PLoS ONE: IGFBP3, prepisivanja meta Homeobox D10, u korelaciji s prognozu rak želuca

Sažetak pregled

Homeobox D10 (HoxD10) igra važnu ulogu u diferencijaciji embrionalnih stanica i progresiju raka dojke. Naša prethodna izvješće otkriva da inzulinu sličan faktor rasta obvezujuća proteina-3 (IGFBP3) bio je reguliran HoxD10 u želučanim stanicama raka; Međutim, funkcionalne uloge i temeljni mehanizmi IGFBP3 u rak želuca ostaju nejasni. Evo, utvrdili smo da je izraz IGFBP3 su regulira prema gore nakon izvanmaternične izražavanja HoxD10 u želučanih stanica raka. Kromatina imunotaloženje analiza pokazala je da HoxD10 vezana za tri potencijalna područja IGFBP3 promotora. Egzogeni HoxD10 značajno poboljšana aktivnost luciferaze sadrži ove vezne regije u želučanih stanica raka. Drugi podaci pokazali su da su sve te veznih mjesta imala Hox obvezujući element "TTAT". Imunohistokemijski rezultati bojanja otkrila da je ekspresija IGFBP3 značajno downregulated 86 želučanim adenokarcinoma tkiva u usporedbi s njihovim susjednim ne-kancerogena tkiva (p < 0.001). Štoviše, IGFBP3 izraz lica bio je značajno niži u želučanom tumorom limfnih čvorova metastaza u usporedbi s onom bez limfnog čvora metastaza (p = 0,045). Bolesnici s visokom razinom ekspresije od IGFBP3 pokazali povoljan ukupno preživljenje 5 godina (p = 0,011). Obaranje IGFBP3 ubrzan želučane migraciju stanica raka i invaziju i inducira ekspresiju invazivnih čimbenika, uključujući MMP14, i uPAR. Dakle, naši rezultati pokazuju da HoxD10 ciljani gen IGFBP3 može potisnuti invazija želučano stanica raka i potiče preživljavanje pacijenata s rakom želuca pregled

Izvor:. Xue M, Fang Y, Sun G, Zhuo W, Zhong J, Qian C, et al. (2013) IGFBP3, prepisivanja meta Homeobox D10, u korelaciji s prognozu rak želuca. PLoS ONE 8 (12): e81423. doi: 10,1371 /journal.pone.0081423 pregled

Urednik: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 21. lipnja 2013. godine; Prihvaćeno: 13. listopada 2013; Objavljeno: 27. prosinca 2013 pregled

Copyright: © 2013 Xue i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Nacionalni Osnovni istraživački program Kina (973 program) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) i istraživački fond za doktorski program visokog obrazovanja u Kini (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj~~HEAD=pobj). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je četvrti najčešći karcinom i trenutno je drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu [1]. Gotovo polovica pacijenata želučanih Caner već unaprijeđen na kasnoj fazi sa limfnog ili udaljenih metastaza pri dijagnozi i izgubiti priliku za operaciju [2]. Ovi pacijenti imaju slab ishod, a stopa preživljavanja od pet godina za one s udaljenim metastazama je manje od 5% [3]. Napredovanje raka želuca smatra se proces od više koraka, koji uključuje aktivaciju onkogena i inaktivacije gena za suzbijanje tumora. Smo prethodno prikazani da homeobox D10 (HoxD10) služi kao tumor-supresor do supresije tumorskog rasta i invazivnost, koji je epigenetically prigušivačem u karcinomu želuca [4]. pregled

HoxD10 gena pripada superfamiliji homeobox, koji kodiraju transkripcijski faktori, a vrše funkcije uglavnom kroz aktivaciju ili nizvodnih ciljnih [5] gena. Amino-terminalni ruka Hox homeodomain ima nekoliko osnovnih obvezujući konsenzus elemenata, uključujući TTAT, TAAT i TTAC [6,7]. Na primjer, HoxC8 veže na tim elementima na regije promotora i modulira transkripcijske aktivnosti pedf, NCAM, Zac1, OPN i Cdh11, što je određeno visoko tijekom kromatina imunoprecipitacijski testovi i globalne HoxC8 DNA-vezujuće analize stranice [7]. Studije su pokazale da HoxD10 inhibira angiogenezu, a staničnu pokretljivost karcinoma endometrija (EC) [8] i oštećuje stanične invazivnost želuca i raka dojke [4,9]. Međutim, malo se zna o mehanizmima kako HoxD10 ispoljava svoje funkcije u karcinogeneze i progresiju tumora. Sustavno su prikazani potencijalne mete HoxD10 by cDNA microarray i identificirati više gena, uključujući i inzulinu sličan faktor rasta obvezujuća proteina-3 (IGFBP3) koja bi mogla biti odgovorna za tumor suzbijanja utjecaja HoxD10 kod raka želuca [4]. pregled

IGFBP3 je jedan od glavnih IGFBP vrsta u optjecaju, vezanje preko 75% cirkulirajuće rasta inzulina faktor-I (IGF-I) [10]. To može inhibirati proliferaciju stanica i inducirati staničnu apoptozu nekoliko tipova raka, uključujući rak prostate i želuca raka [11,12]. Nekoliko istraživanja je potvrdilo da IGFBP3 potiskuje invazivnosti raka endometrija (EZ) ćelije [13], metastaziranje karcinoma prostate [14], i angiogeneze u glavi i karcinom vrata pločastih stanica (HNSCC) [15]. Je općenito smatra da se mogu blokirati IGFBP3 veznu regiju IGF-I na njegov receptor IGF-IR, čime se ukida učinak IGF /IGF-IR osi. Osim ovisnosti IGF /IGF-IR osi, postoji alternativna IGF /IGF-IR samostalnih i nuklearne izgon načina [10]. Mnogi faktori su razjašnjene u regulaciju ekspresije IGFBP3 uključujući retinoičnom kiselinom, faktora nekroze tumora-a, trihostatin A, repna tipa homeobox 2 (CdX2) i status metilacije sebe [10,16]. Naši prethodne studije su pokazale da je IGFBP3 je reguliran u AGS i MKN28 stanica ekspresijom HoxD10 [4]. S obzirom na promotorske regije IGFBP3 ima nekoliko potencijalnih mjesta za vezanje HoxD10, predvidio PROMO, program za predviđanje faktora transkripcije veznih mjesta [17], HoxD10 može izravno međuigri s IGFBP3 u regulaciji invazije želučane stanica raka. Rasvjetljavanje ove mreže će osigurati daljnji uvid u ulogu IGFBP3 u raka želuca. pregled

U ovom istraživanju smo utvrdili da HoxD10 može izravno vezati promotorske regije IGFBP3 potencijalno putem elementa TTAT, stoga prepisivanje regulira svoj izraz u raka želuca. Pored toga, razina ekspresije IGFBP3 često regulirani u želučanom tkivu raka, odnosi se na ukupno preživljenje, što ukazuje da IGFBP3 igra važnu ulogu u napredovanju raka želuca. Funkcionalno IGFBP3 mogao potisnuti migraciju i invaziju stanica želuca raka, barem djelomično, putem reguliranja tih invazivnih faktora, uključujući metaloproteinaze-14 (MMP14) i urokinaza-tip plazminogen aktivator (uPA), pregled

Materijali i metode

stanična kultura pregled

Osam želučani stanične linije raka (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 i SGC7901) dobiveni su iz Riken banka gena (Tsukuba, Japan) i American Type Culture Collection (Manassas, USA). Jedna ne-maligne stanične linije želuca (GES-1) dobiven je iz Pekinga Instituta za istraživanje raka (Peking, Kina). Stanice su uzgojene u RPMI 1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Sijiqing, Huzhou, Kina) i inkubira se na 5% CO _{2, 37 ° C i 95% vlage. pregled}

Izgradnja IGFBP3 reporterskog plazmida pregled

Tri različite fragmente u promotorske regije IGFBP3, uključujući -2282 do 56 bp (2.3 KB, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 bp (HoxD10 vezno mjesto i HBSI) i -1727--943 bp (HBSII), umnoženi su s PCR koristeći genomske DNA ekstrahirane iz HEK-293 divlje stanica kao predloška. HBSI obuhvaća HBS1 i 2, HBSII Sadrži HBS3, 4. i 5., u kojem HBS1-5 su predvidjeli PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. HBS nizovi primera su kao što slijedi: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'i 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'i 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'i 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Fragmenti su legirani u PGM-T vektor (Tiangen, Peking, Kina), obradi KpnT /BglII (Promega, Madison, SAD), a zatim subkloniran u KpnI /BglII lokacija u pGL3-Basic vektor (Promeg) za generiranje pGL3-pIGFBP3 bazičnog luciferaze reporter plazmida, i pGL3-promotor vektora (Promega) za generiranje pGL3 HBSI (II) -promoter reporterski plazmidi. Svi konstrukti su potvrđen je DNA sekvencom. Pregled

Konstrukcija plazmida Reporterski HBSS

sintetiziran smo oligonukleotida s predviđenih mjesta vezanja Hox (HBSS) u promotorskim regijama IGFBP3. HBS3 (-1700 ~ -1691bp), HBS4 (-1418 ~ -1409bp), HBS5 (-953bp ~ -944bp) i svaki s jedne točke mutant stranice (A → C), oligonukleotidi su kako slijedi: pregled

HBS3, 5'-CTCTTTTTATTA-3 'i 5'-CATGGAGAAAAATAATCTAG-3'; pregled

mutant HBS3, 5'-CTCTTTTTCTTA-3 'i 5'-CATGGAGAAAAAGAATCTAG-3'; pregled

HBS4, 5'-CATTTGCTATTA-3 'i 5'-CATGGTAAACGATAATCTAG-3'; pregled

mutant HBS4, 5'-CCTTTGCTCTTA-3 'i 5'-CATGGGAAACGAGAATCTAG-3'; pregled

HBS5, 5'-CCTTTATTATTA-3 'i 5'-CATGGGAAATAATAATCTAG-3'; pregled

mutant HBS5, 5'-CCTTTCTTCTTA-3 'i 5'-CATGGGAAAGAAGAATCTAG-3'. pregled

dvolančana HBSS se poveća otpornost i umetnut u smjeru suprotnom od transkripcije promotora pGL3 vektorom generirati Reporterski plazmidi [18]. Svi konstrukti su potvrđen je DNA sekvencom. Pregled

Cell transfekcija pregled

želucu cacner stanice (BGC823 i SGC7901) su transficirane s pcDNA3.1-HoxD10 ili pcDNA3.1 prazan vektor pomoću Fugene HD (Promega) , Za generiranje stabilne stanične linije HoxD10 nadekspresije, gore transfektirane stanice su selektirane pomoću 400 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Njemačka) tijekom još 14 dana. Za siRNA posredovane gena obaranje, BGC823 i SGC7901 stanice su transficirane negativna kontrola siRNA ili IGFBP3 ciljan siRNA (Qiagen, Hilden, Njemačka), HGC27 stanice su transficirane negativna kontrola siRNA ili HoxD10 ciljane siRNA (Genepharma, Šangaj, Kina) koristeći Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen). pregled

Aktivnost luciferaze Test pregled

1.0 × 10 ^{5 BGC823 i SGC7901 stanice su nasađene u 24-jažica 24 h, a zatim su transfektirane s pcDNA3.1 0.4μg praznim vektorom ili pcDNA3.1 -HoxD10, 0.04μg bazičnog pGL3 (promotor) ili prazan vektor pGL3 pIGFBP3 (HBS) -Osnovna (promotor) i 0.004μg pRL-TK vektor (Promega) koji sadrži reference za kontrolu Renilla pomoću Fugene HD [18]. Aktivnost luciferaze analizirana je dual-luciferaza sustav za testiranje reporter, nakon 48 sati prema protokolu proizvođača (Promega). Pregled}

kromatina imunotaloženje (chip) pregled

U stabilna HoxD10 prekomjerno izražen BGC823 i SGC7901 stanične linije, kromatin je imunoistaloži s HoxD10 monoklonskim antitijelima (zec, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, SAD) [19] ili normalno kunića IgG (negativna kontrola) u skladu sa Simple čip enzimska kromatina IP Kit (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , USA). Staloženi DNA ili 2% uzoraka ulaz s genomske DNA iz HEK-293T divljih stanica su povećani s Taq DNA polimeraze (Takara, Otsu, Japan) [20,21]. Četiri primera obuhvaćaju HBSS u različitim mjestima IGFBP3 promotora na sljedeći način: A1 (-2251 -2073-bp, za HBS1 i 2.), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'i 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 -1633-bp, za HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'i 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470--1364bp za HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'i 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; A4 (-1153--877bp za HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'i 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'. Pregled

Reverzna transkripcija-PCR pregled

Ukupna RNA izolirana je s Trizol reagens (Cwbiotech, Peking, Kina). Reverzna transkripcija (RT) -PCR su određene s M-MLV reverzne transkriptaze (Takara) i Taq DNA polimeraze. Sljedeći primeri su korišteni za amplifikaciju: pregled

GAPDH, 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'i 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'i 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'i 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3'; pregled

MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'i 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3'; pregled

MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'i 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3'; pregled

MMP9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'i 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3'; pregled

MMP14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'i 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3'; pregled

tkivni inhibitor metaloproteinaze-1 (TIMP1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'i 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 '; pregled

TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'i 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3'; pregled

uPA, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'i 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; uPAR, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'i 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'. pregled

Western hibridizacije pregled

Ukupno bjelančevina su ekstrahirana korištenjem RIPA puferom za analizu (Beyotime, Haimen, Kina). Triton X-100 pufera je upotrijebljena za ekstrakciju topljivog E-kadherina i ß-katenina, SDS pufera je upotrijebljena za ekstrakciju netopljivi E-kadherina /ß-katenina kompleks [22]. Lizati su razdvojeni na SDS-PAGE gelu i prenese u PVDF membrane (Millipore, Bedford, SAD). Mrlje su obilježeni sa HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), E-kadherina (1: 1000, stanično signaliziranje Technology Inc), ß-katenina ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) ili GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) antitijela. Mrlje su vizualizirani pomoću kemiluminiscenciju s Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Tokyo, Japan). Relativne gustoće proteina kvantificirane su sa slike J. softvera i normalizirani za GAPDH [20]. Pregled

zacjeljivanja rana testu

BGC823 i SGC7901 stanice su transfektirane s IGFBP3 siRNA ili kontrolirati negativne siRNA u šest jamica i zatim grebe vrhom pipete P10 za stvaranje otvora. Jažice su isprane s PBS-om radi uklanjanja raseljeni stanice i svježi medij (1% FBS BGC823 i bez seruma za SGC7901) je dodan. Tri su randomizirane slike iz izgreben područjima su uzeti (× 40 uvećanja) tijekom 0h, 12h i 24h [23]. Pregled

Transwell migraciju i invaziju testovi pregled

migracije stanice i invaziju su ocijenjeni od strane modificiranog Boyden transjažičnih komora (Corning Inc, Corning, SAD), obložena (za invaziju) ili bez (za migracije) Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, SAD). siRNA transfekcije i glad stanice su stavljene na gornjoj komori u mediju za kulturu koji sadrži 1% FBS (BGC823) ili bez FBS (SGC7901), medij koji sadrži 15% FBS je dodano u donjoj komori, stanice u gornjoj komori pažljivo se ukloni nakon inkubacije 16 sati (za migracije) ili 36 sati (za invaziju). Premješten stanice su obojene 0.5μg /ml DAPI bojenje Solution (Roche, Penzberg, Njemačka). Stanične brojevi su nasumce broje u pet područja (× 400 ×) [24]. Invaziju stanice su inkubirane sa Cell Stain Solution (Millipore) i fotografirani (× 200). Boja smjesa isprana ekstrakcijskog pufera i prenese u 96 jažica na kolorimetrijskom mjerenju na 560nm pomoću čitača mikroposuda (Thermo, Boston, USA) [25,26]. Pregled

Pacijenti i uzorci pregled

86 kirurgije pacijenata želučanog adenokarcinoma su upisani od svibnja 2007. do veljače 2008. godine, nakon potpisivanja informirani pristanak. Ova studija je odobren od strane kliničkih istraživanja Etičkog povjerenstva Sir Run Run Shaw bolnici Sveučilišta Zhejiang. dobiveni su podudarni tumorskih tkiva i susjedna tkiva tumor-free. Pacijenata kliničkopatološkim podaci, uključujući spol, dob, TNM stadija i patoloških ocjenama preuzeti su iz medicinske dokumentacije. Follow-up je provedeno na 1-godišnjeg intervala je nakon operacije, medicinska povijest zabilježeno kada je pacijent došao sljedećem posjetu. Follow-up vrijeme gušeći je kolovoz 2012. godine, a medijan praćenja put je bio 35 mjeseci (raspon, 1-63 mjesec). pregled

tkiva mikropostrojima i imunohistokemijska bojanja pregled

Tuljci za mjerenje 1.5mm u najvećoj dimenziji se uguraju od ne-nekrotične područja podudaraju tumorskih tkiva i susjedna tkiva bez tumora. Tkivo microarray slajdova koji sadrže 4 uM debele Microarray dijelove konstruirane su uporabom standardnih tehnika (u suradnji sa Shanghai Superchip Company, Ltd., Šangaj, Kina). Rezovi su inkubirani s IGFBP3 protutijelom (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) preko noći na 4 ° C, a zatim su inkubirane sa sustavom isplanirati plus detekcije (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Kopenhagen, Danmark). Sekcije su razvijene u 3,3'-diaminobenzidin otopini mikroskopskim opažanjima, uz kontrastnu boju hematoksilin [27]. Tkiva uznapredovalog karcinoma dojke obojene su kao pozitivna kontrola [28]. Udio pozitivnih stanica u svakom uzorku je kvantificirana pod mikroskopom i podijeljeni u četiri skupine. 0: 0-5% pozitivnih stanica; 1: 6% do 50% pozitivne stanice; 2: 51% do 75% pozitivne stanice i 3: 76-100% pozitivne stanice. Intenzitet bojenja IGFBP3 ocijenjena je kako slijedi: bez bojanja = 0; slabo obojenje = 1; umjereno obojenje = 2; Gusta bojenje = 3. ocjena intenziteta plus udjela pozitivno se definira kao IGFBP3 bojenja rezultat. Rezultat od 0-3 se smatra niskom izražavanja i 4-9 kao visoku ekspresiju. pregled

Statistička analiza pregled

diferencijal izraz IGFBP3 između tumorskog tkiva i ne-tumorskog tkiva određena je Mann-Whitney U-test. Hi-kvadrat test je korišten za analizu odnosa između kliničkopatološkim mogućnosti i IGFBP3 bojenja rezultate. Vjerojatnost ukupnog preživljavanja je izračunata sa Kaplan-Meier metodi, a razlika između krivulja je ocijenjena sa log-rank testa. Porama p < 0,05 smatrana je statistički značajna pregled

Rezultati

HoxD10 regulira povišenje izraz IGFBP3 pregled

Genome-širok analiza pokazala je da više gena, uključujući IGFBP3 su regulirani. by HoxD10 u želučanih stanica raka u našoj prethodnoj studiji (4). Da bi se utvrdilo da li HoxD10 prepisivanje može regulirati izražavanje IGFBP3 u želučanih stanica raka, gledali smo razinu ekspresije IGFBP3 nakon stabilno uvođenja HoxD10 gen u BGC823 i SGC7901 stanica, ili prolazno rušeći od HoxD10 u HGC27 stanica. RT-PCR i Western blotting rezultate dosljedno pokazuju da je ekspresija IGFBP3 znatno reguliran u HoxD10 prekomjerno stanica (Slika 1A i 1B), a nakon što je podreguliran odsutnost HoxD10 u HGC27 stanicama (Slika 1C i 1D). Pregled

2.3 kb sekvenca (-2282 do +56 bp) na gornjem dijelu IGFBP3 je klonirana u pGL3-Basic vektor i korišteni za procjenu aktivnosti luciferaze od dual-luciferase reporter testovima. Rezultati su pokazali da je IGFBP3 promotor aktivnost BGC823 i SGC7901 stanicama je povećana 4.2 i 3.8 pregiba odnosno nakon ko-transficirane s pcDNA3.1-HoxD10 odnosu pCDNA3.1 vektor transfektanata (p < 0.01, Slika 1E). Uzeti zajedno, ovi podaci predložio da HoxD10 prepisivanje može povećanju ekspresije IGFBP3 u želučanim stanicama raka. Pregled

Identifikacija novih regulatornih regija u IGFBP3 promotor odgovornim za HoxD10 Netlogu

Sljedeći analiziraju potencijalni HoxD10 vezna mjesta u IGFBP3 promotora. 2.3 kb uzvodno slijed IGFBP3 gen unosi u PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), program za predviđanje faktora transkripcije vezna mjesta u jednom slijedu, ili u grupi povezanih sekvenci (17 ), i 5 potencijalnih obvezujuća HoxD10 stranice (HBS1 ~ 5) su predviđeni (Tablica S1). Kao što je prikazano na Slici 2A, te pet HBSS su lokalizirani na -2191--2182bp (HBS1) -2111--2102bp (HBS2) -1700--1691bp (HBS3) -1418--1409bp (HBS4) i -953 --944bp (HBS5), respektivno. U stabilna HoxD10 prekomjerno izražen BGC823 i SGC7901 stanica, vezanje na regije IGFBP3 promotora istražena je čip testovima. Utvrdili smo da kromatin istaloži HoxD10 specifičnog antitijela pojačava se A2, A3 i A4 primera koji obuhvaćaju HBS3, HBS4 i HBS5 respektivno, dok ne pojačanje opažena s A1 klicama obuhvaća HBS1 i 2 (Slika 2B). pregled

Da bi dobili dalje u regulatornim segmentima IGFBP3 promotora HoxD10, klonirali smo 2 različita DNK fragmente, koji obuhvaćaju HBSI (HBS1 i 2) i HBSII (HBS3, 4 i 5), odnosno, u SV40 promotor luciferaza novinari. Rezultati su pokazali da su ko-transficirane s HoxD10, HBSII poboljšanu aktivnost promotora SV40 4,0 puta u usporedbi s onima prazan vektor transfektanata u BGC823 stanica (P < 0.01, slika 3A). Nasuprot tome, HBSI ne pokazuje značajan učinak na aktivnost SV40 promotorski (slika 3A). Slični rezultati su objavljeni u drugim neovisnim SGC7901 stanica, promjene aktivnosti SV40 promotora su 3,3 i 0,9 puta po HBSII i HBSI, odnosno (Slika S1A u File S1). pregled

HBS3, 4. i 5. dijeli zajednički obvezujući element "TTAT", dok HBS1 ili HBS2 imati nijedan od tih elemenata. Mi hipotezu da HoxD10 direktno veže na promotor IGFBP3 na "TTAT" mjesta. Da biste to potvrdili, sintetizirali smo 10bp oligonukleotide koji sadrže nizove HBS3, HBS4 i HBS5 respektivno. Kao što je prikazano na slici 3B, promotor aktivnosti SV40 je pojačana 1,8, 2,0, i 2,7 nabora, odnosno kada se ko-transfektirane sa plazmidom HoxD10 u BGC823 stanicama, a točka mutanti HBS3, HBS4 i HBS5 ne pokazuju značajne promjene. reproducirati smo slične rezultate u SGC7901 stanica (Slika S1B u File S1).

Zajedno, Gornji rezultati pokazuju da IGFBP3 je izravna meta HoxD10 u želučanim stanicama raka. identificirali smo tri funkcionalne vezovi mjesta između -1727 ~ -943bp u uzvodno od IGFBP3 gena odgovornog za HoxD10. HoxD10 može izravno vezati promotor IGFBP3 moguće kroz Hox veznog elementa "TTAT". pregled

IGFBP3 se regulirani kod raka želuca, a koji se odnose na pacijenta prognozu Netlogu

Da bi se odredilo izlučivanje uzorak IGFBP3 kod raka želuca, 86-par kirurških primjerci ljudskog karcinoma želuca i prema susjedni noncancerous želuca tkiva su pregledana. Intenzitet IGFBP3 bojenja je postigao što je 0 (negativna), 1 (slabo), 2 (umjerena) ili 3 (gusta), kao što je određeno samostalno dva patologa (Slika S2 u File S1). Rezultati su pokazali da je razina ekspresije IGFBP3 u tumorskim tkivima bio značajno niži nego u susjedna tkiva bez tumora (p 0,001, Slika 4A i 4B). Nadalje, IGFBP3 izraz je procijenjena s obzirom na kliničkopatološkim karakteristikama bolesnika. IGFBP3 izraz bio značajno niži u želučanom tumorom limfnih čvorova metastaze (p = 0,045). Osim toga, visoka IGFBP3 izraz u male veličine tumora (T1 + T2, 8/12) je češće uočeno odnosu na onaj u one velike (T3 + T4, 36/74), iako bez značajne razlike (p = 0,062) , Tu je također značajna korelacija između ekspresije IGFBP3 i kliničkopatološkim značajki, uključujući spol, dob i patoloških razred (Tablica 1).
IGFBP3 imunološko intenzitet
kliničkoj klasifikaciji pregled ukupnog broja pregled, Low (broj)
visok (broj)
p value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Spol, dob i kliničkopatološkim karakteristike i imunohistokemijski rezultati uzoraka želučane tumorskog tkiva.
CSV Preuzimanje CSV

detaljnije analizirati korelaciju između ekspresije IGFBP3 i ukupno preživljavanje raka želuca pacijenata. Viši izraz IGFBP3 je bio povezan s duljim vremenom preživljavanja u 5 godina praćenja (p = 0,011, Kaplan-Meier opstanak Log-rank test) (Slika 4C). Pregled

obaranje IGFBP3 gena potiče želučane stanice raka migracija i invazija pregled

Kako bi se procijenila funkcionalnu ulogu IGFBP3 kod raka želuca, istražili smo migraciju stanica i invaziju nakon knockdowning IGFBP3 in vitro. IGFBP3 selektivno knockdowned s RNA interferencije u BGC823 i SGC7901 stanica (Slika 5a i 5b), koja je imala relativno visoku razinu endogenog IGFBP3 u vijeću od želučanih staničnih linija (Slika S3 u File S1). Rezultati su pokazali da utišavanje ekspresije IGFBP3 znatno poboljšane migracija stanica kako u transjažična migracija testovima (Slika 5C i 5D) i ogrebotine testa (Slika S4 u File S1), u usporedbi s onim negativna kontrola siRNA. Osim toga, knockdowning IGFBP3 prikazuje znatno veću aktivnost stanične invazije u transjažična testovima (Slika 5e i 5f). pregled

IGFBP3 modulira iskaza MMP14, i uPAR pregled

Kako shvatiti moguće mehanizme kako IGFBP3 regulirati invazivnosti želučanih stanica raka, ispitali smo razine mRNA MMP2 /MMP7 /MMP9 /MMP14, TIMP1 /TIMP2, uPA i njegov receptor uPAR, od kojih su svi invazija vezane faktore, naročito u raka želuca. Nakon transfektirane sa IGFBP3 siRNA 72 sata u BGC823 i SGC7901 stanica, razina ekspresije mRNA MMP14, PA i uPAR, povećava, a nikakve značajne promjene MMP2, MMP9 MMP7, ili TIMP1 /TIMP2 uočeno (Slika 6A). E-kadherina, ß-katenina i E-kadherina /ß-katenina kompleks se ekstrahiraju pomoću različitih lizati, razina imali značajnu promjenu nakon utišavanje IGFBP3 u BGC823 stanicama (Slika S5 File S1). Ovi rezultati pokazuju da IGFBP3 inhibira invaziju želučanih stanica raka kroz, barem djelomično, modulirajući izraze MMP14, i uPAR (Slika 6b). Pregled

Rasprava pregled

Hox superfamilije su skupina važnih transkripcijskih faktora koji mogu reguliraju proliferaciju i diferencijaciju stanica embronic [29,30]. Osim toga, nenormalna ekspresija Hox također igra ključnu ulogu u progresiji nekoliko tipova karcinoma [31]. Hox proteini imaju veliku nizvodno regulatorne mreže i vrše svoje funkcije uglavnom preko ovih ciljnih [5] gena. Genom-wide Analiza je provedena na zaslonu downstream gene HoxD10 tijekom razvoja kralježnice i želučanih stanica raka [4,32]. Mi i drugi su otkrili jedan gen IGFBP3 zajednički cilj, koji je izvijestio da služi kao tumor supresor [10]. pregled

Naša studija pruža prve dokaze koji pokazuju da HoxD10 direktno veže IGFBP3 promotor aktivirati ekspresiju IGFBP3 u želučanim stanicama raka. HoxD10 protein može biti primljen na specifične promotorske regije gena IGFBP3, što ukazuje da HoxD10 može izravno vezati na IGFBP3 gena. Je aktivnost luciferaze u prirodi, a ne mutant, HBS3, HBS4 ili HBS5 značajno poboljšana prekomjernom ekspresijom HoxD10, sugerirajući da HBS3 (TCTTTTTATT) HBS4 (ATTTGCTATT) i HBS5 (CTTTATTATT) su tri funkcionalne vezna mjesta HoxD10 na promotorske regije IGFBP3. Kao što se očekivalo, razina ekspresije IGFBP3 mRNA i proteina je regulirano prisilnim ekspresijom HoxD10 u različitim staničnim linijama raka želuca [4]. Istraživanja su pokazala da Hox proteini imaju neke elemente obvezujućih jezgra konsenzusa, uključujući TTAT, TAAT i TTAC [7]. Točkasta mutacija u "TTAT" u "TTCT" ili "TCTT" u "TATT" u promotorske regije IGFBP3 u ovom istraživanju pokazuju da je "TTAT" ili "TATT" su važna mjesta vezanja za HoxD10. Hox proteini mogu izravno regulira proces transkripcije daljnjih ciljanih gena kao monomera ili dimeri [33]. Budući da je nadležnost DNA-vezivanja sama Hox proteina relativno niske [34], interakcija s kofaktora kao extradenticle (EXD) /PBX i Homothorax (HTH) /Meis proteini su heterodimera ili heterotrimera su ključni za ciljanu selektivnosti Hox proteina [33, 35]. Drugi transkripcijski faktori, uključujući PTEN i p53 može regulirati ekspresiju IGFBP3 na razini transkripcije u želučanih i crijevnih stanica karcinoma [36,37]. Točne HoxD10 regulatorne mehanizme i kofaktora koji su uključeni u regulaciju IGFBP3 treba razjasniti u budućnosti. pregled

izraz IGFBP3 je regulirani u 86 želučanog adenokarcinoma tkiva u odnosu na njihove susjedne normalnim tkivima, a niska ekspresija IGFBP3 je također povezana sa naprednim limfnih čvorova metastaza, udaljenim metastazama i lošeg ukupnog preživljavanja. Naši rezultati su u skladu s prethodnom izvješću da je dobro ili umjereno-diferencirane želučani adenokarcinoma imali značajno veći postotak IGFBP3 bojanja u tumorskim tkivima od onih u siromašnim diferencirana one [38]. Osim toga, u Hipermetilacija promotora IGFBP3 često je otkriven u želučanom tumorskim tkivima [16,39,40]. Funkcionalnih IGFBP3 SNP (rs2854744 i rs2960436) određivanje visoku razinu cirkulirajućeg IGFBP3 su povezana s povoljnim prognozu pacijenata s uznapredovalim karcinomom želuca primaju kemoterapiju palijativno [41]. Međutim, druga studija pokazala je sasvim suprotno rezultate, što ukazuje da je izraz IGFBP3 bila je veća u uzorcima tumora nego u normalnoj sluznici (54 tumorskih uzoraka i 20 susjedna normalni uzorci, ne podudaraju), a pozitivni izraz IGFBP3 bio povezan s naprednim histološkom razred, limfni čvor metastaze i udaljene metastaze, bez značajnih razlika [42]. Mogućnost intratumorsko heterogenosti i upisane kriterije mogu uzrokovati različite rezultate u različitim kliničkim studijama. Velike populacije i prospektivne studije bilo je dopušteno ocjenjivati ​​potencijalnu korisnost IGFBP3 kao biomarkera napredovanja raka želuca. Pregled

Kako bi se dodatno utvrditi ulogu IGFBP3 u metastazi raka želuca, istražili smo svoju ulogu u modulaciji migracija i invazija želučanih stanica raka. Ispostavilo se da utišavanje izraz IGFBP3 dovodi do brzog ozdravljenja ogrebotina rana i povećan broj stanica koje migriraju preko bunara membrane li obložena sa ili bez Matrigel. Prethodna istraživanja uglavnom usmjerena na funkciju IGFBP3 u staničnu proliferaciju i apoptozu. Samo nekoliko studija je izvijestila da je u vezi s metastazama u EK, raka prostate i HNSCC [13-15]. Utišavanje ekspresije IGFBP3 mogao izazvati migraciju stanica, invaziju i metastaziranje u EZ [13]. IGFBP3 nokaut mužjaka miševa imali su veću učestalost plućnih metastaza i invazivnost primarnih prostate tumorskih stanica povećan tijekom 3 puta u usporedbi s onom divljeg one [14]. Adenovirusni i rekombinantni IGFBP3 inhibirana vaskularizacije i aktivnosti angiogeneze stimulaciju za HNSCC supresijom proizvodnje čimbenika rasta vaskularnog endotela (VEGF) [15]. Migraciju i invaziju olakšano brojnim čimbenicima koji mogu inducirati epitela-mezenhimalnih prijelaza (EMT), kao što je E-kadherina, ß-katenina i čimbenika razgradnju izvanstaničnog matriksa, uključujući MMP, uPA i tako dalje [43]. U stanicama EZ, siRNA IGFBP3 ciljanje povećava ekspresiju MMP2 [13].

• PLoS ONE: cisplatin ili ne u naprednom rak želuca: sustavni pregled i meta-Analysis
• PLoS ONE: Optimalno trajanje fluorouracil-Based adjuvantne kemoterapije za pacijente s resekcijom želuca Cancer