxD10 lehetett transzkripció upregulate expresszióját IGFBP3 pedig gyomor rákos sejtekben.

azonosítása újszerű szabályozási régiók az IGFBP3 promoter felelős HoxD10

következő elemezte a potenciális HoxD10 kötőhelyek IGFBP3 promóter. A 2,3 kb upstream szekvenciáját IGFBP3 gént bevinni PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), a program előrejelzése transzkripciós faktor kötőhelyek egy sorba, illetve a kapcsolt szekvenciák (17 ), és az 5. potenciális HoxD10 kötőhelyek (HBS1 ~ 5) jósoltak (táblázat S1). Amint azt a 2A ábra, az öt HBS arra lokalizálódik -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) és -953 ~ -944bp (HBS5) ill. Stabil HoxD10 túlzott mértékben BGC823 és SGC7901 sejtek kötődését régiók IGFBP3 promoter vizsgáltuk Chip vizsgálatokban. Azonosítottuk, hogy a kromatin kicsapjuk HoxD10 specifikus antitest amplifikáltuk A2, A3 és A4 primerek, amely magában foglalja HBS3, HBS4 és HBS5 volt, míg nem amplifikáció volt megfigyelhető A1 primerek felölelő HBS1 és 2 (2b ábra).

Ahhoz, hogy tovább a szabályozó szegmensek IGFBP3 promoter által HoxD10, mi klónozott 2 különböző DNS-fragmentumok, amelyek közé HBSI (HBS1 és 2) és HBSII (HBS3, 4 és 5), illetve a SV40 promoter a luciferáz riporterek. Az eredmények azt mutatták, hogy a ko-transzfektált HoxD10, HBSII fokozott SV40 promoter aktivitás 4,0-szeres, amikor azokkal szemben, üres vektorral transzfektánsok BGC823 sejtekben (P < 0,01, 3A ábrán). Ezzel szemben, a HBSI nem mutatott szignifikáns hatást az SV40 promoter aktivitását (3A ábra). Hasonló eredményeket tárt fel egy másik független SGC7901 sejtek, az SV40 promoter aktivitása változik 3,3 és 0,9-szeresére HBSII és HBSI volt (ábra S1A File S1).

HBS3, 4 és 5 megosztott közös kötelező elem "TTAT", míg HBS1 vagy HBS2 ezek egyike sem elemeket. Mi feltevés, hogy HoxD10 közvetlenül kötődik a promóter IGFBP3 a "TTAT" oldalakra. Ennek megerősítéséhez előállítottuk 10 bp oligonukleotidot tartalmazó szekvenciák HBS3, HBS4 és HBS5 volt. Amint az a 3B ábra, az SV40 promotert aktivitásokat fokozni 1,8, 2,0, és 2,7 redők rendre ha együtt transzfektált HoxD10 plazmid BGC823 sejtekben, míg pont mutánsai HBS3, HBS4 és HBS5 nem mutatott jelentős változást. Mi reprodukálni hasonló eredményeket SGC7901 sejtek (ábra S1B File S1).

Együttesen fenti eredmények azt jelzik, hogy az IGFBP3 közvetlen célpontja HoxD10 a gyomor rákos sejtekben. Mi három olyan funkcionális kötések oldalak között -1727 ~ -943bp az upstream IGFBP3 felelős gén HoxD10. HoxD10 lehetett közvetlenül kötődnek a promóter IGFBP3 potenciálisan keresztül Hox kötelező elem "TTAT".

IGFBP3 van downregulált gyomorrákban és kapcsolódó betegek prognózisát katalógusa

Az egyes expressziós mintázata IGFBP3 gyomorrákban, 86-pair sebészeti mintákban az emberi gyomorrák és a szerint a szomszédos jóindulatú gyomorfekély szöveteket vizsgáltuk. Az intenzitás a IGFBP3 festődést pontoztuk 0 (negatív), 1 (gyenge), 2 (közepes) vagy 3 (sűrű), meghatározva függetlenül két patológusok (ábra S2 Fájl S1). Az eredmények azt mutatták, hogy az expressziós szintje IGFBP3 tumor szövetekben jelentősen alacsonyabb volt, mint a szomszédos tumormentes szövetekben (p < 0,001, ábra a 4A és 4B). Továbbá, az IGFBP3 expressziós értékeltük, tekintettel a klinikopatológiai jellemzői a betegeknél. IGFBP3 kifejezés szignifikánsan alacsonyabb volt a gyomor tumor nyirokcsomó áttét (p = 0,045). Ezen túlmenően, a magas IGFBP3 expresszió kis méretű tumorok (T1 + T2, 8/12) volt gyakrabban figyeltek képest, hogy a nagyok (T3 + T4, 36/74), bár nem volt szignifikáns különbség (p = 0,062) . Szintén nem volt szignifikáns összefüggés kifejezése IGFBP3 klinikopatológiai jellemzők, beleértve a nem, az életkor és a kóros állapot (1. táblázat).
IGFBP3 immunfesté intenzitás katalógusa Klinikai besorolás katalógusa száma katalógusa Low (szám) hotelben Magas (szám) hotelben p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1 Kor, nem és klinikopatológiai jellemzők és immunhisztokémiai eredmények gyomor tumor szövetminta.
CSV letöltése CSV

tovább elemeztük az összefüggést a kifejezése IGFBP3 és a teljes túlélés a gyomorrák betegek. Magasabb kifejezése IGFBP3 járt hosszabb túlélési időt az 5 éves követés (p = 0,011, Kaplan-Meier túlélési Log-rank teszt) (4C). Katalógusa

kiütése IGFBP3 gén elősegíti a gyomor rákos sejt migrációs és behatolás katalógusa

Hogy értékelje a funkcionális szerepe a IGFBP3 gyomorrákban, megvizsgáltuk a sejtek migrációját és invázióját követően knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 szelektíven knockdowned RNS interferencia BGC823 és SGC7901 sejtek (ábra 5A és 5B), amelynek relatív magas szintű endogén IGFBP3 egy panel a gyomor sejtvonalak (ábra S3 Fájl S1). Az eredmények azt mutatták, hogy a hangtompító expressziója IGFBP3 jelentősen megerősített sejtmigrációt mind Transwell migrációs assay (5C és 5D) és karcolás teszt (ábra S4 Fájl S1), amikor összehasonlítottuk a negatív kontroll siRNS. Ezen túlmenően, knockdowning IGFBP3 jelenik szignifikánsan magasabb aktivitást a celluláris invázió a Transwell assay (5E ábra és 5F).

IGFBP3 modulálja megnyilvánulásai MMP14, az UPA és uPAR katalógusa

Annak kiderítésére, hogy a lehetséges mechanizmusok hogyan IGFBP3 szabályozzák a invazivitásának gyomorrák sejtek, megvizsgáltuk a mRNS szintje MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA és receptora uPAR, amelyek mind invázió összefüggő tényezők, különösen a gyomorrák. Miután tranziensen transzfektált IGFBP3 siRNS 72 órán át in BGC823 és SGC7901 sejtek, az mRNS expressziós szintjét MMP14, uPA és uPAR emelkedett, míg nincs jelentős változás az MMP2, MMP7, MMP9 vagy TIMP1 /TIMP2 volt megfigyelhető (6a ábra). E-cadherin, ß-catenin és E-cadherin /ß-catenin komplex nyerték különböző lizátumában, a szintek nem volt érdemi változás után hangtompító IGFBP3 pedig BGC823 sejtek (ábra S5 Fájl S1). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az IGFBP3 gátolja az invázió gyomorrák-sejtek révén, legalábbis részben, modulálására kifejezései MMP14, uPA és uPAR (6B).

Discussion

Hox szupercsalád egy csoport fontos transzkripciós faktorok, amelyek szabályozzák a proliferációját és differenciálódását embronic sejtekre [29,30]. Ezen túlmenően, a rendellenes expressziója Hox is játszik kritikus szerepet progressziójának többféle rák [31]. Hox fehérjék egy nagy lefelé szabályozó hálózat és fejtik ki funkciók elsősorban ezek célgének [5]. Genomra kiterjedő elemzést végeztek, hogy átvizsgáljuk a downstream gének HoxD10 során gerincvelő fejlődése és gyomorrák sejtek [4,32]. Mi és mások kimutatták, egy közös célgén IGFBP3, amely leírták, hogy szolgáljon egy tumorszuppresszor [10].

A vizsgálatok alapján az első bizonyíték arra, hogy HoxD10 közvetlenül kötődik az IGFBP3 promoter aktiválásához kifejezése IGFBP3 a gyomor rákos sejteket. HoxD10 fehérje vehető fel az adott promóter régiójában IGFBP3 gén, amely jelzi, hogy HoxD10 amely közvetlenül kötődik az IGFBP3 gént. A luciferáz aktivitást a vad, míg nem mutáns HBS3, HBS4 vagy HBS5 jelentősen növeli overexpressziója HoxD10, ami arra utal, hogy a HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) és HBS5 (CTTTATTATT) három funkcionális HoxD10 kötőhelyek a promoter régió IGFBP3. Ahogy az várható volt, az expressziós szintjének IGFBP3 mRNS és fehérje arra serkentett erőltetett expressziója HoxD10 különböző gyomor rákos sejtvonalakban [4]. Tanulmányok kimutatták, hogy Hox fehérjék néhány alapvető konszenzus kötési elemek, beleértve TTAT, Taat, és TTAC [7]. Point mutáció a "TTAT", hogy "TTCT" vagy "TCTT", hogy "Tatt" a promóter régiójában IGFBP3 a jelen tanulmányban azt mutatják, hogy a "TTAT" vagy "Tatt" fontos kötőhelyek HoxD10. Hox fehérjék lehetne közvetlenül szabályozza a átírási folyamat downstream célgének monomerként, vagy homodimerek [33]. Mivel a DNS-kötő hatáskörébe Hox fehérjék is viszonylag alacsony [34], kölcsönhatások cofactors mint extradenticle (Exd) /PBX és Homothorax (hth) /Meis fehérjék heterodimert vagy heterotrimerek kritikus a cél szelektivitása Hox fehérjék [33, 35]. Más transzkripciós faktorok, beleértve a PTEN és a p53 lehetett expresszióját szabályozzák IGFBP3 transzkripciós szinten a gyomor és a vastagbél karcinóma sejtek [36,37]. A pontos HoxD10 szabályozó mechanizmusok és cofactors szabályozásában vesz részt az IGFBP3 tisztázni kell a jövőben.

A kifejezés a IGFBP3 volt downregulált 86 gyomor adenocarcinoma szövetek képest a szomszédos normál szövetben, és alacsony kifejeződése IGFBP3 is korrelál fejlett nyirokcsomómetastasis, távoli áttétek és az általában gyenge túléléssel. Eredményeink összhangban vannak a korábbi jelentésben, hogy jól vagy közepesen differenciált gyomor adenocarcinoma volt szignifikánsan nagyobb aránya IGFBP3 festés daganatos szövetek, mint azok a szegény differenciált is [38]. Ezen túlmenően, hipermetiláció a promoter IGFBP3-ben gyakran észlelt gyomor tumor szövetekben [16,39,40]. Funkcionális IGFBP3 SNP (rs2854744 és rs2960436) meghatározására nagy IGFBP3 keringő szinttel együtt kedvező prognózist betegek előrehaladott gyomorrák részesülő palliatív kemoterápia [41]. Ugyanakkor egy másik tanulmány azt mutatta, a meglehetősen ellentétes eredményeket, ami arra utal, hogy a kifejezés a IGFBP3 magasabb volt tumor mintákban, mint hogy a szokásos nyálkahártya (54 tumor minták és 20 szomszédos normál mintákat, nem párosított), és a pozitív expresszióját IGFBP3 társult előrehaladott szövettani évfolyam, nyirokcsomó áttét, illetve távoli áttét nélkül szignifikáns különbség [42]. Az a lehetőség, tumorba heterogenitás és beiratkozott kritériumok kiválthatják különböző eredményeket a különböző klinikai vizsgálatokban. A lakosság nagy és jövőkutatás engedték, hogy értékelje a potenciális használhatóságát IGFBP3 biomarkere progresszióját gyomorrák. Katalógusa

további azonosítására szerepének IGFBP3 a metasztázis gyomorrák értékeltük szerepe a modulációs a migrációs és behatolás a gyomor rákos sejteket. Kiderült, hogy hangtompító expressziója IGFBP3 eredményezte gyors gyógyulás a karcolás sebet, és a sejtek számának növekedését átvonuló transwell membrán-e bevonva vagy anélkül Matrigel. Korábbi tanulmányok főként összpontosított a funkciója IGFBP3 a sejtproliferációban és az apoptózis. Csak néhány tanulmány számolt azt összefügg metasztázis EK, a prosztata rák és a HNSCC [13-15]. Hangtompító kifejezése IGFBP3 idézhet sejtek migrációját, invázióját és áttét EK [13]. IGFBP3 knockout hím egerek voltak nagyobb gyakoriságát a tüdő metasztázisok és a invazivitását primer prosztata tumorsejtek nőtt 3-szorosára, amikor összehasonlítottuk a vad is [14]. Adenovírus és rekombináns IGFBP3 gátolta vaszkularizáció és az angiogenezist serkentő tevékenységének HNSCC elnyomásával a termelés a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) [15]. Migrációs és behatolás segítik a számos tényező képes indukálni epithelialis-mesenchymalis átmenet (EMT), mint az E-cadherin, SS-catenin és tényezők lebontására az extracelluláris mátrix, beleértve az MMP-k, az UPA és így tovább [43]. Az EK-sejtek, siRNS célzási IGFBP3 növeli a kifejezés a MMP2 [13].

• PLoS One: Cisplatin vagy nem előrehaladott gyomorrákban: rendszeres felülvizsgálatát és meta-Analysis
• PLoS One: optimális időtartama fluorouracil alapú adjuváns kemoterápia betegek operálható Gyomor Cancer