PLoS ONE: IGFBP3, een transcriptioneel doel van Homeobox D10, is gecorreleerd met de prognose Gastric Cancer

Samenvatting

Homeobox D10 (HoxD10) speelt een belangrijke rol bij de differentiatie van embryonale cellen en progressie van borstkanker. Onze eerdere rapport bleek dat insuline-achtige groeifactor bindend proteïne-3 (IGFBP3) werd geregeld HoxD10 bij maagkanker cellen; De functionele rol en de onderliggende mechanismen van IGFBP3 bij maagkanker onduidelijk. Hierbij bleek dat de expressie van IGFBP3 werden opgereguleerd na ectopische expressie van HoxD10 bij maagkanker cellen. Chromatine immunoprecipitatie assay toonde dat HoxD10 gebonden aan drie potentiële gebieden van IGFBP3 promoter. Exogene HoxD10 aanzienlijk verbeterde de activiteit van luciferase reporter die deze bindende regionen maagkanker cellen. Verdere gegevens bleek dat al deze bindingsplaatsen had Hox bindend element "ttat". Immunohistochemische kleuring resultaten bleek dat IGFBP3 expressie was significant neerwaarts gereguleerd in 86 gastrisch adenocarcinoom weefsels ten opzichte van hun naburige niet-kankerachtige weefsels (p < 0,001). Bovendien was IGFBP3 expressie significant lager in maagtumor met lymfeknoop metastasen vergeleken met die zonder lymfeklier (p = 0,045). Patiënten met een hoge expressie van IGFBP3 toonde gunstige 5 jaar de totale overleving (p = 0,011). Knockdown van IGFBP3 versnelde maagkanker cel migratie en invasie en geïnduceerde de expressie van invasieve factoren, waaronder MMP14, uPA en uPAR. Zo, onze gegevens suggereren dat HoxD10-gerichte gen IGFBP3 maagkanker cel invasie kan onderdrukken en bevordert de overleving van maagkankerpatiënten

Visum:. Xue M, Fang Y, Zon G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, een transcriptie van Target Homeobox D10, is gecorreleerd met de prognose van maagkanker. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10.1371 /journal.pone.0081423

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 21 juni 2013; Geaccepteerd: 13 oktober 2013; Gepubliceerd: 27 december 2013

Copyright: © 2013 Xue et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Nationale Basic Research Program van China (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) en Fonds voor onderzoek de Doctoral Programma van Hoger Onderwijs van China (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en op dit moment is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Bijna de helft van de maag Caner patiënten hebben al gevorderd tot de late fase met lymfatische of verre metastase bij diagnose en verliest de mogelijkheid voor een operatie [2]. Deze patiënten hebben een slechte uitkomst en de vijf-jaars overlevingskans voor mensen met verre metastase is minder dan 5% [3]. De progressie van maagkanker wordt beschouwd als een proces van meerdere stappen dat de activering van oncogenen en inactivering van tumor suppressor genen omvat zijn. We hebben eerder weergegeven dat homeobox D10 (HoxD10) diende als een tumor suppressor door het onderdrukken van tumorgroei en invasiviteit, die epigenetisch stil bij maagkanker [4].

HoxD10 gen behoort tot de homeobox superfamilie, die coderen voor transcriptiefactoren en uit te oefenen functies voornamelijk via de activering of onderdrukking van de downstream doelgenen [5]. Amino-terminale arm van de Hox homeodomein heeft een aantal kernactiviteiten consensus bindende elementen, waaronder ttat, TAAT en TTAC [6,7]. Zo HoxC8 bindt deze elementen in promotergebieden en moduleert de transcriptionele activiteiten van pedf, NCAM, Zac1, Opn en Cdh11, zoals bepaald door hoge-gehele chromatine immunoprecipitatie assays en globale HoxC8 DNA-bindingsplaats analyse [7]. Studies hebben aangetoond dat HoxD10 remt de angiogenese en celbeweeglijkheid in endometriumcarcinoom (EC) [8] en schaadt de cel invasiviteit van maag- en borstkanker [4,9]. Er is echter weinig bekend over de mechanismen van hoe HoxD10 oefent zijn functies in en progressie van kanker. We hebben systematisch op de mogelijke doelwitten van HoxD10 door cDNA microarray en geïdentificeerd meerdere genen, waaronder insuline-achtige groeifactor bindend proteïne-3 (IGFBP3) die van het tumor onderdrukkende effect van HoxD10 bij maagkanker [4] kan zijn.

IGFBP3 is een belangrijke IGFBP species in omloop binding dan 75% van de circulerende insuline groeifactor-I (IGF-I) [10]. Het kon celproliferatie remmen en induceren apoptose van verschillende soorten kanker, waaronder prostaatkanker en maagkanker [11,12]. Verschillende studies hebben bevestigd dat IGFBP3 onderdrukt het invasieve karakter van endometriumkanker (EG) cellen [13], metastase in prostate kanker [14], en angiogenese in het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) [15]. Algemeen werd aangenomen dat de IGFBP3 bindende gebied van IGF-I kunnen blokkeren op de receptor IGF-IR, waardoor heffen het effect van IGF /IGF-IR as. Naast de afhankelijkheid van IGF /IGF-IR as bestaat er alternatieve IGF /IGF-IR onafhankelijke en nucleaire translocatie manieren [10]. Vele factoren zijn verduidelijkt de expressie van IGFBP3 reguleren, waaronder retinoïnezuur, tumornecrosefactor-α, trichostatine A, caudale Type homeobox 2 (CDX2) en de methyleringsstatus zichzelf [10,16]. Onze eerdere studies is gebleken dat IGFBP3 werd opgereguleerd in AGS en MKN28 overexpressie HoxD10 [4]. Gezien promotorregio van IGFBP3 heeft verscheidene potentiële bindingsplaatsen voor HoxD10, voorspeld door PROMO, een programma voor de voorspelling van transcriptiefactor bindingsplaatsen [17], HoxD10 kunnen direct samenspel met IGFBP3 in de regulatie van maagkanker cel invasie. Opheldering van dit netwerk zou meer inzicht verschaffen in de rol van IGFBP3 bij maagkanker.

In de onderhavige studie hebben we vastgesteld HoxD10 direct de promotergebieden van IGFBP3 kan binden mogelijk via de ttat element, waardoor transcriptie reguleert de expressie ervan in maagkanker. Bovendien wordt het expressieniveau van IGFBP3 vaak downregulated bij maagkanker weefsels en bestrijkt het totale overleving, wat suggereert dat IGFBP3 speelt een belangrijke rol bij maagkanker progressie. Functioneel IGFBP3 kan de migratie en invasie van maagkanker cellen onderdrukken, althans gedeeltelijk, door de regeling van deze invasieve factoren, waaronder metalloproteïnase-14 (MMP14) en urokinase-type plasminogeen activator (uPA).

materialen en methoden

Cell cultuur

Acht maagkanker cellijnen (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 en SGC7901) werden verkregen van Riken Gene Bank (Tsukuba, Japan) en American Type Culture Collection (Manassas, USA). Een niet-kwaadaardige maag cellijn (GES-1) werd verkregen van Beijing Institute for Cancer Research (Beijing, China). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Sijiqing, Huzhou, China), en geïncubeerd bij 5% CO _{2, 37 ° C en 95% vochtigheid.}

Constructie van IGFBP3 luciferase reporter plasmiden

Drie verschillende fragmenten in het promotorgebied van IGFBP3, waaronder -2.282-56 bp (2,3 kb, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 bindingsplaats I, HBSI) en -1727 ~ -943 bp (HBSII) werden geamplificeerd door PCR met genomisch DNA geëxtraheerd uit HEK-293T cellen wild als de matrijs. HBSI omvat HBS1 en 2, HBSII bevat van HBS3, 4 en 5, waarbij HBS1-5 worden voorspeld door PROMOTIE (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS primersequenties waren als volgt: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'en 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'en 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'en 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. De PCR fragmenten werden geligeerd in PGM-T vector (Tiangen, Beijing, China), gedigereerd met KpnI /BglII (Promega, Madison, USA) en vervolgens gesubkloneerd in de KpnI /BglII sites in de pGL3-basisvector (Promeg) genereren pGL3-basic-pIGFBP3 luciferase reporter plasmiden en de pGL3-promoter-vector (Promega) om pGL3-HBSI (II)-promotor luciferase reporter plasmiden. Alle constructen werden bevestigd door DNA-sequencing.

De bouw van luciferase reporter plasmiden HBSS

We gesynthetiseerde oligonucleotiden met voorspelde Hox bindingsplaatsen (HBSS) in de promotor regio van IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) en elk met één punt mutant website (A → C), oligonucleotiden werden als volgt:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'en 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

mutant HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'en 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'en 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

mutant HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'en 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'en 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

mutant HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'en 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

De dubbelstrengs HBSS werden gekoppeld en ingebracht in het stroomopwaartse deel van pGL3-promotor luciferase vector aan reporter plasmiden [18] te genereren. Alle constructen werden bevestigd door DNA-sequencing.

Mobiele transfectie

Gastric cacner cellen (BGC823 en SGC7901) werden getransfecteerd met pcDNA3.1-HoxD10 of pcDNA3.1 lege vector met behulp van Fugene HD (Promega) . Stabiele overexpressie HoxD10 cellijnen hierboven getransfecteerde cellen met 400 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Duitsland) werden geselecteerd voor een andere 14 dagen. Voor-siRNA gemedieerde gen knock-down, BGC823 en SGC7901 cellen werden met negatieve controle siRNA of-IGFBP3 gerichte siRNA (Qiagen, Hilden, Duitsland), HGC27 cellen werden met negatieve controle siRNA of-HoxD10 gerichte siRNA (Genepharma, Shanghai, China) RNAiMAX gebruik van Lipofectamine Reagent (Invitrogen).

luciferaseactiviteit assay

1,0 × 10 ^{5 BGC823 en SGC7901 cellen werden gezaaid in 24-well platen gedurende 24 uur, vervolgens getransfecteerd met lege vector 0.4μg pcDNA3.1 of pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (promotor) lege vector of pGL3-pIGFBP3 (HBS) -Basis (promotor) en 0.004μg pRL-TK vector (Promega) met verwijzing controle Renilla behulp Fugene HD [18]. Luciferase activiteit werd geanalyseerd door de dubbele-luciferase reporter testsysteem na 48 volgens de protocollen van de fabrikant (Promega).}

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP)

Bij stabiele overexpressie HoxD10 BGC823 en SGC7901 cellijnen het chromatine werd immunogeprecipiteerd met HoxD10 monoklonaal antilichaam (Rabbit, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) [19] of normaal konijn IgG (negatieve controle) volgens de Simple ChIP enzymatische chromatine IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Neergeslagen DNA's of 2% Input monsters met genomisch DNA van HEK-293T cellen wild geamplificeerd met Taq DNA polymerase (TaKaRa, Otsu, Japan) [20,21]. Vier primers omvat HBSS in de verschillende gebieden van IGFBP3 promotor werden als volgt ontworpen: A1 (-2251 ~ -2073 bp voor HBS1 en 2,), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'en 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 bp voor HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'en 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp voor HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'en 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp voor HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'en 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

Omgekeerde transcriptie-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met Trizol reagens (Cwbiotech, Beijing, China). Reverse transcriptie (RT) -PCR werd bepaald met M-MLV reverse transcriptase (TaKaRa) en Taq DNA Polymerase. De volgende primers werden gebruikt voor amplificatie:

GAPDH, 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'en 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'en 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'en 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'en 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'en 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'en 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'en 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

weefsel inhibitor van metalloproteïnase-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'en 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'en 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'en 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'en 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Western blotting

De totale eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van RIPA lysis buffer (Beyotime, Haimen, China). Triton X-100 lysis buffer werd toegepast om oplosbare E-cadherine en ß-catenine extract werd SDS lysis buffer gebruikt om onoplosbare E-cadherine /catenine complex ß [22] extraheren. Lysaten werden gescheiden op SDS-PAGE gel en overgebracht op PVDF-membranen (Millipore, Bedford, USA). De blots werden geprobed met HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-cadherine (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), ß-catenine ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) of GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) antilichamen. De blots werden gevisualiseerd met behulp van chemiluminescentie met een Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokyo, Japan). De relatieve dichtheden van eiwitten werden gekwantificeerd met Image J. software en genormaliseerd op GAPDH [20].

wondgenezing assay

BGC823 en SGC7901 cellen werden getransfecteerd met siRNA IGFBP3 of negatieve controle siRNA zes-well platen en gekrast met een p10 pipetpunt om een ​​gat te creëren. De putjes werden gespoeld met PBS om verplaatste cellen en vers medium (1% FBS voor BGC823 en serumvrij voor SGC7901) toegevoegd verwijderen. Drie gerandomiseerde beelden van de gekraste gebieden werden genomen (× 40 vergroting) over 0u, 12h en 24h [23].

Transwell migratie en invasie assays

Mobiele migratie en invasie werden beoordeeld door gemodificeerde Boyden transwell kamers (Corning Inc., Corning, USA), gecoat met (voor de invasie) of zonder (voor migratie) matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNA transfectie en uithongering cellen werden aan de bovenste kamer in kweekmedium dat 1% FBS (BGC823) of geen FBS (SGC7901), medium met 15% FBS werd toegevoegd aan de onderste kamer werden de cellen in de bovenste kamer voorzichtig verwijderd na incubatie 16 uur (voor de migratie) of 36h (voor de invasie). Gemigreerd cellen werden gekleurd met 0,5 ug /ml DAPI kleuroplossing (Roche, Penzberg, Duitsland). De cel aantallen werden willekeurig geteld in vijf velden (400 × vergroting) [24]. Binnengedrongen cellen werden met Cell Stain Solution (Millipore) en gefotografeerd (× 200). De kleurstof werd gewassen door extractie buffer en overgebracht naar een 96 putjes gedurende colorimetrie bij 560 nm in een microplaat reader (Thermo, Boston, USA) [25,26].

Patiënten en monsters

86 chirurgie patiënten van adenocarcinoom van de maag werden geïncludeerd van mei 2007 tot februari 2008, na de ondertekening van het informed consent. Deze studie werd goedgekeurd door Clinical Research Ethics Committee van Sir Run Run Shaw Ziekenhuis van Zhejiang University. Matched tumorweefsels en aangrenzende tumorvrij weefsels werden verkregen. klinisch-pathologische gegevens van patiënten met inbegrip van geslacht, leeftijd, TNM stadia en pathologische kwaliteiten werden opgehaald uit medische dossiers. Follow-up werd uitgevoerd bij een 1-jaar interval na de operatie, een medische voorgeschiedenis werd opgenomen als de patiënt voor volgend bezoek kwam. De follow-up cutoff keer was augustus 2012, en de mediane follow-up tijd was 35 maanden (range, 1-63 maand).

Tissue microarray en immunohistochemische kleuring

Cores het meten van 1,5 mm in de grootste afmeting werden geponst uit niet-necrotische gebieden van elkaar afgestemd tumor weefsel en de aangrenzende tumorvrij weefsels. Weefsel microarray dia's met daarin 4 pm dik microarray secties werden geconstrueerd met behulp van standaard technieken (in samenwerking met Shanghai superchip Company, Ltd., Shanghai, China). Glaasjes werden geïncubeerd met IGFBP3 antilichaam (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) gedurende de nacht bij 4 ° C en vervolgens geïncubeerd met het Envision-plus detectiesysteem (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Kopenhagen, Denemarken). De coupes werden ontwikkeld in 3,3'-diaminobenzidine oplossing onder microscopische observatie en tegengekleurd met hematoxyline [27]. Weefsels van gevorderde borstkanker werden gekleurd als de positieve controle [28]. Het percentage positieve cellen in elk monster werd gekwantificeerd onder microscoop en geclassificeerd in vier groepen. 0: 0-5% positieve cellen; 1: 6% tot 50% positieve cellen; 2: 51% tot 75% positieve cellen en 3: 76-100% positieve cellen. De intensiteit van kleuring IGFBP3 werd als volgt beoordeeld: 0 = geen kleuring; zwakke kleuring = 1; gematigde kleuring = 2; dichte kleuring = 3. De score van de intensiteit plus het aandeel van de positieve kleuring werd gedefinieerd als IGFBP3 vlekken score. Een score van 0-3 werd beschouwd als lage expressie en 4-9 zo hoog expressie.

Statistische analyse

De differentiële expressie van IGFBP3 tussen tumorweefsel en niet-tumorweefsel werd bepaald door Mann-Whitney U test. Chi-kwadraat test werd gebruikt om de relatie tussen clinicopathologische kenmerken en IGFBP3 kleuring scores analyseren. De kans op overleving werd berekend met de Kaplan-Meier-methode en het verschil tussen de curven werd geëvalueerd met de Log-rank test. Een cutoff van p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant te zijn

Resultaten

HoxD10 upregulates de expressie van IGFBP3

Genome-wide analyse bleek dat meerdere genen, waaronder IGFBP3 werden geregeld. door HoxD10 bij maagkanker cellen in onze vorige studie (4). Om te bepalen of HoxD10 transcriptioneel kan reguleren van de expressie van IGFBP3 bij maagkanker cellen, zagen we de expressie van IGFBP3 na stabiel introduceren HoxD10 gen in BGC823 en SGC7901 cellen of transient neerhalen van HoxD10 in HGC27 cellen. RT-PCR en Western blotting resultaten vertoonden consequent dat de expressie van IGFBP3 was significant opgereguleerd in HoxD10 overexpressie cellen (Figuur 1A en 1B), en neerwaarts gereguleerd na silencing van HoxD10 in HGC27 cellen (figuur 1C en 1D).

Een 2,3 kb sequentie (-2.282-56 bp) en het stroomopwaartse gebied van IGFBP3 werd gekloneerd in pGL3-basic vector en gebruikt om luciferaseactiviteit evalueren dual-luciferase reporter assays. De resultaten toonden aan dat de IGFBP3 promotor activiteit in BGC823 en SGC7901 cellen respectievelijk werd versterkt met 4,2 en 3,8 plooien na co-getransfecteerd met pcDNA3.1-HoxD10 ten opzichte van pcDNA3.1 vector transfectanten (p < 0,01, figuur 1E). Tezamen bieden deze gegevens suggereerde dat HoxD10 transcriptioneel kon upregulate de expressie van IGFBP3 bij maagkanker cellen.

Identificatie van nieuwe regelgeving regio's in de IGFBP3 promotor verantwoordelijk voor HoxD10

We naast analyseerden de potentiële HoxD10 bindingsplaatsen in de IGFBP3 promoter. Het 2,3 kb stroomopwaartse sequentie van IGFBP3 gen werd ingevoerd in PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), een programma voor het voorspellen van transcriptiefactor bindingsplaatsen in een enkele reeks of een groep van verwante sequenties (17 ), en 5 potentiële HoxD10 bindingsplaatsen (HBS1 ~ 5) werden voorspeld (Tabel S1). Zoals getoond in Figuur 2A, werden deze vijf HBSS gelokaliseerd op -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) en -953 ~ -944bp (HBS5) respectievelijk. In stabiele overexpressie HoxD10 BGC823 en SGC7901 cellen, bindend regio's op IGFBP3 promotor werden onderzocht door ChIP assays. We identificeerden de chromatine neergeslagen door HoxD10 antilichaam werd geamplificeerd met A2, A3 en A4 primers die HBS3, HBS4 en HBS5 respectievelijk omvatten, terwijl er geen amplificatie waargenomen met A1 primers omvat HBS1 en 2 (figuur 2B).

Om verder te krijgen in de regulerende segmenten IGFBP3 promoter door HoxD10 We gekloneerd 2 verschillende DNA-fragmenten die omvatten HBSI (HBS1 en 2) en HBSII (HBS3, 4 en 5), respectievelijk in SV40 promotor luciferase verslaggevers. Resultaten toonden aan dat gecotransfecteerd met HoxD10, HBSII verhoogde SV40 promoteractiviteit door 4,0-voudig in vergelijking met de lege vector transfectanten in BGC823 cellen (P < 0,01, figuur 3A). Daarentegen HBSI vertoonde geen significant effect op de SV40 promoteractiviteit (figuur 3A). Vergelijkbare resultaten werden geopenbaard in een andere onafhankelijke SGC7901 cellen, de SV40 promoter activiteit veranderingen waren 3,3 en 0,9 maal door HBSII en HBSI, respectievelijk (figuur S1A in S1 File).

HBS3, 4 en 5 gedeelde gemeenschappelijke bindend element "ttat", terwijl HBS1 of HBS2 hebben geen van deze elementen. We hypothese dat HoxD10 direct bindt aan de promotor van IGFBP3 op sites "ttat". Om dit te bevestigen, we gesynthetiseerd 10bp oligonucleotiden die de sequenties van HBS3, HBS4 en HBS5 respectievelijk bevatten. Zoals getoond in figuur 3B, zijn de SV40 promoter activiteiten versterkt door 1,8, 2,0, respectievelijk 2,7 plooien wanneer gecotransfecteerd met plasmide HoxD10 BGC823 cellen terwijl puntmutanten van HBS3, HBS4 en HBS5 geen significante veranderingen. We gereproduceerd soortgelijke resultaten in SGC7901 cellen (Figuur S1B in File S1).

Gezamenlijk bovenstaande resultaten geven aan dat IGFBP3 een direct doelwit van HoxD10 bij maagkanker cellen. We identificeerden drie functionele bindingen plaatsen tussen -1727 ~ -943bp in de upstream van IGFBP3 gen dat verantwoordelijk is voor de HoxD10. HoxD10 kon direct binden de promotor van IGFBP3 potentieel door middel van Hox bindend element "ttat".

IGFBP3 wordt neerwaarts gereguleerd bij maagkanker en gerelateerd aan de patiënt prognose

Om het expressiepatroon van IGFBP3 bij maagkanker bepalen, 86-paar chirurgische specimens van menselijke maagkanker en overeenkomstig aangrenzende goedaardige maag weefsels werden onderzocht. De intensiteit van IGFBP3 kleuring werd gescoord als 0 (negatief), 1 (zwak), 2 (matig) of 3 (zwaar), zoals bepaald door twee onafhankelijke pathologen (Figuur S2 S1 File). De resultaten toonden dat het expressieniveau van IGFBP3 in tumorweefsels was significant lager dan die in aangrenzende tumorvrij weefsels (p < 0,001, figuur 4A en 4B). Voorts werd IGFBP3 expressie geëvalueerd met betrekking tot de klinische en pathologische kenmerken van de patiënten. IGFBP3 expressie was significant lager in maagtumor met lymfeknoop metastase (p = 0,045). Daarnaast werd IGFBP3 hoge expressie in klein formaat tumoren (T1 + T2, 8/12) vaker waargenomen ten opzichte van die in grote bedrijven (T3 + T4, 36/74), maar zonder significant verschil (p = 0,062) . Er was ook geen significante correlatie tussen de expressie van IGFBP3 en clinicopathologische kenmerken zoals geslacht, leeftijd en pathologische graad (tabel 1).
IGFBP3 immunokleuring intensiteit
Klinische classificatie
Totaal aantal
Low (nummer)
High (aantal)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Gender, leeftijd en klinisch-pathologische kenmerken en immunohistochemie resultaten van maagtumor weefselmonsters.
CSV Download CSV

We hebben de correlatie tussen de expressie van IGFBP3 en de algehele overleving van maagkanker verder geanalyseerd patiënten. Hogere expressie van IGFBP3 werd geassocieerd met een langere overleving tijd in de 5 jaar follow-up (p = 0,011, Kaplan-Meier survival Log-rank test) (Figuur 4C).

Knockdown van IGFBP3 gen bevordert maagkanker cel migratie en invasie

Om de functionele rol van IGFBP3 bij maagkanker te evalueren, onderzochten we de cel migratie en invasie na knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 werd selectief knockdowned door RNA interferentie in BGC823 en SGC7901 cellen (figuur 5A en 5B), die een relatief hoog niveau van endogene IGFBP3 in een panel van gastrische cellijnen (Figuur S3 S1 File) had. De resultaten toonden aan dat silencing expressie van IGFBP3 aanzienlijk verbeterd celmigratie zowel transwell migratie assays (Figuur 5C en 5D) en krastest (figuur S4 S1 File), vergeleken met die van de negatieve controle siRNA. Bovendien knockdowning IGFBP3 vertoonden een significant hogere activiteit van cellulaire invasie in de transwell assays (figuur 5E en 5F).

IGFBP3 moduleert de uitingen van MMP14, uPA en uPAR

Om te achterhalen van de mogelijke mechanismen van hoe IGFBP3 regelen de invasieve karakter van maagkanker cellen, onderzochten we de mRNA niveaus van MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA en uPAR receptor, die allemaal invasie factoren, vooral bij maagkanker. Na tijdelijk met IGFBP3 siRNA gedurende 72 uur in BGC823 en SGC7901 cellen, het mRNA expressieniveaus van MMP14, uPA en uPAR toegenomen, terwijl er geen significante verandering van MMP2, MMP7, MMP9 of TIMP1 /TIMP2 waargenomen (figuur 6A). E-cadherine, ß-catenine en E-cadherine /ß-catenine complex werden geëxtraheerd met behulp van verschillende lysaten, hun niveau had geen zinvolle verandering na het zwijgen op te leggen IGFBP3 in BGC823 cellen (Figuur S5 in S1 File). Deze resultaten gaven aan dat IGFBP3 remt de invasie van cellen door maagkanker, althans gedeeltelijk, het moduleren van de uitingen van MMP14, uPA en uPAR (figuur 6B).

Discussie

Hox superfamilie zijn groep belangrijke transcriptiefactoren die de proliferatie en differentiatie van cellen embronic [29,30] kan regelen. Bovendien, de afwijkende expressie van Hox speelt cruciale rol in de progressie van verschillende soorten kanker [31]. Hox eiwitten hebben een grote downstream regulerende netwerk en hun functies uit te oefenen voornamelijk door middel van deze doelwitgenen [5]. Genoom-brede analyse is uitgevoerd om de downstream genen van HoxD10 scherm tijdens spinal cord ontwikkeling en bij maagkanker cellen [4,32]. Wij en anderen hebben een gemeenschappelijke doelgen IGFBP3, dat is gemeld om te dienen als een tumorsuppressor [10] geopenbaard.

Onze studies verstrekt eerste bewijs om aan te tonen dat de HoxD10 direct bindt de IGFBP3 promotor om de expressie van IGFBP3 bij maagkanker cellen te activeren. HoxD10 eiwit kan worden aangeworven om de specifieke promoter regio IGFBP3 gen, wat aangeeft dat HoxD10 direct kunnen binden aan IGFBP3 gen. De luciferaseactiviteit met wilde, maar niet mutant, werd HBS3, HBS4 of HBS5 significant verhoogd door overexpressie van HoxD10 suggereert dat HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) en HBS5 (CTTTATTATT) waren drie functionele HoxD10 bindingsplaatsen in de promotor regio IGFBP3. Zoals verwacht, werden het expressieniveau van mRNA en eiwit IGFBP3 opgereguleerd door geforceerde expressie van HoxD10 in verschillende maagkanker cellijnen [4]. Studies hebben aangetoond dat Hox eiwitten hebben een aantal kern consensus bindende elementen, waaronder ttat, TAAT en TTAC [7]. Puntmutatie met "ttat" tot "TTCT" of "TCTT" naar "TATT" in de promotorregio van IGFBP3 in de huidige studie geven aan dat "ttat" of "TATT" zijn belangrijke bindende sites voor HoxD10. Hox eiwitten kunnen rechtstreeks regelen de transcriptie proces van downstream doelwit genen als monomeren of homodimeren [33]. Sinds DNA-bindende bevoegdheid van Hox eiwitten zelf is relatief laag [34], de interactie met co-factoren zoals extradenticle (Exd) /Pbx en Homothorax (Hth) /Meis eiwitten als heterodimeren of heterotrimeren zijn van cruciaal belang om het doel selectiviteit van Hox eiwitten [33, 35]. Andere transcriptiefactoren zoals PTEN en p53 kon de expressie van IGFBP3 regelen op het transcriptionele niveau maag en colon carcinoomcellen [36,37]. De exacte HoxD10 regulerende mechanismen en de co-factoren die betrokken zijn bij de regulatie van IGFBP3 moeten worden verduidelijkt in de toekomst.

De expressie van IGFBP3 werd neerwaarts gereguleerd in 86 maag adenocarcinomen weefsels in verhouding tot hun aangrenzende normale weefsels, en de lage expressie van IGFBP3 werd ook gecorreleerd met geavanceerde lymfeklier metastase, metastasen op afstand en een slechte algehele overleving. Onze bevindingen waren consistent met vorige verslag, dat goed of matig gedifferentieerde maag adenocarcinoom had aanzienlijk hoger percentage van IGFBP3 kleuring in tumorweefsels dan mensen met een zwakke gedifferentieerde degenen [38]. Bovendien werd hypermethylatie in de promotor van IGFBP3 vaak aangetroffen in gastrische tumorweefsels [16,39,40]. Functionele IGFBP3 SNPs (rs2854744 en rs2960436) het bepalen van hoge IGFBP3 circulerende niveaus werden geassocieerd met een gunstige prognose van patiënten met gevorderde maagkanker die palliatieve chemotherapie [41]. Echter, een andere studie toonde de vrij tegengestelde resultaten suggereren dat de expressie van IGFBP3 was hoger in tumormonsters dan bij normale mucosa (54 tumormonsters en 20 aangrenzend normaal monsters niet gematched) en positieve uitdrukking van IGFBP3 geassocieerd met gevorderde histologische rang, lymfeklier metastase en verre metastase zonder significant verschil [42]. De mogelijkheid intratumorale heterogeniteit en ingeschreven criteria kunnen verschillende resultaten in verschillende klinische studies induceren. Grote populaties en prospectieve studies mochten de potentiële bruikbaarheid van IGFBP3 evalueren als biomarker van de progressie van maagkanker.

De rol van IGFBP3 nadere specificatie in metastase van maagkanker, evalueerden we de rol bij het moduleren de migratie en invasie van maagkanker cellen. Het bleek dat silencing expressie van IGFBP3 resulteerde in een snelle genezing van de wond en scratch toegenomen aantal cellen migreren via transwell membraan of bekleed met of zonder Matrigel. Eerdere studies vooral gericht op de functie van IGFBP3 proliferatie en apoptose. Slechts enkele studies werd in verband met uitzaaiingen in de EG, prostaatkanker en HNSCC [13-15]. Silencing expressie van IGFBP3 kon celmigratie, invasie en metastase in EG [13] te induceren. IGFBP3 knockout mannelijke muizen vertoonden een hogere incidentie van longmetastasen en de invasiviteit van primaire prostaat tumorcellen toegenomen 3-voudig in vergelijking met die van wilde dieren [14]. Adenovirale en recombinant IGFBP3 geremd vascularisatie en angiogenese-stimulerende activiteiten van HNSCC door het onderdrukken van de productie van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) [15]. Migratie en invasie worden vergemakkelijkt door een aantal factoren kan induceren epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), zoals E-cadherine, ß-catenine en factoren verslechtering van de extracellulaire matrix, zoals MMPs, uPA etc. [43]. In EC cellen, siRNA gericht IGFBP3 verhoogt de expressie van MMP2 [13].

• PLoS ONE: cisplatine of niet in gevorderde maagkanker: een systematische review en meta-analyse
• PLoS ONE: optimale duur van fluorouracil-gebaseerde adjuvante chemotherapie voor patiënten met resectable Gastric Cancer