Plos ONE: IGFBP3, transkripcijske Target za Homeobox D10, je v korelaciji s prognozo želodčne Cancer

Povzetek

Homeobox D10 (HoxD10) igra pomembno vlogo pri diferenciaciji embrionalnih celic in napredovanje raka dojke. Naše prejšnjem poročilu je pokazala, da insulinu podobnega rastnega faktorja vezavo protein-3 (IGFBP3) je urejeno z HoxD10 v želodčnih rakavih celic; Vendar, funkcionalne vloge in temeljne mehanizme IGFBP3 raka želodca, še vedno nejasna. Tukaj smo ugotovili, da je bila ekspresija IGFBP3 molekul po zunajmaternične izražanje HoxD10 v želodcu rakavih celic. Kromatin imuno test je pokazal, da HoxD10 vezan na treh potencialnih območij IGFBP3 promotorja. Eksogeni HoxD10 znatno povečala aktivnost luciferaze novinar, ki vsebujejo te zavezujoče regije v želodcu rakavih celic. Nadaljnji podatki so pokazali, da so vse te vezavnih mest je bilo Hox zavezujoč element "TTAT". Imunohistokemične rezultati za barvanje je pokazala, da je bila IGFBP3 izraz občutno navzdol reguliranih v 86 želodčnih adenokarcinomi tkivu glede na njihove sosednje niso rakavih tkiv (p < 0,001). Poleg tega je bila IGFBP3 izraz bistveno nižja v tumorja želodca z bezgavkah metastaze v primerjavi s tem, ne da bi bezgavko metastaze (p = 0,045). Bolniki z visoke ravni ekspresije IGFBP3 pokazala pozitivno 5 let skupnega preživetja (p = 0,011). Rasklapanje od IGFBP3 pospešeno selitev želodčni rak celic in invazijo in inducirano izražanje invazivnih dejavnikov, vključno MMP14, UPA in uPAR. Tako so naši podatki kažejo, da lahko HoxD10-ciljni gen IGFBP3 zatreti želodčni rak celic invazijo in podpira preživetje bolnikov z rakom želodca

Navedba. Xue M, Fang Y, ne G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, transkripcijski Target za Homeobox D10, je v korelaciji s prognozo želodčne raka. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423

Urednik: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 21. junij 2013; Sprejeto: 13. okt 2013; Objavljeno: 27. december 2013

Copyright: © 2013 Xue et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), National Temeljni raziskovalni program Kitajske (973 Program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) in raziskovalni sklad za doktorski program za visoko šolstvo Kitajske (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj~~HEAD=pobj). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak trenutno je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Skoraj polovica bolnikov želodca CANER že prebila v pozni fazi z limfnim ali daljni metastaz pri diagnozi in izgubi možnost za operacijo [2]. Ti bolniki imajo slabe rezultate in petletno preživetje za tiste z oddaljenih metastaz je manj kot 5% [3]. Napredovanje raka želodca se šteje, da je večstopenjski postopek, ki vključuje aktivacijo onkogenov in inaktivaciji zaviralnih genov. prej smo predstavili, da homeobox D10 (HoxD10) je služila kot zaviralnih ga zatirati rast tumorjev in invazivnosti, ki je bil epigenetically utišati z rakom želodca [4].

HoxD10 gen pripada homeobox naddružine, ki zakodirajo transkripcijskih faktorjev in izvaja naloge, predvsem z aktivacijo ali represije prodajnih ciljnih genov [5]. Amino-terminal veja Hox Homeodomena ima več ključnih zavezujoča soglasju elemente, vključno TTAT, TAAT in TTAC [6,7]. Na primer, HoxC8 veže na te elemente na promotor regijah in vpliva na transkripcijske aktivnosti pedf, NCAM, Zac1, OPN in Cdh11, kot je določeno z visoko celotnem kromatin imunoprecipitacijskih testih in globalno HoxC8 DNA zavezujočega analizo mesta [7]. Študije so pokazale, da HoxD10 zavira angiogenezo in celic gibljivost v rak endometrija (ES) [8] in ovira invazivnosti celic želodca in rak dojke [4,9]. Vendar pa je malo znanega o mehanizmih, kako HoxD10 izvaja svoje naloge v kancerogenosti in napredovanje tumorjev. Smo sistematično pregledala možne cilje HoxD10 s cDNA mikromrež in opredelil več genov, vključno inzulinu podoben rastni faktor-vezavni protein-3 (IGFBP3), ki bi bil odgovoren za tumorja zatiranje učinek HoxD10 raka želodca [4].

IGFBP3 je velik IGFBP vrste v obtoku, vezava več kot 75% v obtoku rasti insulin faktor-I (IGF-I) [10]. Da bi inhibira celično proliferacijo in inducira celično apoptozo več vrst raka, vključno z prostate in želodca raka [11,12]. Številne študije so potrdile, da IGFBP3 zavira invazivnosti raka endometrija (ES) celic [13], metastaze v raka prostate [14], in angiogenezo v glavi in ​​vratu ploščatoceličnega karcinoma (HNSCC) [15]. splošno se je štelo, da bi IGFBP3 blokira vezavno regijo IGF-I na njegov receptor IGF-IR, s čimer se odpravi učinek IGF /IGF-IR osi. Poleg odvisnosti IGF /IGF-IR osi, obstaja alternativna IGF /IGF-IR neodvisne in jedrsko translokacijo načine [10]. Številni faktorji so bile pojasnjene regulirati ekspresijo IGFBP3, vključno z retinojsko kislino, tumorje nekrotizirajočega faktorja-a, trichostatin A repne tipa homeobox 2 (CDX2) in metilacijskega statusa sebi [10,16]. Naši prejšnje študije so pokazale, da je bila IGFBP3 povečana pri AGS in MKN28 celic čezmerno izraženim HoxD10 [4]. Glede na promotorsko regijo IGFBP3 ima več potencialnih vezavnih mest za HoxD10, ki jih PROMO napovedane, program za napovedovanje transkripcijski faktor vezavnih mest [17], HoxD10 lahko neposredno medsebojno delovanje z IGFBP3 pri urejanju rakave celice invazije želodca. Pojasnitev tega omrežja bi zagotovila nadaljnji vpogled v vlogo IGFBP3 raka želodca.

V tej raziskavi smo ugotovili, da bi lahko HoxD10 neposredno veže na promotor regije IGFBP3 lahko preko TTAT element, tako transkripcijsko ureja svoj izraz v rakom želodca. Poleg tega je nivo izražanja IGFBP3 pogosto navzdol reguliranih v želodčnih tkivih raka in povezana s splošnim preživetja, kar kaže, da ima IGFBP3 pomembno vlogo v želodcu napredovanje raka. Funkcionalno lahko IGFBP3 zatreti migracije in vdor želodčnih rakavih celic, vsaj delno, z ureditvijo teh invazivnih dejavnikov, vključno metaloproteinaze-14 (MMP14) in urokinaza tipa aktivator plazminogena (uPA).

materiali in metode

celični kulturi

Osem želodca rakave celične linije (AGS, MKN28, MKN45, NIS-N87, BGC823, HGC27, MGC803 in SGC7901) so bili pridobljeni iz Riken genske banke (Tsukuba, Japonska) in American Type Culture Collection (Manassas, ZDA). Ena ni malignih celic linije želodca (GES-1) je bil pridobljen iz Pekinga Inštituta za raziskave raka (Peking, Kitajska). Celice smo gojili v RPMI 1640 medija (Invitrogen, Carlsbad, ZDA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS, Sijiqing, Huzhou, Kitajska) in inkubiranih pri 5% CO _{2, 37 ° C in 95% vlagi.}

Gradnja IGFBP3 luciferaze novinar plazmidov

Trije različni delci v promotorja regiji IGFBP3, vključno -2282 do 56 bazičnih točk (2,3 KB, pIGFBP3) -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 vezavno mesto I, HBSI) in -1727 ~ -943 bp (HBSII), so ojačani s PCR z uporabo genomske DNA, povzete iz HEK-293T divjih celic kot predlogo. HBSI obsega HBS1 in 2, HBSII vsebuje od HBS3, 4 in 5, v kateri so HBS1-5 napovedano s PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS oligonukleotidov sekvence so bile: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'in 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'in 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'in 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Fragmente PCR so bili vezan v PGM-T vektor (Tiangen, Peking, Kitajska), razgradili s KpnI /BgIII (Promega, Madison, ZDA) in nato subklonirali v mestih Kpnl /BgIII v pGL3-bazni vektor (Promeg) za ustvarjanje pGL3-pIGFBP3-osnovno luciferaza reporter plazmidov, in pGL3-promotor vektor (Promega) za ustvarjanje pGL3-HBSI (II) -promoter luciferaza reporter plazmidov. Vsi konstrukti so potrdile zaporedja DNK.

Gradnja luciferaze novinar plazmidov HBSS

smo sintetizirali oligonukleotidov s predvidenimi Hox vezavnih mest (HBSS) v promotorja regijah IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) in vsak ima eno samo točko mutant mestu (A → C), oligonukleotidi so bili naslednji:

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'in 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3';

mutant HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'in 5' CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3 ';

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'in 5' CATGGTAAACGATAATCTAG-3 ';

mutant HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'in 5' CATGGGAAACGAGAATCTAG-3 ';

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'in 5' CATGGGAAATAATAATCTAG-3 ';

mutant HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'in 5' CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3 ".

dvojno vijačnico HBSS so razbeljenem in vstavi v gorvodno od pGL3-promotorja vektorja za ustvarjanje luciferazno reporter plazmidov [18]. Vsi konstrukti so potrdile zaporedja DNK.

Cell transfekciji

želodcu cacner celice (BGC823 in SGC7901) so transfekciji s pcDNA3.1-HoxD10 ali pcDNA3.1 prazen vektor z uporabo Fugene HD (Promega) . Za generiranje stabilne celične linije HoxD10 overexpression zgoraj bile transficirane celice z 400 mg /ml G418 (Merck, Darmstadt, Nemčija) izbrana za nadaljnjih 14 dni. Za-siRNA posredovano genov rasklapanje, so BGC823 in SGC7901 celice transficirane z negativno kontrolno siRNA ali siRNA (Qiagen, Hilden, Nemčija), HGC27 celice smo transfektirali z negativno kontrolno siRNA ali ciljno HoxD10 siRNA (Genepharma, Šanghaj, Kitajska)-ciljno IGFBP3 uporabi Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen).

luciferaza dejavnost test

1,0 x 10 ^{5 BGC823 in SGC7901 celice smo zasejali v 24 vdolbinami za 24 ur, nato transfekciji s 0.4μg pcDNA3.1 praznim vektorjem ali pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3-osnovna (promotor) prazen vektor ali pGL3-pIGFBP3 (HBS) -Osnovni (promotor), in 0.004μg PRL-TK vektor (Promega), ki vsebuje preverjenih renilla pomočjo Fugene HD [18]. Luciferazno aktivnost smo analizirali na dva načina-luciferaza sistema testa novinar po 48 urah po protokolih proizvajalca (Promega).}

kromatina imunoprecipitacije (chip)

V stabilna HoxD10 prekomerno BGC823 in SGC7901 celične linije, kromatin je imuno z HoxD10 monoklonsko protitelo (rabbit, santa Cruz Biotechnology Inc., santa Cruz, ZDA) [19] ali normalno zajec IgG (negativna kontrola) po Simple čip Encimska kromatina IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , ZDA). Obarjenih DNA ali 2% Vhodni vzorci z genomsko DNA iz HEK-293T živečih celic smo pomnožili s Taq DNA polimerazo (Takara, Otsu, Japonska) [20,21]. Štiri primerji ki zajemajo HBSS v različnih mestih IGFBP3 promotorja bila zasnovana kot sledi: A1 (-2251 ~ -2073 bp, za HBS1 in 2), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'in 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 bp, za HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'in 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp za HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'in 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153 ~ -877bp za HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'in 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'.

reverzno transkripcijo-PCR

Celotno RNA smo izolirali s Trizol reagent (Cwbiotech, Peking, Kitajska). Reverzna transkripcija (RT) -PCR smo določili z M-MLV reverzne transkriptaze (Takara) in Taq DNA polimerazo. Naslednji primerji smo uporabili za pomnoževanje:

GAPDH, 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'in 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'in 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'in 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'in 5' ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3 ';

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'in 5' TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3 ';

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'in 5' GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3 ';

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'in 5' AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3 ';

zaviralec tkivo metalo-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3' in 5 ' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'in 5' TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3 ';

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'in 5' CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3 '; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'in 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.

Western blot

Skupaj proteini so bili pridobljeni s pomočjo RIPA lize pufra (Beyotime, Haimen, Kitajska). Triton X-100 liza pufer je bil uporabljen za pridobivanje topni E-kadherina in SS-catenin je SDS liza pufer se uporablja za pridobivanje netopno E-kadherina /SS-catenin kompleks [22]. Lizate rešiti na SDS-PAGE gelu in prenesli na PVDF membrano (Millipore, Bedford, ZDA). V blots bilo zaznati z HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-kadherina (1: 1000, celična signalizacija Technology Inc.), ß-catenin ( 1: 1000, celična signalizacija Technology Inc.) ali GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) protitelesa. V blots smo prikazali uporabo kemiluminscenco z Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokio, Japonska). Relativne gostote proteinov kvantificiramo s slike J. programsko opremo in normalizirana na GAPDH [20].

ran-zdravilne Preskusno

BGC823 in SGC7901 celice transfekciji s IGFBP3 siRNA ali nadzirati negativna siRNA v šest jamicami in nato opraskan z p10 pipeto bi ustvarili vrzel. Vdolbine speremo s PBS odstraniti razseljenih celice in sveže medije (1% FBS za BGC823 in brezplačno za SGC7901 serum) je bila dodana. Tri randomiziranih podobe opraskan področjih so bili sprejeti (x 40 povečavo) v 0h, 12h in 24h [23].

Transwell migracije in invazijo testi

Cell migracije in invazije so bile ocenjene z modificiranim Boyden transwell komore (Corning Inc, Corning, ZDA), prevlečene z (za invazijo) ali brez (za migracije) Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, ZDA). siRNA transfekciji in stradanje celice zasadimo na zgornjo komoro v gojitvenem mediju, ki vsebuje 1% FBS (BGC823) ali brez FBS (SGC7901) FBS dodamo k spodnji komori medij, ki vsebuje 15% so bile celice v zgornji komori previdno odstranimo po inkubaciji 16 h (za migracije) ali 36h (za invazijo). Preselili celice smo obarvali z 0.5μg /ml DAPI obarvanje Solution (Roche, Penzberg, Nemčija). Številke celic so bili naključno prešteti na petih področjih (x 400 povečavo) [24]. Napadel celice smo inkubirali z Cell Stain rešitev (Millipore) in fotografirali (× 200). Zmes barvilo speremo s ekstrakcijskega pufra in prenese v 96-vodnjaka za kolorimetrično merjenje pri 560nm v mikroploščnem čitalniku (Thermo, Boston, ZDA) [25,26].

Bolniki in vzorci
86 operaciji adenokarcinomom želodca so bili vključeni od maja 2007 do februarja 2008, po podpisu privolitev. Ta študija je bila odobrena s kliničnimi raziskavami Odbor za etiko sira Run Run Shaw bolnišnica Zhejiang University. so bili pridobljeni z ujemanjem tumor tkiva in sosednje tumorske brez tkiva. clinicopathological podatkov pacientov, vključno s spolom, starostjo, TNM fazah in patoloških razredov so bili pridobljeni iz zdravstvenih kartotek. Spremljanje je bila izvedena na intervalu za 1 leto po operaciji, medicinski zgodovini je bil posnet, ko je bolnik prišel naslednjem obisku. Čas Kritična nadaljnje ukrepanje je bilo avgusta 2012 in mediana spremljanja, ko je bila 35 mesecev (razpon 1-63 mesec).

tkiv mikromrež in Imunohistokemijsko

Jedra merijo 1,5 mm v največje mere so bile narejene iz ne-odmrlih področjih ujema tumorskih tkiv in sosednjih tumorskih brez tkiva. Tkivo mikromrež stekelca, ki vsebujejo 4μm debele mikromrež odseke so bili izdelani z uporabo standardnih tehnik (v sodelovanju s Shanghai Superchip Company, Ltd, Šanghaj, Kitajska). Ploščice smo inkubirali s IGFBP3 protitelesom (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) preko noči pri 4 ° C, ter nato inkubiramo s sistemom predvidevamo plus detekcijo (predvidevamo ™ + /HRP /Rb Dako, Kopenhagen, Danska). Oddelki so bili razviti v raztopini 3,3'-diaminobenzidine pod mikroskopskim opazovanjem in jih nasprotno s hematoksilinom [27]. Tkiva napredovalega raka dojke smo obarvali kot pozitivno kontrolo [28]. Delež pozitivnih celic v vsakem vzorcu, je količinsko pod mikroskopom in razvrščeni v štiri skupine. 0: 0-5% pozitivnih celic; 1: 6% do 50% pozitivnih celic; 2: 51% do 75% pozitivnih celic in 3: 76-100% pozitivne celice. Intenziteta IGFBP3 obarvanja bila ocenjena kot sledi: ni obarvanja = 0; šibko obarvanje = 1; zmerno obarvanje = 2; gosto obarvanje = 3. ocena intenzivnosti plus delež pozitivnih barvanjem je bil opredeljen kot IGFBP3 rezultat barvanja. Rezultatom 0-3 štela kot nizko izražanja in 4-9 kot visoko ekspresijo.

Statistična analiza

razlika izraz IGFBP3 med tumorskega tkiva in ne-tumorskega tkiva smo določili z Mann-Whitney U-test. Hi-kvadrat test je bil uporabljen za analizo odnosov med clinicopathological funkcij in IGFBP3 barvanja točk. Verjetnost celokupnega preživetja je bila izračunana po metodi Kaplan-Meier in razlike med krivuljami je bila ocenjena s preskusom Log-rank. Odrezano p < 0,05 štelo, da je statistično značilno

Rezultati

HoxD10 upregulates izraz IGFBP3

Genome vsej analiza je pokazala, da so bile urejene več genov, vključno IGFBP3. z HoxD10 v želodcu rakavih celic v naši prejšnji študiji (4). Da bi ugotovili, ali bi HoxD10 transkripcijsko uravnavajo izražanje IGFBP3 v želodčnih rakavih celicah, smo opazili nivoja izražanja IGFBP3 po stalni uvedbi HoxD10 gena v BGC823 in SGC7901 celic ali prehodno podreti od HoxD10 v HGC27 celicah. RT-PCR in Zahodni rezultati pivnanjem dosledno pokazali, da je bila ekspresija IGFBP3 znatno povečana pri HoxD10 prekomerno celic (slika 1A in 1B), medtem ko je navzdol reguliranih po dušenje zvoka iz HoxD10 v HGC27 celic (slika 1C in 1D).

2,3 kb sekvenca (-2.282-56 bp) v smeri proti toku območju IGFBP3 smo klonirali v pGL3-bazni vektor in se uporablja za oceno luciferazno aktivnost z dvojno luciferaza reporterskih testih. Rezultati kažejo, da je bila dejavnost IGFBP3 promotor v BGC823 in SGC7901 celic okrepila za 4,2 in 3,8 gubah oziroma po tem, ko so-transfekciji s pcDNA3.1-HoxD10 glede na pcDNA3.1 vektorske transfektanti (p < 0,01, slika 1E). Če povzamemo, ti podatki kažejo, da bi lahko HoxD10 transkripcijsko upregulate izražanje IGFBP3 v želodčnih rakavih celic.

Identifikacija novih regulatornih regij v promotorja IGFBP3, ki so odgovorni za HoxD10

Naslednja analizirali potencialno HoxD10 vezavnih mest v promotorja IGFBP3. pred zaporedje 2.3 kb od IGFBP3 gena vnesene v PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), program za napovedovanje transkripcijski faktor vezavnih mest v enem zaporedju ali v skupini povezanih zaporedij (17 ), in 5 možne vezave HoxD10 strani (HBS1 ~ 5) je bilo predvideno (tabela S1). Kot je prikazano na sliki 2A, je bilo teh pet HBSS lokalizirana na -2191 ~ -2182bp (HBS1) -2111 ~ -2102bp (HBS2) -1700 ~ -1691bp (HBS3) -1418 ~ -1409bp (HBS4) in -953 ~ -944bp (HBS5) oz. V stabilna HoxD10 prekomerno BGC823 in SGC7901 celice, zavezujoče regije na IGFBP3 promotorja so raziskovali s čipom testih. Ugotovili smo, da je kromatin s HoxD10 specifičnih protiteles obori pomnožili s pomočjo A2, A3 in A4 začetnih oligonukleotidov, ki zajemajo HBS3, HBS4 in HBS5, medtem ko se ni bilo pomnoževanje opazili A1 primerji zajemajo HBS1 in 2 (Slika 2B).

Da bi še dodatno pridobili v regulativnih segmente IGFBP3 promotorja po HoxD10 smo klonirali 2 različne DNA fragmente, ki zajemajo HBSI (HBS1 in 2) in HBSII (HBS3, 4 in 5), oziroma, v SV40 promotor luciferazni novinarji. Rezultati so pokazali, da v primerjavi s tistimi praznimi vektorsko transfektanti v BGC823 celice sočasno transfektirana z HoxD10, HBSII izboljšano SV40 promotorsko aktivnost s 4,0-krat (P < 0,01, slika 3A). V nasprotju s tem, HBSI ni pokazala pomembnega učinka na SV40 promotor dejavnosti (slika 3A). Podobni rezultati so se pokazali v drugi neodvisni SGC7901 celic, so bile spremembe v dejavnosti SV40 promotor 3,3 in 0,9-krat po HBSII in HBSI oz (slika S1A v S1 datotek).

HBS3, 4 in 5 delijo skupen zavezujoč element "TTAT", medtem ko HBS1 ali HBS2 nobeden od teh elementov. Smo hipotezo, da HoxD10 neposredno veže na promotor IGFBP3 na "TTAT" strani. Da bi to potrdili, smo sintetizirali 10bp oligonukleotidov, ki vsebujejo sekvence HBS3, HBS4 in HBS5 oz. Kot je prikazano na sliki 3B, so bile aktivnosti promotor SV40 okrepila za 1,8, 2,0 in 2,7 gube oziroma ob sočasni transfekciji s HoxD10 plazmida v BGC823 celicah, medtem ko točka mutanti HBS3, HBS4 in HBS5 ni pokazala bistvenih sprememb. reproducirati smo podobne rezultate v SGC7901 celic (Slika S1B v Datoteka S1).

S kolektivno, Zgornji rezultati kažejo, da je IGFBP3 neposreden cilj HoxD10 v želodčnih rakavih celic. Identificirali smo tri funkcionalne vezi mesta med -1727 ~ -943bp v gorvodno od IGFBP3 gena, odgovornega za HoxD10. HoxD10 lahko neposredno veže na promotor IGFBP3 potencialno skozi Hox zavezujoč element "TTAT".

IGFBP3 je navzdol reguliranih pri raku želodca in so povezane z bolnikovi prognoze

Za določitev izraz vzorec IGFBP3 pri raku želodca, 86-pair kirurški primerke človeškega raka želodca in po sosednji noncancerous želodca so bili pregledani tkiva. Intenziteta IGFBP3 obarvanja je dosegel kot 0 (slabo), 1 (šibko), 2 (zmerna) ali 3 (gosto), kot je določeno neodvisno z dvema patologi (Slika S2 v S1 datotek). Rezultati so pokazali, da je bila stopnja izraz IGFBP3 v tumorskih tkivih bistveno nižje kot v sosednjih tumorskih brez tkiv (P, 0,001, Slika 4A in 4B). Poleg tega je bila IGFBP3 izraz ocenili glede na zastavljene clinicopathological značilnosti bolnikov. IGFBP3 izraz je bila precej nižja v tumorja želodca z bezgavkah metastaze (p = 0,045). Poleg tega je bila visoka IGFBP3 izraz v mali tumorjev (T1 + T2, 12/08), pogosteje pojavlja glede na to, v velika podjetja (T3 + T4, 36/74), čeprav brez znatne razlike (p = 0,062) . Prav tako ni pomembna povezava med izražanjem IGFBP3 in clinicopathological funkcije, vključno s spolom, starostjo in patološko razred (tabela 1).
IGFBP3 imunskim barvanjem intenzivnost
kliničnih klasifikaciji
Skupno število
Low (število)
Visoka (število)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Spol, starost in clinicopathological značilnosti in rezultati imunohistokemija vzorcev želodčnih tumor tkiva.
CSV prenos CSV

Nadaljevali smo analizirali povezavo med izražanjem IGFBP3 in celokupnega preživetja raka želodca bolnikov. Višje izraz IGFBP3 je bila povezana z daljšim časom preživetja v 5 letih spremljanja (p = 0,011, Kaplan-Meier preživetje Log-rank test) (slika 4C).

rasklapanje od IGFBP3 gena spodbuja želodca rakava celica migracije in invazije

Da bi ocenili funkcionalno vlogo IGFBP3 pri raku želodca, smo raziskovali migracije celic in invazijo po knockdowning IGFBP3 vitro. IGFBP3 je selektivno knockdowned motnje RNA v BGC823 in SGC7901 celic (Slika 5a in 5b), ki je imel relativno visoko raven endogenega IGFBP3 v senatu celičnih linij želodca (Slika S3 v S1 datotek). Rezultati so pokazali, da utišanje izražanja IGFBP3 znatno povečala celične migracije tako transwell migracijskih testih (slika 5C in 5D) in test na praske (slika S4 v S1 datotek), v primerjavi s položajem negativne kontrolne siRNA. Poleg tega knockdowning IGFBP3 prikaže bistveno večjo aktivnost celični invaziji v transwell teste (slika 5e in 5f).

IGFBP3 modulira izraze MMP14, UPA in uPAR

Če želite ugotoviti možne mehanizme, kako IGFBP3 urediti invazivnosti želodca rakavih celic, smo preverjali raven mRNA MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA in njegov receptor uPAR, ki so vse povezane z invazijo dejavniki, predvsem v raka želodca. Po prehodno transfekciji s IGFBP3 siRNA za 72h v BGC823 in SGC7901 celic, ravni mRNA izraz za MMP14, UPA in uPAR povečala, medtem ko nobena bistvena sprememba MMP2, MMP7, MMP9 ali TIMP1 /TIMP2 opazili (slika 6A). E-kadherina, ß-catenin in E-kadherina /ß-catenin kompleks so pridobljeni z uporabo različnih lizate je bilo treba njihove koncentracije ne smiselne spremembe po utišanje IGFBP3 v BGC823 celic (Slika S5 v S1 datotek). Ti rezultati so pokazali, da IGFBP3 inhibira vdor želodčnih rakavih celic skozi, vsaj deloma, moduliranje izraze MMP14, uPA in uPAR (slika 6B).

Diskusija

Hox naddružina so skupina pomembnih transkripcijskih faktorjev, ki bi lahko uravnavajo proliferacijo in diferenciacijo embronic celic [29,30]. Poleg tega aberantno izraz Hox ima tudi kritično vlogo pri napredovanju več vrst raka [31]. Hox proteini imajo veliko nižji stopnji regulativni mrežo in izvajajo svoje naloge predvsem s pomočjo teh ciljnih genov [5]. analiza genoma vsej je bila izvedena na zaslonu gene na nižji stopnji iz HoxD10 med spinalno razvoj kabel in želodčne rakavih celic [4,32]. Mi in drugi so pokazale en skupni ciljni gen IGFBP3, ki je bil poročali, da služi kot tumorski supresorski [10].

Naše študije so prvi dokazi kažejo, da HoxD10 neposredno veže na promotor IGFBP3 aktivirati izražanje IGFBP3 v želodčnih rakavih celic. HoxD10 beljakovine se lahko zaposli na posebno promotorja regiji IGFBP3 gena, kar pomeni, da bi lahko HoxD10 neposredno vežejo na IGFBP3 gena. Luciferazno aktivnost v naravi, hkrati pa ne mutant je HBS3, HBS4 ali HBS5 znatno povečala s prekomerno HoxD10, kar kaže, da so bili HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) in HBS5 (CTTTATTATT) tri funkcionalne HoxD10 veznih mest na promotorja regiji IGFBP3. Kot je bilo pričakovati, je bilo nivo izražanja IGFBP3 mRNA in proteina molekul s prisilnim izražanja HoxD10 različnih želodčnih raka celičnih linij [4]. Študije so pokazale, da imajo Hox proteini nekaj core soglasju zavezujoče elemente, vključno TTAT, TAAT in TTAC [7]. Točka mutacije z "TTAT" do "TTCT" ali "TCTT" do "TATT" v promotorski regiji IGFBP3 v tej študiji kažejo, da so "TTAT" ali "TATT" pomembna vezave lokacije za HoxD10. Hox proteini lahko neposredno urejajo postopek transkripcije nadaljnjih ciljnih genov so monomeri ali homodimers [33]. Ker je DNA veže pristojnost sama Hox proteinov relativno nizka [34], interakcije z kofaktorjev kot extradenticle (Exd) /PBX in Homothorax (HTH) /Meis proteini so heterodimerov ali heterotrimers so ključnega pomena za ciljno selektivnosti Hox proteinov [33, 35]. Drugi transkripcijski dejavniki, vključno s PTEN in p53 lahko regulira izražanje IGFBP3 na transkripcijski ravni v želodcu in črevesne celic karcinoma [36,37]. treba razjasniti v prihodnosti Natančne HoxD10 regulativne mehanizme in kofaktorji sodelujejo pri urejanju IGFBP3.

Izraz IGFBP3 je navzdol reguliranih v 86 želodčnih adenokarcinome tkiv, odvisno od njihovih sosednjih normalnih tkiv in nizko izražanje IGFBP3 je povezana tudi z napredno bezgavkah metastaze, oddaljenih metastaz in slabe celokupnega preživetja. Naše ugotovitve so skladne s predhodnim poročilom, ki je imel dobro ali zmerno diferenciranega želodca adenokarcinomov bistveno višji odstotek IGFBP3 barvanjem v tumorskih tkivih, kot tisti, ki v revnih diferenciranih tiste [38]. Poleg tega je bil hypermethylation v promotor IGFBP3 pogosto odkrijejo v želodčnih tumorskih tkivih [16,39,40]. Funkcionalne IGFBP3 SNP (rs2854744 in rs2960436), ki določajo visoko IGFBP3 kroži ravni so bile povezane z ugodno prognozo bolnikov z napredovalim rakom želodca, ki prejemajo paliativno kemoterapijo [41]. Vendar pa je druga študija je pokazala povsem nasprotne rezultate, kar kaže, da je bil izraz IGFBP3 večja pri vzorcih tumorjev, kot da se pri normalni sluznici (54 vzorcih tumorjev in 20 sosednjih običajnih vzorcev, ne ujema) in pozitivno izražanje IGFBP3 je bila povezana z napredno histoloških razred, bezgavko metastaze in oddaljene metastaze brez znatne razlike [42]. Možnost intraperitonealna heterogenosti in vpisanih meril, lahko povzroči različne rezultate v različnih kliničnih študij. Velike populacije in prihodnje študije je bilo dovoljeno, da ocenijo potencialno uporabnost IGFBP3 kot biomarker napredovanja raka želodca.

Da bi še dodatno opredeliti vlogo IGFBP3 v metastaz raka želodca, smo ocenili svojo vlogo pri modulaciji migracije in invazije želodčnih rakavih celic. Izkazalo se je, da utišanje izražanja IGFBP3 povzročila hitro ozdravitev praske rane in povečano število celic, ki prehajajo skozi transwell membrano, ali prevlečena z ali brez Matrigel. Predhodne študije večinoma osredotočena na funkcijo IGFBP3 v celične proliferacije in apoptoze. Le številne študije poročajo, da je bil povezan z metastazami v ES, raka na prostati in HNSCC [13-15]. Utišati izražanje IGFBP3 lahko povzroči celično migracijo, invazijo in metastaze v ES [13]. IGFBP3 knockout miši moškega imeli večjo pojavnost pljučnih metastaz in invazivnosti primarnih prostate tumorskih celic je povečalo več kot 3-krat v primerjavi s tisto divjih tiste [14]. Adenovirusno in rekombinantni IGFBP3 zaviral vaskularizacijo in-angiogenezo spodbujanje dejavnosti HNSCC tako, da zavira nastajanje žilnih endotelijskih rastnih faktorjev (VEGF) [15]. Migracije in invazije so lažje od številnih dejavnikov, ki lahko inducira epitelne-mezenhimskih prehoda (EMT), kot je E-kadherina, ß-catenin in dejavnikov razgradljive zunajceličnega matriksa, vključno z MMP, UPA in tako naprej [43]. V celicah ES, siRNA ciljanje IGFBP3 poveča izražanje MMP2 [13].

• Plos ONE: Cisplatin ali ne v naprednem želodca raku: sistematični pregled in metaanaliza
• Plos ONE: Optimalna Trajanje Fluorouracil-Based adjuvantno kemoterapijo za bolnike z resektabilne Rak želodca