Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Национальная программа фундаментальных исследований Китая (973 программа) (2012CB945004) (www.973.gov .cn) и исследовательский фонд докторской программы высшего образования Китая (20100101110126) (www.cutech.edu.cn/cn/kyjj~~HEAD=pobj). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее частым раком и в настоящее время является второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. Почти половина желудочных больных CANER уже продвинулись на поздней стадии с лимфатической или отдаленными метастазами при постановке диагноза и теряют возможность хирургического вмешательства [2]. Эти пациенты имеют неблагоприятный исход и выживаемость пятилетняя для тех, кто с отдаленными метастазами составляет менее 5% [3]. Прогрессирование рака желудка считается многостадийным процессом, который включает в себя активацию онкогенов и инактивации генов-супрессоров опухолей. Ранее мы представили, что Гомеобоксный D10 (HoxD10) служил в качестве супрессора опухоли путем подавления роста опухоли и инвазии, который эпигенетически глушителем в раке желудка [4].
<р> ген HoxD10 принадлежит к гомеобоксного надсемейства, какие факторы транскрипции кодируют и оказывают функции в основном за счет активации или репрессии вниз по течению генов-мишеней [5]. Амино-концевое плечо гомеодомена Нох имеет несколько основных консенсусных связывания элементов, включая TTAT, TAAT и TTAC [6,7]. Например, Hoxc8 связывается в промоторной области этих элементов и модулирует транскрипционные деятельность PEDF, NCAM, Zac1, OPN и Cdh11, как определено высокой на протяжении хроматин иммунопреципитации и глобальной Hoxc8 ДНК-связывающего анализа сайта [7]. Исследования показали, что HoxD10 ингибирует ангиогенез и подвижность клеток в раке эндометрия (EC) [8] и ухудшает клеточную инвазивность желудка и рака молочной железы [4,9]. Тем не менее, мало известно о механизмах, как HoxD10 проявляет свои функции в прогрессии канцерогенеза и опухоли. Мы систематически проводили скрининг потенциальных целей HoxD10 с помощью кДНК микрочипов и идентифицированы несколько генов, в том числе инсулин-подобный фактор роста связывающий белок-3 (IGFBP3), которые могут быть ответственны за эффект подавления опухоли в HoxD10 при раке желудка [4].
<р> IGFBP3 является одним из основных видов IGFBP в обращении, связывание более 75% циркулирующих роста инсулина фактор-I (IGF-I) [10]. Он может ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать апоптоз клеток нескольких видов рака, в том числе простаты и рака желудка [11,12]. Несколько исследований подтвердили, что IGFBP3 подавляет инвазивность рака эндометрия (EC) клетки [13], метастазирование при раке предстательной железы [14], а также кровеносных сосудов головы и шеи плоскоклеточный рак (ПРГШ) [15]. Было принято считать, что IGFBP3 может блокировать область связывания ИФР-I на его рецептора IGF-IR, таким образом отменить эффект ИФР /ИФР-IR оси. Кроме того, зависимость ИФР /оси ИФР-IR, существует альтернативных ИФР /IGF-IR независимые и ядерную транслокацию пути [10]. Многие факторы были выяснены, чтобы регулировать экспрессию IGFBP3, в том числе ретиноевой кислоты, фактор некроза опухоли-альфа, трихостатин А, Хвостовой типа гомеобоксного 2 (CDX2) и статуса метилирования себя [10,16]. Наши предыдущие исследования показали, что IGFBP3 был в AGS повышающей регуляции и MKN28 клеток гиперэкспрессией HoxD10 [4]. Учитывая промоторную область IGFBP3 имеет несколько потенциальных сайтов связывания HoxD10, предсказанный PROMO, программа для предсказания сайтов связывания транскрипционных факторов [17], HoxD10 может непосредственно взаимодействие с IGFBP3 в регуляции клеток желудка вторжения. Выяснение этой сети обеспечит более полное представление о роли IGFBP3 при раке желудка.
<р> В настоящем исследовании, мы определили, что HoxD10 может напрямую связать промоторные регионы IGFBP3 потенциально через элемент TTAT, таким образом транскрипционно регулирует свое выражение в развитии рака желудка. Кроме того, уровень экспрессии IGFBP3 часто подавляются в желудочном раковых тканей и связаны с общей выживаемости, предполагая, что IGFBP3 играет важную роль в прогрессировании рака желудка. Функционально, IGFBP3 может подавить миграцию и инвазии клеток рака желудка, по крайней мере частично, путем регулирования этих инвазивных факторов, в том числе металлопротеиназы-14 (ММР14) и активатора плазминогена урокиназы типа (УАП).
Клеточная культура
<р> Восемь желудка линий раковых клеток (AGS, MKN28, MKN45, NCI-N87, BGC823, HGC27, MGC803 и SGC7901) были получены из банка генов Riken (Цукуба, Япония) и американской коллекции типовых культур (Manassas, США). Одна доброкачественных желудка клеточная линия (GES-1) был получен из Пекинского института по исследованию рака (Пекин, Китай). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (фирма Invitrogen, Carlsbad, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Sijiqing, Хучжоу, Китай), и инкубировали при 5% CO <суб> 2, 37 ° С и 95% влажности.
Строительство IGFBP3 люциферазы плазмид
<р> Три различных фрагментов в области промотора IGFBP3, в том числе -2282 до +56 б.п. (2,3 кб, pIGFBP3), -2251 ~ -2073 п.о. (HoxD10 сайт связывания I, HBSI) и -1727 ~ -943 пар оснований (HBSII), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из НЕК-293Т диких клеток в качестве матрицы. HBSI охватывает HBS1 и 2, HBSII содержит от HBS3, 4 и 5, в котором HBS1-5 предсказываются PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) [17]. Последовательности праймеров HBS были следующими: pIGFBP3, 5'-GGGGTACCCTGGACGCCTGGAGCTTT-3 'и 5'-GAAGATCTAGCAGCACCAGCAGAGTC-3'; HBSI, 5'-GGGGTACCCATTCGGCACTGAACAAG-3 'и 5'-GAAGATCTAGCCTGGACTGACCACTG-3'; HBSII, 5'-GGGGTACCGGCACTCCATTGTTCTT-3 'и 5'-GAAGATCTGAATAATAAAGACAATAAACTGG-3'. Фрагменты ПЦР лигировали в PGm-T вектора (Tiangen, Пекин, Китай), переваривают с KpnI /BgIII (Promega, Мэдисон, США), а затем субклонировали в сайты KpnI /BgIII в pGL3 основного вектора (Promeg) для генерации pGL3-pIGFBP3 основного люциферазы плазмидами, и pGL3-промотор вектора (Promega), чтобы сгенерировать pGL3-HBSI (II) -promoter люциферазы плазмид. Все конструкции были подтверждены путем секвенирования ДНК.
Активность люциферазы анализ В стабильных HoxD10 суперэкспрессированный клеточные линии BGC823 и SGC7901, хроматин подвергали иммунопреципитации с HoxD10 моноклональных антител (кролик, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, США) [19] или нормальной кроличьей IgG (отрицательный контроль) в соответствии с простой Kit чИП Ферментативный хроматином IP (Cell Signaling Technology Inc., Дэнверз , США). Осажденные ДНК или 2% образцов входного сигнала с геномной ДНК из НЕК-293Т диких клеток амплифицировали с Taq ДНК-полимеразы (Takara, Оцу, Япония) [20,21]. Четыре праймера, включающие HBSS в разных участках IGFBP3 промотора были разработаны следующим образом: A1 (-2251 ~ -2073 пар оснований, для HBS1 и 2), 5'-CATTCGGCACTGAACAAG-3 'и 5'-AGCCTGGACTGACCACT-3'; A2 (-1765 ~ -1633 пар оснований, для HBS3,), 5'-CATAAGAAAATGACGGTGCT-3 'и 5'-TGGAAAGATCAATTTCGTTCC-3'; A3 (-1470 ~ -1364bp, для HBS4,), 5'-AAGATTAACTTCACCCAAGGC-3 'и 5'-AGGTGGATAGGTGACTTG-3'; А4 (-1153 ~ -877bp, для HBS5,), 5'-GCCGACAGGAGTTACAG-3 'и 5'-TGTTCTTCTTGTCTTGGGTA-3'. вестерн-блоттинга Всего белки извлекали с помощью РИПО буфера для лизиса (Beyotime, Haimen, Китай). Тритон Х-100 буфера для лизиса был использован для извлечения растворимого Е-кадгерина и SS-катенин, SDS буфера для лизиса был использован для извлечения нерастворимый Е-кадгерин /бета-катенин комплекса [22]. Лизаты были разрешены на SDS-PAGE геле и переносили на мембраны ПВДФ (Millipore, Bedford, USA). Блоты зондировали с использованием HoxD10 (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.), IGFBP3 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology Inc.), Е-кадгерин (1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.), бета-катенина ( 1: 1000, Cell Signaling Technology Inc.) или GAPDH (1: 2500, Cwbiotech) антител. Блот визуализировали с помощью хемилюминесценции с Лас-4000 Система обработки изображений (Fujifilm, Токио, Япония). Относительные плотности белков были определены количественно с изображением J. программного обеспечения и нормированы на GAPDH [20]. Ткань микрочипов и иммуногистохимическое окрашивание Статистический анализ Результаты HoxD10 повышает экспрессию IGFBP3 IGFBP3 подавляется при раке желудка и связанных с прогнозом Для того, чтобы определить характер экспрессии IGFBP3 при раке желудка, 86-парные хирургические образцы рака желудка человека и по смежную доброкачественное желудка ткани были исследованы. Интенсивность IGFBP3 окрашивания оценивали как 0 (отрицательный), 1 (слабое), 2 (умеренное), или 3 (плотным), как определено независимо друг от друга двумя патологи (рис S2 в Файл S1). Результаты показали, что уровень экспрессии IGFBP3 в опухолевых тканях была значительно ниже, чем в соседних без опухолей тканей (р &ЛТ; 0,001, рис 4А и 4Б). Кроме того, выражение IGFBP3 оценивали по отношению к клинико-патологическими характеристик пациентов. Выражение IGFBP3 была значительно ниже в желудочном опухоли с метастазов в лимфатических узлах (р = 0,045). Кроме того, высокая экспрессия IGFBP3 в опухолях малого размера (T1 + T2, 8/12) чаще наблюдалось относительно, что в крупных (Т3 + Т4, 36/74), хотя и без существенных различий (р = 0,062) , Там также не было значимой корреляции между экспрессией IGFBP3 и клинико-патологическими особенностями, включая пол, возраст и патологической степени (Таблица 1). IGFBP3 модулирует выражения ММР14, УАП и уАПР Для того, чтобы выяснить возможные механизмы, как IGFBP3 регулировать инвазивность клеток рака желудка, мы исследовали уровни мРНК ММР2 /MMP7 /ММР9 /ММР14, timp1 /TIMP2, уАП и его рецептор уАПР, все из которых являются инвазии, связанные с факторами, особенно при раке желудка. После того, как трансфицированы с IGFBP3 миРНК для 72h в BGC823 и SGC7901 клеток, уровни экспрессии мРНК ММР14, УАП и уАПР увеличилось, в то время как никаких существенных изменений ММР2, MMP7, ММР9 или timp1 /TIMP2 не наблюдалось (Фиг.6а). Е-кадгерин, ß-катенина и Е-кадгерин /ß-катенин комплекс были извлечены с использованием различных лизатов, их уровни не имели значимых изменений после глушителей IGFBP3 в BGC823 клетках (Рисунок S5 в файле S1). Эти результаты показали, что IGFBP3 ингибирует инвазию клеток рака желудка через, по меньшей мере, частично, модулируя выражения ММР14, УАП и уАПР (рисунок 6б).
<р> 1,0 × 10 5 BGC823 и SGC7901 клетки высевали в 24-луночные планшеты в течение 24 ч, затем трансфицируют с 0,4 мкг pcDNA3.1 пустым вектором или пкДНК3.1 -HoxD10, 0.04μg pGL3 основного (промотор) или пустой вектор pGL3-pIGFBP3 (HBS) -базисной (промотор), и 0.004μg ПРЛ-TK вектор (Promega), содержащий контрольную величину рениллы с использованием Fugene HD [18]. Активность люциферазы анализировали с помощью двойной люциферазы системы анализа репортер после 48h в соответствии с протоколами производителя (Promega).
иммунопреципитации хроматина (ЧИП)
с обратной транскрипцией PCR
<р> Общую РНК выделяли с Trizol реагент (Cwbiotech, Пекин, Китай). Обратной транскрипции (RT) -PCR определяли с M-MLV обратной транскриптазы (Takara) и Taq ДНК-полимеразы. Следующие праймеры использовали для амплификации:
<р> GAPDH, 5'- GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 'и 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; HOXD10, 5'-AAAGTCTCCCAGGTGGAGAG-3 'и 5'-TGCTGGTTGGTGTATCAGAC-3'; IGFBP3, 5'-CCAAGCGGGAGACAGAAT-3 'и 5'-CTTTGGAAGGGCGACACT-3';
<р> MMP2, 5'-ACGACCGCGACAAGAAGTAT-3 'и 5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3';
<р> MMP7, 5'-GGTATGGGACATTCCTCTGA-3 'и 5'-TGTTCTGCCTGAAGTTTCTATT-3';
<р> ММР9, 5'-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3 'и 5'-GCACTGAGGAATGATCTAAGC-3';
<р> ММР14, 5'-GGCGGGTGAGGAATAAC-3 'и 5'-AGCATCAATCTTGTCGGTAG-3';
<р> тканевый ингибитор металлопротеиназы-1 (timp1), 5'-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3 'и 5' -GGTATAAGGTGGTCTGGTTGACT-3 ';
<р> TIMP2, 5'-AAGCGGTCAGTGAGAAGGAA-3 'и 5'-TCTCAGGCCCTTTGAACATC-3';
<р> УАП, 5'-CTCATCCTACACAAGGACTAC-3 'и 5'-CAGGCAGATGGTCTGTATAGT-3'; уАПР, 5'-ATTCCCGAAGCCGTTAC-3 'и 5'-GTTGCATTTGGTGGTGTT-3'.
ранозаживляющие анализа
<р> BGC823 и SGC7901 клетки трансфицировали IGFBP3 миРНК или контролировать отрицательный миРНК в шесть луночные планшеты и затем почесал кончиком пипетки p10, чтобы создать зазор. Лунки промывали PBS для удаления клеток и перемещенными новыми питательными средами (1% FBS для BGC823 и не содержащей сыворотки для SGC7901) добавляли. Три рандомизированные образы поцарапанных областей были взяты (× 40 увеличении) над 0h, 12h и 24h [23].
миграции и инвазии анализы Transwell
<р> Миграция клеток и вторжения были оценены по модифицированной Бойден Transwell камеры (Corning Inc., Corning, США), с покрытием (для вторжения) или без (для миграции) Матригель (BD Biosciences, Franklin Lakes, США). Трансфекция и голодание клетки миРНК высевали в верхней камере в культуральной среде, содержащей 1% FBS (BGC823) или без FBS (SGC7901), средой, содержащей 15% FBS, добавляли в нижнюю камеру, клетки в верхней камере были тщательно удалены после инкубации в течение 16 часов (для миграции) или 36h (для вторжения). Перенесенные клетки окрашивают 0,5 мкг /мл DAPI Окрашивание раствора (Roche, Пенцберг, Германия). Числа клеток были случайным образом подсчитывали в пяти областях (× 400-кратное увеличение) [24]. Захвачена клетки инкубировали с сотового Stain раствором (Millipore) и фотографировали (× 200). Смесь краситель промывают путем экстракции буфера и переносили в 96-луночный для колориметрических измерений при 560 нм в ридере для микропланшетов (Thermo, Бостон, США) [25,26].
Пациенты и образцы
<р> 86 хирургии пациентов аденокарциномы желудка были зарегистрированы в период с мая 2007 года по февраль 2008 года после подписания информированного согласия. Это исследование было одобрено Клинические исследования комитетом по этике сэра Run Run Shaw больницы Zhejiang University путем. были получены наборные ткани опухоли и прилегающих к ним без опухоли тканей. Данные клинико-патологических Пациентов, включая пол, возраст, TNM стадий и патологических сортов были получены из медицинских записей. Последующая деятельность по итогам проводили с интервалом 1 год после операции, история болезни была записана, когда пациент пришел для последующего визита. Последующий время обрезания был август 2012 г., а средний срок наблюдения составил 35 месяцев (диапазон, 1-63 месяц).
<р> Сердечники измерения 1.5mm в наибольшем измерении штамповали из не некротических областей подобранных тканей опухоли и прилегающих к ним без опухолей тканей. Ткань микрочипов слайды, содержащие 4 мкм толстые секции микрочипов были построены с использованием стандартных методов (в сотрудничестве с Shanghai Superchip Company, Ltd., Шанхай, Китай). Срезы инкубировали с IGFBP3 антителом (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc.) в течение ночи при температуре 4 ° С, а затем инкубировали с Envision-плюс система обнаружения (EnVision ™ + /HRP /Rb, Dako, Копенгаген, Дания). Срезы были разработаны в растворе 3,3'-диаминобензидина под микроскопом и контрастному окрашиванию гематоксилином [27]. Тканей распространенного рака молочной железы окрашивали в качестве положительного контроля [28]. Доля положительных клеток в каждом образце количественно под микроскопом и разделены на четыре группы. 0: 0-5% положительных клеток; 1: 6% до 50% положительных клеток; 2: 51% до 75% положительных клеток и 3: 76-100% положительных клеток. Интенсивность окрашивания IGFBP3 классифицировалось как не следует: не окрашиванию = 0; слабое окрашивание = 1; умеренное окрашивание = 2; плотное окрашивание = 3. оценка интенсивности плюс доля положительного окрашивания была определена как IGFBP3 счет окрашивания. Счет 0-3 считался низким уровнем экспрессии и 4-9, как высокий уровень экспрессии.
<р> Дифференциальная экспрессия IGFBP3 между опухолевой тканью и неопухолевой ткани определяли Манна-Уитни U-тест. Хи-квадрат тест использовали для анализа взаимосвязей между клинико-патологическими особенностями и IGFBP3 окрашивания баллов. Вероятность общей выживаемости рассчитывали с помощью метода Каплана-Мейера, а разница между кривыми оценивали с помощью теста лог-ранга. Обрезание р &ЛТ; 0,05 рассматривалось как статистически значимое
<р> общегеномных анализ показал, что множественные гены, включая IGFBP3 регулировались. путем HoxD10 в желудочном раковых клеток в нашем предыдущем исследовании (4). Для того, чтобы определить, может ли HoxD10 транскрипционно регулируют экспрессию IGFBP3 в желудочном раковых клеток, мы наблюдали уровень экспрессии IGFBP3 после того, как стабильно введения гена HoxD10 в BGC823 и SGC7901 клеток, или скоротечно сбивание HoxD10 в HGC27 клетках. ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга результаты последовательно показали, что экспрессия IGFBP3 была значительно повышающей регуляции в HoxD10 избыточно экспрессируется клетками (рис 1А и 1В), в то время как после того, как подавляются глушителей HoxD10 в HGC27 клетках (рис 1C и 1D).
<Р> последовательность 2,3 кб (-2282 до +56 б.п.) на входном области IGFBP3 был клонирован в pGL3 основного вектора и используется для оценки активности люциферазы с помощью двойного люциферазы анализов. Результаты показали, что IGFBP3 активность промотора в BGC823 и SGC7901 клеток была увеличена на 4,2 и 3,8, соответственно, после того, как складками котрансфицируют pcDNA3.1-HoxD10 относительно пкДНК3.1 вектор трансфектантов (р &ЛТ; 0,01, рис 1E). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что HoxD10 может транскрипционно апрегулируются экспрессию IGFBP3 в желудочном раковых клеток.
Выявление новых регуляторных областей в промоторе IGFBP3 ответственных за HoxD10
<р> Далее мы проанализировали потенциал HoxD10 сайты связывания в промоторе IGFBP3. 2,3 кб выше последовательность гена IGFBP3 был введен в PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/), программа для предсказания сайтов связывания транскрипционных факторов в одной последовательности или в группе родственных последовательностей (17 ), и 5 потенциальных сайтов связывания HoxD10 (HBS1 ~ 5) были предсказаны (таблица S1). Как показано на рисунке 2А, эти пять ОБД были локализованы на -2191 ~ -2182bp (HBS1), -2111 ~ -2102bp (HBS2), -1700 ~ -1691bp (HBS3), -1418 ~ -1409bp (HBS4) и -953 ~ -944bp (HBS5) соответственно. В стабильной HoxD10 избыточно экспрессируется BGC823 и SGC7901 клетки, связывание областей на IGFBP3 промотора были исследованы микросхемой анализов. Мы определили, что хроматин осаждали HoxD10 специфическим антителом, амплифицировали с использованием А2, А3 и А4 праймеры, которые охватывают HBS3, HBS4 и HBS5 соответственно, в то время как реакция амплификации не наблюдалось с A1 праймеров, охватывающих HBS1 и 2 (Фигура 2В).
<р> Для дальнейшего увеличения в регуляторных сегментов IGFBP3 промотора HoxD10, мы клонировали 2 различных фрагментов ДНК, которые охватывают HBSI (HBS1 и 2) и HBSII (HBS3, 4 и 5), соответственно, в промотор SV40 люциферазы репортеры. Результаты показали, что котрансфицируют HoxD10, HBSII усиливается SV40 промоторной активностью на 4,0 раза по сравнению с этими пустыми векторных трансфектантов в BGC823 клетках (P &л; 0,01, рис 3А). В отличие от этого, HBSI не показал значительного влияния на активность промотора SV40 (фиг.3А). Аналогичные результаты были выявлены в других независимых SGC7901 клеток, изменения активности промотора SV40 составляли 3,3 и 0,9 раза по HBSII и HBSI, соответственно (рис S1A в File S1).
<р> HBS3, 4 и 5 имеют общие связывающий элемент "TTAT", в то время как HBS1 или HBS2 не имеют ни одного из этих элементов. Мы гипотезу, что HoxD10 непосредственно связывается с промотором IGFBP3 на "TTAT" сайтов. Для того, чтобы подтвердить это, мы синтезировали 10BP олигонуклеотиды, которые содержат последовательности HBS3, HBS4 и HBS5 соответственно. Как показано на фигуре 3В, деятельность промотора SV40 были увеличены на 1,8, 2,0 и 2,7 соответственно при сгибы котрансфицируют HoxD10 плазмиды в клетках BGC823, в то время как точечные мутанты HBS3, HBS4 и HBS5 не показали каких-либо существенных изменений. Мы смоделировали аналогичные результаты в SGC7901 клетках (Рисунок s1b в файле S1).
<р> В совокупности выше результаты указывают на то, что IGFBP3 является прямой мишенью HoxD10 в желудочном раковых клеток. Мы определили три функциональные привязки сайтов между -1727 ~ -943bp в верховьях гена IGFBP3, ответственного за HoxD10. HoxD10 может непосредственно связывать промотор IGFBP3 потенциально через Hox связывающего элемента "TTAT".
пациентов
IGFBP3 иммунным интенсивность
Клиническая классификация
Общее количество
Low (число)
High (номер)
р value
Gender0.812Male633825Female231310Age(years)0.644<60271512≥60593623T0.062T1+T21248T3+T4744727N0.045N0+N1351619N2+N3513516M 0.267M0834835M1330Histological grade0.331I + II241212III623923Table 1. Пол, возраст и клинико-патологическими характеристики и результаты Иммуногистохимия образцов желудочного опухолевой ткани.
CSV Загрузить CSV <р> Кроме того, мы проанализировали корреляцию между выражением IGFBP3 и общей выживаемости рака желудка пациентов. Высшее выражение IGFBP3 было связано с более длительным временем выживания в 5 лет наблюдения (р = 0,011, Каплан-Майера выживания входа ранга тест) (Рисунок 4C).
Нокдаун гена IGFBP3 способствует клетку рака желудка миграция и инвазия
<р> Для оценки функциональной роли IGFBP3 при раке желудка, мы исследовали клеточную миграцию и инвазию после knockdowning IGFBP3 в пробирке. IGFBP3 селективно knockdowned путем РНК-интерференции в BGC823 и SGC7901 клеток (рис 5А и 5В), который имел относительную высокий уровень эндогенного IGFBP3 в панели желудочных клеточных линий (рис S3 в File S1). Результаты показали, что глушителей экспрессия IGFBP3 значительно усиливается клеточной миграции как в Transwell миграции анализах (Рисунок 5C и 5D) и тест нуля (рис S4 в File S1), когда по сравнению с отрицательной контрольной миРНК. Кроме того, knockdowning IGFBP3 продемонстрировали значительно более высокую активность клеточного вторжения в Transwell анализа (рис 5Е и 5F).
Обсуждение
<р> Нох надсемейства являются группа важных факторов транскрипции, которые могли бы регулировать пролиферацию и дифференцировку клеток embronic [29,30]. Кроме того, аберрантная экспрессия гена Hox также играет решающую роль в прогрессировании нескольких типов раковых заболеваний [31]. Нох белки имеют большое вниз по течению регуляторную сеть и осуществляют свои функции, в основном, с помощью этих генов-мишеней [5]. Генома анализ был проведен на экран вниз по течению гены HoxD10 во время развития спинного мозга и в клетках рака желудка [4,32]. Мы и другие показали один ген IGFBP3 общая цель, о котором сообщалось в качестве супрессора опухоли [10].
<р> Наши исследования послужили первые доказательства того, чтобы показать, что HoxD10 непосредственно связывает промотор IGFBP3, чтобы активировать экспрессию IGFBP3 в желудочном раковых клеток. HoxD10 белок может быть набраны к конкретному промоторной области гена IGFBP3, указывая, что HoxD10 может напрямую связываться с геном IGFBP3. Активность люциферазы с дикими, а не мутант, HBS3, HBS4 или HBS5 значительно повышается за счет избыточной экспрессии HoxD10, предполагая, что HBS3 (TCTTTTTATT), HBS4 (ATTTGCTATT) и HBS5 (CTTTATTATT) были три функциональные сайты связывания HoxD10 в промоторной области IGFBP3. Как и ожидалось, уровень экспрессии мРНК IGFBP3 и белка были активируемых принудительному экспрессии HoxD10 в различных желудочных линиях раковых клеток [4]. Исследования показали, что Hox белки имеют некоторые основные элементы консенсуса связывания, включая TTAT, TAAT и TTAC [7]. Точечную мутацию с "TTAT" к "TTCT" или "TCTT" к "Tatt" в промоторной области IGFBP3 в настоящем исследовании, свидетельствуют о том, что "TTAT" или "Tatt" являются важными сайты связывания для HoxD10. Hox белки могут непосредственно регулировать процесс транскрипции генов-мишеней вниз по течению, как мономеры или гомодимеров [33]. Поскольку ДНК-связывающим компетенция самой Нох белков является относительно низким [34], взаимодействия с кофакторами как экстрадентикль (Exd) /Pbx и Homothorax (НТН) /Meis белки как гетеродимеров или гетеротримеры имеют решающее значение для целевой селективности Hox белков [33, 35]. Другие факторы транскрипции, в том числе PTEN и p53 может регулировать экспрессию IGFBP3 на транскрипционном уровне в желудочном и ободочной клетках карциномы [36,37]. Точные механизмы регулирования HoxD10 и кофакторов, участвующих в регуляции IGFBP3 необходимо уточнить в будущем.
<р> Выражение IGFBP3 была подавлена в 86 тканях желудка аденокарциномы относительно прилегающих к ним нормальных тканей, и низкая экспрессия IGFBP3 также коррелируют с усовершенствованным метастазов в лимфатических узлах, отдаленных метастазов и плохой общей выживаемости. Наши результаты согласуются с предыдущим докладом, что хорошо или умеренно дифференцированной аденокарциномы желудка значительно более высокий процент IGFBP3 окрашивания в опухолевых тканях, чем в бедных дифференцированных из них [38]. Кроме того, гиперметилирование в промоторе IGFBP3 часто обнаруживается в опухолевых тканях желудка [16,39,40]. Функциональные ОНП IGFBP3 (rs2854744 и rs2960436), определяющие высокую IGFBP3 циркулирующие уровни были связаны с благоприятным прогнозом у больных с распространенным раком желудка, получавших ПХТ [41]. Тем не менее, еще одно исследование показало совершенно противоположные результаты, предполагая, что экспрессия IGFBP3 в образцах опухоли была выше, чем в нормальной слизистой оболочке (54 биоптатов опухолей и 20 смежных образцов нормальной, не сопрягаемые), а также положительное выражение IGFBP3 было связано с продвинутой гистологических класс, метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов без существенной разницы [42]. Возможность внутриопухолевой неоднородности и зачисленных критериев могут вызвать различные результаты в различных клинических исследованиях. Большие группы населения и перспективные исследования позволили оценить потенциальную полезность IGFBP3 в качестве биомаркеров прогрессирования рака желудка.
<Р> Для дальнейшего определения роли IGFBP3 в метастазирования рака желудка, мы оценивали его роль в модуляции миграции и инвазии клеток рака желудка. Оказалось, что глушителей выражение IGFBP3 привело к быстрому заживлению раны нуля и увеличение числа клеток, мигрирующих через мембрану Transwell ли с покрытием или без Матригель. Предыдущие исследования в основном сосредоточены на функции IGFBP3 в клеточной пролиферации и апоптоза. Только несколько исследований сообщили, что было связано с метастазами в ЕС, рака простаты и ПРГШ [13-15]. Глушащий экспрессию IGFBP3 может вызвать миграцию клеток, инвазию и метастазирование в ЕС [13]. IGFBP3 нокаута мышей-самцов имели более высокую частоту метастазов в легких и инвазивность первичных опухолевых клеток простаты был увеличен более чем в 3 раза по сравнению с тем из дикими [14]. Аденовируса и рекомбинантного IGFBP3 тормозится васкуляризации и ангиогенеза-стимулирующий деятельность ПРГШ, подавляя выработку эндотелиального фактора роста сосудистого (VEGF) [15]. Миграция и инвазии способствует ряд факторов, способных индуцировать эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT), как Е-кадгерина, ß-катенина и факторов, разрушающих внеклеточный матрикс, включая ММР, УАП и так далее [43]. В клетках ЕС, миРНК ориентации IGFBP3 повышает экспрессию ММР2 [13].
Растительные диеты улучшают здоровье сердца за счет микробиома кишечника
Люди с симптомами СРК могут иметь низкий уровень витамина D,
Исследователи нашли новый способ защиты от болезней в модели рассеянного склероза.
Дисбиоз микробиоты кишечника может вызвать тяжелую вторичную инфекцию у пациентов с COVID-19
Ксилит и экстракт семян грейпфрута обещают предотвратить заражение SARS-CoV-2,
Микробиом человека сокращает гликаны слизистых оболочек,
Чистящие средства могут повысить риск детской астмы - результаты исследования
Согласно новому исследованию исследователей факультета медицинских наук Университета Саймона Фрейзера (SFU), Воздействие бытовых чистящих средств в младенчестве может повысить риск детской астмы у дет
Микробы легких могут помочь предсказать исходы у тяжелобольных
Новое исследование, опубликованное в Американский журнал респираторной медицины и реанимации показывает, что регистрация того, как организмы, живущие в легких, меняются по типу и количеству, может о
Кишечные бактерии связаны с метаболическими изменениями и аутизмом в новом исследовании
Исследователи из Калифорнийского технологического института сделали важное открытие, которое может объяснить, как кишечные бактерии могут способствовать поведению, схожему с аутизмом. Команда обнару