Ploche ONE: IGFBP3, transkripčný Cieľ homeoboxových D10, koreluje s prognóze žalúdočnej Cancer

abstraktné

homeoboxových D10 (HoxD10) hrá dôležitú úlohu v diferenciácii embryonálnych buniek a progresie karcinómu prsníka. Naše predchádzajúce správa ukázala, že inzulínu podobný rastový viažuci proteín-3 (IGFBP3) bol upravený v HoxD10 buniek karcinómu žalúdka faktor; Avšak, funkčné role a príslušné mechanizmy IGFBP3 rakoviny žalúdka zostávajú nejasné. Tu sme zistili, že expresia bola up-regulovaná IGFBP3 po ektopickej expresie HoxD10 do buniek karcinómu žalúdka. Chromatínu immunoprecipitation test ukázal, že HoxD10 viazaný k trom možným oblastí IGFBP3 promótor. Exogénne HoxD10 výrazne zvýšenú aktivitu Luciferase reportéra, ktorý obsahuje tieto záväzné regióny v rakovinových bunkách žalúdka. Ďalšie údaje ukazujú, že všetky z týchto väzobných miest mal HOx viazacie prvok "Ttáto". Imunohistochemické farbenie výsledky odhalili, že IGFBP3 expresia bola významne downregulated v 86 žalúdočných adenokarcinómy tkanivách v porovnaní s ich susednými non-rakovinové tkanivá (p 0,001). Okrem toho, IGFBP3 expresie bola v žalúdku nádoru lymfatických uzlín významne nižšie v porovnaní s tým, bez toho aby lymfatických uzlín (p = 0,045). Pacienti s vysokým úrovne expresie IGFBP3 ukázali priaznivý 5 ročné celkové prežívanie (p = 0,011). Vyradenie IGFBP3 zrýchlil žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek a indukuje expresiu invazívnych faktorov, vrátane MMP14, urokináza a upÃr. Tak, naše dáta ukazujú, že HoxD10 cielené gén IGFBP3 môže potlačiť žalúdočné rakovina invázie buniek a podporuje prežitie pacientov s karcinómom žalúdka

Citácia :. Xue M, Y Fang, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, transkripčný Cieľ homeoboxový D10, koreluje s prognóze rakoviny žalúdka. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Spojené štáty |

prijatá: 21. júna 2013; Prijaté: 13. októbra 2013; Uverejnené: 27 decembra 2013

Copyright: © 2013 Xue et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), národné Základný výskumný program Číny (973 program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) a Výskumný fond doktorandské štúdium vysokého školstva Číny (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj~~HEAD=pobj). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou rakovinou, a v súčasnosti je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na celom svete súvisiace s rakovinou [1]. Takmer polovica pacientov žalúdočných Caner už postúpili do neskorej fáze lymfatických žliaz alebo vzdialené metastázy v čase stanovenia diagnózy a strácajú príležitosť na operáciu [2]. Títo pacienti majú zlý výsledok a miera prežitia päť rokov pre tých, ktorí so vzdialenými metastázami, je menšia ako 5% [3]. Progresie karcinómu žalúdka je považovaný viacstupňový proces, ktorý zahŕňa aktiváciu onkogénov a inaktivácia tumor supresorových génov. Už skôr sme prezentované že homeobox D10 (HoxD10) slúžila ako nádorový supresor potlačením rastu nádoru a invazívnosť, ktorý bol epigenetické tlmičom v karcinómu žalúdka [4].

HoxD10 gén patrí do superrodiny homeoboxových, ktoré kódujú transkripčné faktory a vykonávať funkcie, najmä prostredníctvom aktivácie alebo represie po smere cieľových génov [5]. Amino-koncové rameno HOx homeodomény má niekoľko základných konvenčné väzby prvky, vrátane Ttáto, TAAT a TTAC [6,7]. Napríklad, HoxC8 sa viaže na tieto prvky v promotorové oblasti a moduluje transkripčný aktivity PedF, NCAM, Zac1, OPN a Cdh11, ako bolo stanovené vysoko celom chromatín imunoprecipitační testy a globálne HoxC8 DNA-väzbovú analýzu miesta [7]. Štúdie preukázali, že HoxD10 inhibuje angiogenézu a pohyblivosť buniek karcinómu endometria (ES) [8] a narúša bunkovú invazivitu žalúdka a prsníka [4,9]. Avšak, len málo je známe o mechanizmoch, ako HoxD10 vykonáva svoje funkcie v karcinogenézy aj na progresiu nádorov. Systematicky sme screening potenciálnych cieľov HoxD10 cDNA mikročipu a identifikovať niekoľko génov, vrátane viazania inzulínu podobný rastový faktor, proteín-3 (IGFBP3), ktoré by mohli byť zodpovedné za vznik nádorov potlačovanie HoxD10 v karcinómu žalúdka [4].

IGFBP3 je hlavný druh IGFBP v obehu, viazaní viac ako 75% cirkulujúceho rastového inzulín faktor-I (IGF-I) [10]. To môže inhibovať bunkovú proliferáciu a indukovať apoptózu buniek niekoľkých typov rakoviny, vrátane rakoviny prostaty a rakoviny žalúdka [11,12]. Niekoľko štúdií potvrdilo, že IGFBP3 potláča invasiveness rakoviny endometria (ES) buniek [13], metastázy karcinómu prostaty [14], a angiogenézy v oblasti hlavy a krku z dlaždicových buniek karcinómu (HNSCC) [15]. Sa došlo k záveru, že by mohli blokovať IGFBP3 väzbovú oblasť IGF-I na jeho receptor IGF-IR, a tak zrušila účinky IGF /IGF-IR osi. Okrem závislosti IGF /osi IGF-IR, existuje alternatívna IGF /IGF-IR nezávislé a nukleárnej translokáciu spôsoby [10]. Mnoho faktorov boli objasnené regulovať expresiu IGFBP3, vrátane kyseliny retinovej, TNF-a, trichostatin A, chvostové typu homeoboxových 2 (CDX2) a metylačného statusu seba [10,16]. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že IGFBP3 bola up-regulovaná v AGS a MKN28 buniek s nadmernou expresiou HoxD10 [4]. S ohľadom na oblasť promotora z IGFBP3 má niekoľko potenciálnych väzbové miesta pre HoxD10, predikované PROMO, program pre predikciu väzobných miest transkripčného faktoru [17], HoxD10 môže priamo pôsobenie s IGFBP3 v regulácii žalúdočné rakovina invázie buniek. Objasnenie tejto siete by poskytnúť ďalší pohľad na rolu IGFBP3 v karcinómu žalúdka.

V tejto štúdii sme zistili, že HoxD10 by sa priamo viazať na promotorové oblasti z IGFBP3 potenciálne prostredníctvom Ttáto prvku, čím transkripčný reguluje jeho expresiu v karcinómu žalúdka. Okrem toho, úroveň expresie IGFBP3 je často downregulated v žalúdočnej rakovinové tkanive a v pomere k celkovému prežitiu, čo naznačuje, že IGFBP3 hrá dôležitú úlohu v progresii rakoviny žalúdka. Funkčne, IGFBP3 mohol potlačiť migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, aspoň z časti, a to prostredníctvom regulácie týchto invazívnych faktorov, vrátane metaloproteinázy-14 (MMP14), a urokináza typu aktivátora plazminogénu (UPA).

materiály a metódy

bunkovej kultúre

Osem žalúdočné rakovina bunkové línie (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 a SGC7901) boli získané od Riken génovej banky (Tsukuba, Japan) a American Type Culture Collection (Manassas, USA). Jeden non-malígne žalúdočné bunkové línie (GES-1) bol získaný od pekinského inštitútu pre výskum rakoviny (Peking, Čína). Bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, USA), doplnenom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka (FBS, Sijiqing, Huzhou, Čína), a inkubuje sa v 5% CO _{2, 37 ° C a 95% vlhkosti.}

Výstavba IGFBP3 luciferázové reportéri plazmidy

Tri rôzne fragmenty promotorové oblasti IGFBP3 vrátane -2282 až +56 bp (2,3 KB, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 väzobné miesto i, HBSI) a -1727 ~ -943 bp (HBSII), boli amplifikovanej pomocou PCR za použitia genómovej DNA extrahovanej z HEK-293T voľne žijúcich buniek ako templátu. HBSI zahŕňa HBS1 a 2, HBSII obsahuje z HBS3, 4 a 5, v ktorom HBS1-5 sa predpovedalo PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS sekvencie primérov boli nasledovné: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'a 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'a 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'a 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. PCR fragmenty boli ligovány do PGM-T vektora (Tiangen, Beijing, Čína), štiepený KpnI /BglII (Promega, Madison, USA) a potom subklonován do miest KpnI /BglII v pGL3-basic Vector (Promeg) pre generovanie pGL3-pIGFBP3-základné luciferázy reportéri plazmidy, a pGL3-promótor vektor (Promega) pre generovanie pGL3-HBSI (II) -promoter luciferázové reportéri plazmidy. Všetky konštrukty boli potvrdené DNA sekvenovaním.

Konštrukcia luciferázové reportéri plazmidy HBSS

syntetizované oligonukleotidy sme s predpokladanými väzobných miest HOx (HBSS) v promotorových regiónoch IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) a každý jednobodového zmutovaného mieste (A → C), oligonukleotidy boli nasledujúce:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'a 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

mutant HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'a 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'a 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3';

mutant HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'a 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'a 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3';

mutant HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'a 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'.

Dvojvláknová HBSS boli žíhané a vložený do proti smeru pohybu pGL3 sprostredkovateľský vektora generovať luciferázové reportéri plazmidy [18]. Všetky konštrukty boli potvrdené DNA sekvenovaním.

transfekciu buniek

žalúdočné cacner bunky (BGC823 a SGC7901) boli transfekovány s pcDNA3.1-HoxD10 alebo pcDNA3.1 prázdnym vektorom s použitím Fügen HD (Promega) , K vytvoreniu stabilných HoxD10 nadmerná expresia bunkové línie, vyššie Transfekované bunky boli vybrané 400 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Nemecko) po dobu ďalších 14 dní. Pre siRNA sprostredkované génové Knockdown, BGC823 a SGC7901 bunky boli transfekovány negatívna kontrola siRNA alebo IGFBP3 cielené siRNA (Qiagen, Hilden, Nemecko), HGC27 bunky boli transfekovány negatívna kontrola siRNA alebo HoxD10 cielené siRNA (Genepharma, Shanghai, Čína) za použitia Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen).

Aktivita luciferázy test

1,0 x 10 ^{5 BGC823 a SGC7901 bunky boli schovať na 24-jamkových doštičkách po dobu 24 hodín, potom transfekciou prázdnym vektorom 0.4μg pcDNA3.1 a pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-basic (promotér) prázdnym vektorom alebo pGL3-pIGFBP3 (HBS) -základné (promotér), a 0.004μg PRL-TK Vector (Promega), ktorý obsahuje odkaz riadiacu Renilla pomocou Fügen HD [18]. Aktivita luciferázy bola analyzovaná pomocou duálneho luciferázového reporterového-testovacieho systému počas 48 hodín podľa protokolov výrobcu (Promega).}

chromatín Imunoprecipitácia (Chip)

V stabilný HoxD10 nadmerne exprimovaný bunkové línie BGC823 a SGC7901, chromatín bola imunoprecipitována s HoxD10 monoklonálnou protilátkou (králik, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) [19] alebo normálne králičie IgG (negatívna kontrola) podľa Simple chip Enzymatická chromatínu IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , USA). Vylúčené DNA alebo 2% vzoriek vstup s genomickej DNA z HEK-293T voľne žijúcich buniek boli zosilnené s Taq DNA polymerázy (Takara, Otsu, Japonsko) [20,21]. Štyri priméry zahŕňajúce HBSS v rôznych miestach IGFBP3 promótorom boli navrhnuté nasledujúce: A1 (-2251 ~ -2073 bp, pre HBS1 a 2,), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'a 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 bp, pre HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'a 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp, pre HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'a 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp, pre HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'a 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

Reverzný transkripcie-PCR

Celková RNA bola izolovaná s TRIzolu činidlo (Cwbiotech, Peking, Čína). Reverzný transkripcie (RT) -PCR boli stanovené s M-MLV reverznej transkriptázy (Takara) a Taq DNA polymerázy. Tieto priméry boli použité pre amplifikáciu:

GAPDH, 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'a 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'a 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'a 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'a 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'a 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'a 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'a 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';

tkanivový inhibítor metaloproteinázy-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'a 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'a 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';

UPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'a 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; upÃr, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'a 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

westernovým prenosom

Celkový počet proteíny boli získané pomocou RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Haimen, Čína). Triton X-100 lyzačný pufor bol použitý na extrakciu rozpustného E-cadherin a SS-katenin, SDS lyzačný pufor bol použitý na extrakciu nerozpustný E-cadherin /SS-katenin komplex [22]. Lyzáty boli rozdelené na SDS-PAGE gélu a prenesené na PVDF membrány (Millipore, Bedford, USA). Bloty boli testované s HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-cadherin (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), p-katenin ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), alebo GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) protilátky. Membrány boli vizualizované pomocou chemiluminiscencie s Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokyo, Japonsko). Relatívna hustota proteíny boli kvantifikované pomocou obrazu J. softvérom a normalizované k GAPDH [20].

hojenie rán testu

BGC823 a SGC7901 bunky boli transfekovány IGFBP3 siRNA alebo siRNA v konaní negatívne šiestich jamkách a potom poškriabaný s p10 pipety, aby sa vytvorila medzera. Jamky sa promyly PBS na odstránenie presídlené bunky a čerstvého média (1% FBS za BGC823 a bez séra pre SGC7901) bol pridaný. Tri randomizovanej predstavy o poškriabaných miestach boli nasnímané (× 40 zväčšenie) cez 0h, 12h a 24h [23].

testy migrácie a invázie transjamkových

migráciu a inváziu buniek boli hodnotené pomocou upraveného Boyden Transwellovy komory (Corning Inc., Corning, USA), potiahnuté (invázia) alebo bez neho (o migrácii) matrigelu (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). siRNA transfekcia a hladovania boli bunky umiestnené do hornej komory v médiu obsahujúcom 1% FBS (BGC823) alebo bez FBS (SGC7901), FBS bol pridaný do dolnej komory médiu obsahujúcom 15%, bunky v hornej komore boli opatrne odstránené po kultivácii po dobu 16 hodín (pre migráciu) alebo 36h (pre inváziu). Migrované bunky boli zafarbené s 0,5 ug /ml DAPI Farbiace roztok (Roche, Penzberg, Nemecko). Počty buniek boli náhodne počítajú v piatich oblastiach (400 × zväčšenie) [24]. Napadli bunky boli inkubované s Cell Stain Solution (Millipore) a vyfotografoval (x 200). Zmes farbív sa premyje extrakčného pufra a prenesené na 96-jamkové pre kolorimetrické meranie pri 560 Nm v čítačke mikrotitračných doštičiek (Thermo, Boston, USA) [25,26].

Pacienti a vzorky

86 chirurgii pacientov adenokarcinómom žalúdka boli zaradené od mája 2007 do februára 2008 po podpísaní informovaného súhlasu. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou Clinical Research sira Run Run Shaw nemocnice Zhejiang University. Boli získané uzavreté nádorového tkaniva a priľahlé nádorové bez tkaniva. Pacientov klinicko-patologické údaje, vrátane pohlavia, veku, fázach TNM a patologické známky boli vyvolané z lekárskych záznamov. Follow-up bol vykonaný v intervale 1 roka po operácii, lekárska história bola zaznamenaná, keď pacient prišiel pre následné návštevy. Následná čas cutoff bolo augusta 2012, a priemerné sledovanie v 35 mesiacov (rozmedzie 1-63 mesiacov).

mikroskopické sústavy tkanív a imunohistochemické farbenie

Jadrá meracie 1,5 mm v najväčšom rozmere boli razené od non-odumretých oblastiach uzavreté nádorového tkaniva a priľahlých bez tumoru tkanív. Tissue microarray sklíčka, ktoré obsahujú 4um silné microarray úseky boli postavené za použitia štandardných techník (v spolupráci s Shanghai Superchip Company, Ltd., Shanghai, Čína). Sklíčka bola inkubovaná s IGFBP3 protilátkou (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) cez noc pri 4 ° C, a potom inkubované s Envision-a detekčný systém (Envision ™ + /HRP /Rb, Dako, Kodaň, Dánsko). Rezy boli vyvinuté v roztoku 3,3'-Diaminobenzidine pod mikroskopickým pozorovaním a kontrastne hematoxylínom [27]. Tkanivá pokročilým karcinómom prsníka, boli zafarbené ako pozitívna kontrola [28]. Podiel pozitívnych buniek v každej vzorke bola kvantifikovaná pod mikroskopom a rozdelené do štyroch skupín. 0: 0 - 5% pozitívnych buniek; 1: 6% až 50% pozitívnych buniek; 2: 51% až 75% pozitívnych buniek a 3: 76 až 100% pozitívnych buniek. Intenzita farbenia IGFBP3 sa triedia nasledovne: Žiadne farbenie = 0; slabé farbenie = 1; mierne farbenie = 2; hustá farbenie = 3. skóre intenzity plus podielu pozitívneho farbenia bolo definované ako IGFBP3 farbenie skóre. Skóre 0-3 bola považovaná za nízku expresiou a 4-9 za vysokú expresiu.

Štatistická analýza

Diferenciálna expresia IGFBP3 medzi nádorového tkaniva a non-nádorovom tkanive bola stanovená Mann-Whitney U-testu. Chi-kvadrát test bol použitý na analýzu vzťahu medzi klinicko-funkcií a IGFBP3 farbenie skóre. Pravdepodobnosť celkového prežitia bola vypočítaná metódou Kaplan-Meier a rozdiel medzi krivkami bola hodnotená pomocou log-rank testu. Hraničným p menšie ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú

Výsledky

HoxD10 zvyšuje reguláciu expresie IGFBP3

Genome rozsiahla analýza odhalila, že niekoľko génov vrátane IGFBP3 boli regulované. podľa HoxD10 vo buniek karcinómu žalúdka v našej predchádzajúcej štúdii (4). Pre stanovenie, či by mohla HoxD10 transkripčný regulujú expresiu IGFBP3 vo buniek karcinómu žalúdka, sme pozorovali hladinu expresie IGFBP3 po stabilne zavedenie génu do HoxD10 BGC823 a SGC7901 buniek, alebo prechodne zrážanie z HoxD10 v HGC27 bunkách. RT-PCR a westernovým prenosom výsledky súhlasne ukázali, že expresia IGFBP3 významne up-regulovaná v HoxD10 nadmerne exprimovaný bunkami (obrázok 1A a 1B), zatiaľ čo downregulated po umlčanie HoxD10 v HGC27 bunkách (Obrázok 1C a 1D).

sekvencie 2,3kilobajt (-2282 až 56 bp) v oblasti proti smeru IGFBP3 bol klonovaný do pGL3-basic vektora a použitý pre vyhodnotenie aktivity luciferázy dual-Luciferase reportérových testoch. Výsledky ukázali, že aktivita promotora IGFBP3 vo BGC823 a SGC7901 buniek bola zvýšená o 4,2 a 3,8 záhyby, respektíve po ko-transfekovány s pcDNA3.1-HoxD10 vzhľadom k vektora pcDNA3.1 transfektanty (p < 0,01, obrázok 1E). Vzaté dohromady, tieto údaje naznačujú, že by mohli HoxD10 transkripčný upregulate expresiu IGFBP3 do buniek karcinómu žalúdka.

Identifikácia nových regulačných oblastí v promótorom IGFBP3 zodpovedných za HoxD10

Ďalej sme analyzovali potenciálny HoxD10 väzbové miesta v promótorom IGFBP3. 2,3kilobajt upstream sekvencia génu IGFBP3 bola vložené do PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), program pre predikciu transkripčný faktor väzobných miest v jednom slede alebo v skupine príbuzných sekvencií (17 ), a 5 potenciálny väzby HoxD10 miesta (HBS1 ~ 5) sa predpokladá, (tabuľka S1). Ako je ukázané na obrázku 2A, týchto päť HBSS boli lokalizované na -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) a -953 ~ -944bp (HBS5), resp. V stabilnej HoxD10 nadmerne vystavený BGC823 a SGC7901 bunky, viazanie regiónoch na IGFBP3 promótor boli skúmané čipom testy. Zistili sme, že chromatín vyzráža HoxD10 špecifickou protilátkou bol amplifikovaný pomocou A2, A3 a A4 primery, ktoré zahŕňajú HBS3, HBS4 a HBS5 uvedenom poradí, zatiaľ čo žiadna amplifikácia bola pozorovaná s A1 priméry zahŕňajúce HBS1 a 2 (Obrázok 2B).

Aby sa ďalej získajú do regulačných segmentov IGFBP3 promótorom podľa HoxD10 sme klonovaný 2 rôzne DNA fragmenty, ktoré zahŕňajú HBSI (HBS1 a 2) a HBSII (HBS3, 4 a 5), ​​v danom poradí, na promótor SV40 Luciferase reportéri. Výsledky ukázali, že ko-transfekovány HoxD10, HBSII zvýšenou aktivitou promótorom SV40 o 4,0-krát v porovnaní s týmito prázdnych vektorovej transfektantů v BGC823 buniek (P < 0,01, obrázok 3A). Na rozdiel od toho HBSI nepreukázala žiadny významný vplyv na aktivitu promótorom SV40 (obrázok 3A). Podobné výsledky boli odhalené v ďalších nezávislých SGC7901 buniek, zmení činnosť promótor SV40 boli 3,3 a 0,9 násobne HBSII a HBSI, respektíve (obr S1A v S1 Súbor).

HBS3, 4 a 5 zdieľali spoločný viazacie prvok "Ttáto", zatiaľ čo HBS1 alebo HBS2 mať žiadny z týchto prvkov. Sme hypotézu, že HoxD10 priamo viaže na promótor IGFBP3 v miestach, "Ttáto". Za týmto účelom potvrdenia, sme sa syntetizuje 10bp oligonukleotidy, ktoré obsahujú sekvencie HBS3, HBS4 a HBS5 resp. Ako je znázornené na obrázku 3B, promótor SV40 aktivity bola zvýšená o 1,8, 2,0, 2,7 a záhyby, respektíve pri kotransfekovány plazmidom HoxD10 v BGC823 bunkách, zatiaľ čo bodové mutanty HBS3, HBS4 a HBS5 nevykazovali žiadne významné zmeny. reprodukovať sme podobné výsledky v SGC7901 bunkách (obr S1B v súbore S1).

Súhrnne, Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že IGFBP3 je priamym cieľom HoxD10 do buniek karcinómu žalúdka. medzi -1727 Identifikovali sme tri funkčné viazanie lokalít ~ -943bp v hornom toku IGFBP3 génu zodpovedného za HoxD10. HoxD10 Dalo by sa priamo viažu na promótor IGFBP3 potenciálne prostredníctvom HOx záväznú súčasťou "Ttáto".

IGFBP3 je downregulated u karcinómu žalúdka a vzťahujúce sa k pacienta prognózu

Ak chcete určiť expresný vzor IGFBP3 v rakoviny žalúdka, 86-pair chirurgickej vzorky ľudskej rakoviny žalúdka a podľa priľahlé noncancerous žalúdka bolo vyšetrených tkaniva. Intenzita farbenie IGFBP3 bola hodnotená ako 0 (negatívne), 1 (slabý), 2 (stredná), alebo 3 (hustý), ako je stanovené nezávisle na sebe dvomi patológmi (obr S2 v S1 Súbor). Výsledky ukázali, že hladina expresie IGFBP3 v nádorových tkanivách bola výrazne nižšia, než v susedných bez tumoru tkaniva (p 0,001, obrázok 4A a 4B). Okrem toho, IGFBP3 expresia bola hodnotená s ohľadom na klinicko-charakteristiky pacientov. IGFBP3 expresie bola v žalúdku nádoru lymfatických uzlín (p = 0,045), výrazne nižšie. Okrem toho sú vysokoteplotné IGFBP3 expresiu v nádoroch malých rozmerov (T1 + T2, 8/12) sa častejšie pozorované vo vzťahu k tomu vo veľkých, (T3 + T4, 36/74), aj keď sa žiadny významný rozdiel (p = 0,062) , Došlo tiež k žiadnej významnej korelácie medzi expresiou IGFBP3 a klinicko-funkcií, vrátane pohlavia, veku a patologické stupeň (Tabuľka 1).
IGFBP3 imunologické farbenie intenzitu
Clinical Klasifikácia
celkového počtu
Low (číslo)
vysoký (číslo)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. pohlavie, vek a klinicko-charakteristiky a výsledky Imunohistochémia vzoriek žalúdočnej nádorového tkaniva.
CSV na stiahnutie vo formáte CSV

Ďalej sme analyzovali koreláciu medzi expresiou IGFBP3 a celkové prežitie rakoviny žalúdka pacientov. Vyššia expresia IGFBP3 bola spojená s dlhšou dobou prežitia v 5 rokoch sledovania (p = 0,011, Kaplan-Meier prežitie Log-rank test) (obrázok 4C).

Vyradenie IGFBP3 génu podporuje žalúdočnú karcinóm migrácie a invázie

Pre vyhodnotenie funkčnú úlohu IGFBP3 v rakoviny žalúdka, sme skúmali migráciu a inváziu buniek po knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 sa selektívne knockdowned pomocou RNA interferencie v BGC823 a SGC7901 bunkách (Obrázok 5A a 5B), ktorý mal relatívnu vysokú úroveň endogénnej IGFBP3 v paneli žalúdočných bunkových línií (obr S3 v S1 Súbor). Výsledky ukázali, že umlčanie expresiu IGFBP3 významne zvyšuje bunkovú migráciu a to ako v transwell migrácie testoch (obr 5C a 5D) a poškriabaniu testu (obr S4 v S1 formát), kedy v porovnaní s negatívna kontrola siRNA. Okrem toho, knockdowning IGFBP3 vykazoval významne vyššiu aktivitu bunkovej invázie v testoch transwell (Obrázok 5E a 5F).

IGFBP3 moduluje prejavy MMP14, UPA a Upar

Ak chcete zistiť možné mechanizmy, ako IGFBP3 regulovať invasiveness rakovinových buniek žalúdka, sme skúmali hladiny mRNA MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, UPA a jeho receptor upÃr, z ktorých všetky sú faktory, invázie súvisiace, a to najmä u karcinómu žalúdka. Po prechodnej transfekciu sa IGFBP3 siRNA 72 hodín v BGC823 a SGC7901 buniek, hladiny expresie mRNA MMP14, UPA a Upar zvyšuje, zatiaľ čo žiadna významná zmena MMP2, MMP9 MMP7, alebo TIMP1 /TIMP2 bola pozorovaná (Obrázok 6A). E-cadherin, p-katenin a E-cadherin /SS-katenin komplexu boli získané za použitia rôznych lyzátov, ich úrovne nemal významnú zmenu po umlčanie IGFBP3 vo BGC823 bunkách (obr S5 v S1 Súbor). Tieto výsledky ukazujú, že IGFBP3 inhibuje inváziu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom, aspoň čiastočne, moduláciu prejavy MMP14, UPA a upÃr (obrázok 6B).

Diskusia

HOx nadčeľade sú skupina dôležitých transkripčných faktorov, ktoré by mohli regulujú proliferáciu a diferenciáciu buniek embronic [29,30]. Okrem toho, aberantne expresie HOx tiež hrá kľúčovú úlohu v progresii niektorých typov rakoviny [31]. HOx proteíny majú veľkú downstream regulačné sieť a vykonávať svoje funkcie predovšetkým prostredníctvom týchto cieľových génov [5]. Genómu-široká analýza bola vykonaná na obrazovku downstream génov HoxD10 počas vývoja miechy a v rakovinových bunkách žalúdku [4,32]. My a ďalšie odhalili jeden génový IGFBP3 spoločný cieľ, ktorá bola označená slúžiť ako nádorový supresor [10].

Naša štúdia poskytuje prvý dôkaz o tom, že HoxD10 sa priamo viaže na promótor IGFBP3 k aktivácii expresie IGFBP3 v rakovinových bunkách žalúdka. HoxD10 proteín by mohol byť zaradený do špecifickej promotorové oblasti génu IGFBP3, čo naznačuje, že by mohli HoxD10 priamo viazať na IGFBP3 génu. Aktivita luciferázy sa voľnej prírode, aj keď nie je mutant, HBS3, HBS4 alebo HBS5 bola významne zvýšená nadmernou expresiou HoxD10, čo naznačuje, že HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) a HBS5 (CTTTATTATT) boli tri funkčné HoxD10 väzobných miest v oblasti promotora IGFBP3. Ako sa dalo očakávať, úroveň expresie mRNA a proteínu IGFBP3 bola up-regulovaná nútenú expresiou HoxD10 v rôznych nádorových bunkových línií žalúdočných [4]. Štúdie ukázali, že proteíny majú určité HOx core konvenčné väzbové prvky, vrátane Ttáto, TAAT a TTAC [7]. Bodová mutácia s "Ttáto" na "TTCT" alebo "TCTT" na "TATTO" v oblasti promotora IGFBP3 v tejto štúdii ukazujú, že "Ttáto" alebo "TATTO" sú dôležité miesta viazania HoxD10. HOx proteíny by mohli byť priamo regulovať transkripčný proces nadväzujúcich cieľových génov ako monoméry alebo homodimery [33]. Vzhľadom k tomu, DNA väzbovú pôsobnosť HOx bielkovín sám o sebe je pomerne nízka [34], interakcie s kofaktory, ako je extradenticle (Exd) /PBX a Homothorax (HTH) /Meis proteíny sú heterodiméry alebo heterotrimers sú veľmi dôležité pre cieľové selektivity HOx proteínov [33, 35]. Iné transkripčné faktory vrátane Ptení a p53 by mohla regulovať expresiu IGFBP3 na úrovni transkripcie v bunkách karcinómu žalúdka a hrubého čreva [36,37]. Presné HoxD10 regulačné mechanizmy a kofaktory sa podieľajú na regulácii IGFBP3 potrebné objasniť v budúcnosti.

Expresia IGFBP3 bola downregulated v 86 žalúdočných adenokarcinómy tkanivách v porovnaní s ich susednými normálnych tkanív, a nízka expresia IGFBP3 bol tiež v korelácii s pokročilým lymfatických uzlín, vzdialené metastázy a zlé celkové prežitie. Naše výsledky boli v súlade s predchádzajúcou správou, že dobre alebo stredne diferencované žalúdočné adenokarcinóm mali významne vyššie percento IGFBP3 farbenie v nádorovom tkanive ako tie, ktoré v chudobných diferencovaný tie [38]. Okrem toho, v hypermetylace promótorom IGFBP3 bola často zistená v žalúdočnej nádorovom tkanive [16,39,40]. Funkčné IGFBP3 SNP (rs2854744 a rs2960436), ktoré určujú vysokú IGFBP3 hladinu cirkulujúceho boli spojené s priaznivou prognózou u pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka, ktorí dostávajú paliatívnu chemoterapia [41]. Avšak, ďalšie štúdia preukázala úplne protichodné výsledky, čo naznačuje, že expresia IGFBP3 bol vyšší vo vzorkách nádoru ako v normálnej sliznici (54 vzoriek nádoru a 20 priľahlé normálne vzorky, nie je uzavreté), a pozitívna expresia IGFBP3 bola spojená s pokročilým histologických stupeň, lymfatických uzlín a vzdialené metastázy bez významného rozdielu [42]. Možnosť intratumor heterogenity a zapísal kritériá môžu vyvolať rôzne výsledky v rôznych klinických štúdiách. Veľké populácie a prospektívnej štúdie bolo umožnené vyhodnotenie potenciálnej užitočnosť IGFBP3 ako biomarker progresia rakoviny žalúdka.

Pre ďalšiu identifikáciu úlohu IGFBP3 vo metastázy rakoviny žalúdka, sme hodnotili svoju úlohu pri modulácii migrácie a invázie buniek karcinómu žalúdka. Ukázalo sa, že umlčanie expresie IGFBP3 viedlo k rýchlemu hojeniu rany poškriabaniu a zvýšený počet buniek migrujúcich cez membránu transwell či potiahnuté s alebo bez Matrigelu. Predchádzajúce štúdie zameriava predovšetkým na funkciu IGFBP3 v bunkovej proliferácie a apoptózy. Iba niekoľko štúdií oznámil, že bol spojený s metastázami v ES, rakoviny prostaty a HNSCC [13-15]. Umlčanie expresie IGFBP3 by mohlo vyvolať bunkovú migráciu, inváziu a metastázy v ES [13]. IGFBP3 knockout myších samcov mali vyšší výskyt pľúcnych metastáz a invazivitu primárnych prostatických nádorových buniek bola zvýšená v priebehu 3-krát v porovnaní s tým, voľne žijúcich tie [14]. Adenovirový a rekombinantný IGFBP3 inhibuje vaskularizáciu a angiogenézu stimulujúci činnosť HNSCC potlačením produkcie vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) [15]. Migrácia a invázia je uľahčené celej rade faktorov, ktoré sú schopné indukovať epiteliálne-mezenchýmových prechod (EMT), ako je E-cadherin, p-kateninu a faktory degradujúcich extracelulárnej matrix, vrátane MMP, UPA a tak ďalej [43]. V bunkách ES, siRNA cielenie IGFBP3 zvyšuje expresiu MMP2 [13].

• Ploche ONE: Cisplatina or Not in Advanced rakoviny žalúdka: systematická kontrola a Meta-Analysis
• Ploche ONE: Optimálna dĺžka Fluorouracil-Based adjuvantnej chemoterapie u pacientov s operabilným žalúdočnej Cancer