PLoS ONE: VEZT, romano spėjamas auglio slopinamojo, slopina augimo ir tumorogeniš- skrandžio Cancer

Anotacija

Vezatin (VEZT), taigi adherens sankryžos transmembraninis baltymas, buvo įvardyta kaip spėjamą naviko slopintuvas mūsų ankstesniuose tyrimas. Tačiau VEZT vaidmuo Tumorigenesis išlieka silpnas. Siekėme išsiaiškinti savo epigenetinius reguliavimą ir biologines funkcijas skrandžio vėžio. Šiame tyrime mes parodome, kad pasakymas lygis VEZT dalyvauja limfinės metastazių, gylis vėžio invazijos ir TNM etape 104 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Bisulfatu sekos polimerazės grandininė reakcija (BSP) metodai parodė, kad VEZT buvo hypermethylated audiniuose ir skrandžio vėžiu sergančių pacientų, palyginti su sveikų atitinkamu kraujo. Helicobacter pylori
( h. Pylori
) infekcija sukelia metilinimo ir nutildymo iš VEZT į GES-1 ląstelių. Atkurti VEZT išraišką MKN-45 ir NVI-N87 skrandžio vėžio ląstelių slopinamas augimas, invazija ir Tumorigenesis , in vitro ir in vivo,
. Pasaulinis Mikrogardelė analizė buvo taikoma analizuoti molekulinė pagrindo biologinių funkcijų VEZT po VEZT transfekciją kartu su realaus laiko PGR ir chromatino imunoprecipitaciją tyrimu. G baltymu sujungtas receptorius 56 (GPR56), ląstelių augimą, ląstelių dalijimąsi ciklas 42 (CDC42), migracija /invazija ir transkripcijos faktorius 19 (TCF19), ląstelės ciklo progresavimo buvo nustatyta tiesioginė VEZT tikslinių genų. TCF19, romanas tikslas VEZT buvo funkciškai patvirtintas. Padidėjusi TCF19 į MKN-45 ląstelių padidintą ląstelių ciklo eigą ir augimo galimybes. Šis tyrimas suteikia romaną pažvelgti į VEZT genų reguliavimo, kuris galėtų atstovauti galimą tikslą naudoti terapijoje priešvėžinių strategijas

nurodomoji dalis:. Miao R Guo X Zhi Klausimas Shi Y Li L Mao X, ir kt. (2013) VEZT, romano spėjamas auglio slopinamojo, slopina augimo ir tumorogeniš- skrandžio vėžio. PLoS ONE 8 (9): e74409. Doi: 10,1371 /journal.pone.0074409

redaktorius: Masaru Katoh, Nacionalinis vėžio centras, Japonija

Įstojo: balandžio 1, 2013; Priimtas rugpjūčio 1, 2013 m Paskelbta rugsėjo 17, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Miao ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas buvo iš dalies remiamą dotacijų iš Nacionalinės jaunatvišką mokslo fondo Kinijos (81101858), Gamtos mokslo fondas Shandong provincijos Kinijoje (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), pagrindinių mokslinių tyrimų projektas, Shandong mokslo ir technologijų komisijos (2011GGB14158, 2007H2071) jaunatviškas mokslo fondas Shandong provincijos Kinijoje (BS2010YY060). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vyrų vėžio susijusių mirčių ir trečioji pagrindinė priežastis, dėl moterų vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. Tai yra pagrindinė visuomenės sveikatos problema visame [2] pasaulyje. Kinijoje, yra 400000 naujų atvejų skrandžio vėžio ir 300.000 mirčių per metus. Daugeliu atvejų, kurie nukentėjo nuo skrandžio vėžio neteko gydomasis galimybę su labai prasta rezultatus [3]. Todėl, kuriant naujus ir efektyvius terapinio metodus būtina sumažinti skrandžio vėžiu mirštamumą. Ji buvo žinoma, kad skrandžio karcinomos patogenezę yra daugiafaktorialinis, kuri apima genetinį polinkį ir aplinkos veiksnius. Yra genetinių alternations įskaitant naviko slopintuvas genų, onkogenų, ląstelių adhezijos molekulių ir augimo veiksnių [4].

Nors molekuliniai mechanizmai skrandžio kancerogenezėje lieka neaišku, epigenetinius triukšmo slopinimo naviko susijusių genų pagal promotoriaus hypermethylation skaičius neseniai tapo svarbiu mechanizmu Tumorigenesis. Projekto rengėjas hypermethylation aprašymą skiriasi kiekvienoje vėžio tipo ir kiekvienos genų, teikiant naviko tipo ir genų būdingų hypermethylation profilius, kurie gali įtraukti į atitinkamą molekulinės mechanizmo Tumorigenesis. Naujo geno nustatymas taikiniu promotoriaus hypermethylation gali suteikti įžvalgų dėl naviko-slopinančio kelius nukenksminti mechanizmų ir yra svarbus naviko žymenų nustatymo skrandžio vėžio [5,6].

Neseniai , mes nustatėme, yra adherens sankryžų transmembraninę baltymų, VEZT kandidatu naviku slopinamojo geno. Siekėme išsiaiškinti epigenetinius reguliavimą ir biologines funkcijas VEZT skrandžio vėžio. VEZT, visur neatsiejama baltymai, yra netiesiogiai susijęs su E-cad-kateninai komplekso ir aktino citoskeleto [7,8]. Jos funkcijos daugiausia buvo nagrinėjami epitelio ląstelių. Praradimas VEZT palaipsniui kenkia embriono vystymuisi [9,10], o VEZT yra labai svarbus siekiant išsaugoti korinio sankryžų vientisumą metu ilgalaikio mechaninio streso, įvykusiu ne iš vidinės ausies plaukuotųjų ląstelių lygmeniu reaguojant į garsą. Be to, vidinis ausies konkrečių VEZT sąlyga negaliojančia sukelia laipsnišką kurtumas [7]. VEZT yra labai išreikštas smegenis [8,11]. VEZT yra praturtintas dendritų spygliais pelių hipokampo neuronų. Naudojant VEZT grandininį žemyn ir sąlyginis nokautas anksčiau (D6cre) arba po (CamKIIαcre) gimimo, VEZT reguliuoja stuburo morfologiją. Morfologiniai pokyčiai nėra susiję su pažeista synaptic kontaktų, bet posinapsinius VEZT vaidina lemiamą vaidmenį morfino-funkcinis brendimo žadinančių posinapsinius elementų [12].

Inaktyvacija iš VEZT geno buvo nustatytas skrandžio vėžys, ir iš CpG salų, kaip promotoriaus regione VEZT geno metilinimas prisidėti prie jos nukenksminti, kaip nustatyta ankstesniame tyrimo, kurį atliko mūsų laboratorijoje [13]. Į tai, metilinimo mechanizmas ir tiksli vaidmuo VEZT į skrandžio vėžio išsivystymo šiuo metu yra nežinomas. dar nebuvo nustatytos tikslinės genai ir susiję keliai VEZT. Šiame tyrime mes sistemingai analizavo metilinimo ir metilinimo statuso į VEZT geno promotoriaus mechanizmą. Mes taip pat analizavo savo funkcines savybes, atkūrus VEZT išraiškos in vitro ir in vivo pervežimas.

Medžiagos ir metodai

Mobilaus ryšio linijos ir audinių mėginių

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, The įamžinta žmogaus skrandžio gleivinės ląstelių linija GES-1 (teikiama iš virškinimo chirurgijos Ruijin ligoninę susijusi Šanchajaus Jiao Tong universiteto institutas) [13,14,15,16,17] ir žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) buvo išsaugota mūsų institute. Skrandžio vėžio ląstelių linijas SNU-1 ir NVI-N87 ląstelės buvo gauta iš amerikiečių tipas Kultūros kolekcijos (Manassas, VA, USA). Trumpai, ląstelės buvo auginamos RPMI1640, papildytoje 10% serumas iš veršiuko embriono ir 2 mM L-glutamino. Ląstelės buvo palaikoma 37 ° C 5% CO _{2 akivaizdoje.}

Pagrindinis skrandžio navikas ir normalus skrandžio gleivinės audiniai buvo renkami arba iš įprastinių terapinio operacijos ar virškinimo endoskopija mūsų departamentas. Likusi dalis buvo h. pylori
infekcija statusas nustatomas remiantis greito ureazės testas kaip buvo aprašyta anksčiau [18].

Etika pareiškimas

Parašė informuotas sutikimas tyrime buvo gauti iš visų dalyvių. 4 savaičių amžiaus Vyras BALB /c nude pelėms buvo perkami iš eksperimentinių gyvūnų centras Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija) ir prižiūrimi gyvūnų laboratorija centras provincijos ligoninės kontroliuojamų Shandong University (Jinan, Kinija) ant 12/12 h šviesos /tamsos ciklas (šviesos išjungti 19: 00) su maisto ir vandens turimą adlibitum. Eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtintas Institucijų gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto prie provincijos ligoninės kontroliuojamų Shandong University (leidimo numeris: SHANS87492). Tyrimo protokolas buvo patvirtintas etikos komisijos provincijos ligoninės kontroliuojamų Shandong University.

apdorojimas Lazeriniai microdissection už audinių ir ląstelių

audiniai kuo greičiau pašalintos po rezekcijos ir nustatytas formalinas, įterptųjų parafinu ir supjaustyti 8-mkm storio sekcijas hematoksilinu ir eozinu (H & E) dėmių. Visi audiniai buvo ištiriami histologiškai, ir patyrusių patologai patvirtino diagnozes. Kiekvieno mėginio dalis buvo įtraukta į audinių Tek ^{® Optimalus pjovimo temperatūra ™ (UŠT) junginys vidutinio (VWR mokslinė produkcija, San Diegas, CA, JAV) per kriostatas ir Snaps užšaldyti microdissection.}

elementų ir šaldyti skyriuje skaidres buvo tamsintas tik prieš lazerio surinkimo microdissection (LCM) ant ledo. Trumpai tariant, skyriai buvo lazerio microdissected naudojant LM200 sistemą (Olympus, Japonija /Arktūras inžinerija Inc, JAV). Interesų sritys buvo atrinktos pagal mikroskopinių orientavimo ir padengtas etileno vinilo termoplastinės (EVA) filmas sumontuotas ant optiškai skaidri dangtelį. Infraraudonųjų spindulių lazerinis buvo aktyvuota mygtuko, kuris ištirpdo filmą tiesiai virš tikslinių ląstelių paspaudimu. Tai lydalo sukelia privalomas suformuoti tarp ląstelių ir perdavimo plėvelės, kuri buvo stipresnė nei privalomas tarp ląstelių ir skaidres. Naudojamos LCM parametrai įtraukti lazerio skersmuo 7,5 m, lazerio galia 50-60 MW. Penki tūkstančiai lazerio impulsų išleidimas per pavyzdį buvo naudojami "užfiksuoti" maždaug 10 000 morfologiškai ląsteles nuo kiekvienu atveju. Kiekvienos populiacijos buvo apskaičiuota, kad > 95% homogeninė ", kaip nustatyta, mikroskopu vizualizavimo fotografuojamoms ląstelių. Dangteliai su nufotografuotų ląstelių tada buvo sumontuotas ant 0,5 ml microcentrifage vamzdžiai. Po microdissection, DNR, RNR arba baltymų galima išgauti iš alkivotos microdissected pavyzdžius.

Metilinimas analizė

Genomo DNR, gautus iš microdissected ląstelių linijų, skrandžio vėžio audiniuose ir plazmoje (0,2 ml ) buvo gryninamas naudojant DNAzol (Invitrogen). Išgryninta DNR buvo apdorojama natrio bisulfito (Sigma, Phoenix, JAV) ir tada analizuojami BSP arba specifinę polimerazės grandinine reakcija (MSP) kaip buvo aprašyta anksčiau [13,15]. Amplifikuoti bisulfite PGR produktai subklonuoti į TA vektoriaus sistema (Promega) pagal gamintojo instrukcijas. DNR sekos buvo atliktas trijų atskirų klonų (Sangong). PGR produktai buvo patvirtinta agarozės gelio elektroforezės ir ryškinamos naudojant Etidžio bromidas dažymo. Naudojami gruntai yra sutraukta S1 lentelėje.

elektronų mikroskopiniai stebėjimas

h. pylori
padermių NCTC11637 (tiek CagA- ir VacApositive) teikė profesorius Guo į medicinos mikrobiologijos ir parazitologijos, institutų medicinos mokslų, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos departamentas. h. pylori
kamienai buvo auginami paprastai 72 h apie Kolumbijos agaro pagrindo (BIOMERIEUX, Prancūzija) su 5% avies kraujo mišrių ore, kurių sudėtyje yra 10% CO _{2, 5% O2, ir 85% N 2 metu 37 ° C temperatūroje. Tada mes konvertuoti H. pylori
skystoje terpėje, kuriame smegenų širdies infuzijos (BD, JAV), 10% avies kraujo, ir tas pats antibiotikus, kurie buvo naudojami Kolumbijos agaro bazę. Skystosios terpės sukrėtė į purtyklė ( "Forma" Mokslo, JAV) su pastoviu rotacijos norma 120 rpm. h. pylori
buvo skaičiuojami naudojant spektrofotometru (BioSpec-Min, Shimadzu Scientific Instruments, Japonija) ir išplauti su steriliu PBS (pH 7,4, 5000 aps, 10 min), prieš naudojimą. GES-1 ląstelės (4 × 10 ^{5) buvo auginami iki susiliejantis ant stiklo danga slysta iš šešių duobučių plokšteles, tada GES-1 ląstelės buvo užsikrėtę H. pylori
už infekcijos (MOI) 100 įvairovė: 1. Po inkubacijos 24 h greičiu, morfologiniai pokyčiai Ges-1 ląstelių buvo pastebėtas naudojant H-800 perdavimo elektroniniu mikroskopu.}}

Realaus laiko KRL-PGR analizė

buvo gautas Išgrynintas RNR iš microdissected ląstelių, kad bendras RNR buvo išskirta naudojant Trizol tirpalą. Atvirkštinės transkripcijos (RT), buvo atliktas per 20-ties mikrol, reakcijos pagal gamintojo rekomendacijas (QIAGEN). Realaus laiko KRL-PGR tyrimai buvo atliekami naudojant išvardytus S1 Stalo pradmenis. Stenograma ekspresijos lygiai buvo nustatomas pagal kiekybiškai PGR produkto intensyvumą normalizuoti pagal gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) išraiška. Kiekybinis matavimas mRNR lygių atlikta naudojant ABI PRISM 7000 (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, JAV). Šie duomenys buvo analizuojami naudojant lyginamąją Ct metodą.

imunoblotingu

Viso baltymas gaunamas iš microdissected ląsteles. Signalo baltymų gavybos buferis 1 sistema (430-7608-SDL) Bio-Rad Corporation buvo naudojamas baltymų gavybos mūsų eksperimentų ir koncentracija buvo matuojama DC baltymų bandymo metodo Bradford (Bio-Rad). A 100 mikrogramų baltymo nuo kiekvieno mėginio iš viso buvo atskirtas nuo 10% SDS-PAGE gelyje ir perkeliamas į balansuojama polivinilideno difluoridą membranos ( "Amersham Biosciences, Buckinghamshire, JK) Baltymai buvo aptikta glaudesnio cheminės liuminescencijos (Amersham Corporation", Arlington Heights, IL , JAV) po inkubacijos su konkretaus pirminio antikūno VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), ir IRX5 (1: 2000), esant 4 ° C temperatūroje per naktį ir tada antrinis antikūnas. Baltymų koncentracija buvo normalizuotas visų GAPDH naudojant monokloninius kovos su GAPDH antikūnas (Sigma), kaip aprašyta anksčiau [15].

Statybinės ekspresijos vektoriaus VEZT and TCF19

VEZT ir TCF19 raiškos vektorių pEGFP -N1--VEZT ir pEGFP-N1-TCF19 buvo pastatyti naudojant persidengimo PGR arba PGR metodą, atitinkamai ir gruntai naudojami dviejų vektorių yra sutraukta S1 lentelėje. PGR produktai buvo patvirtinta tiesiogiai DNR sekos ir klonuotas į žinduolių ekspresijos vektorių pEGFP-N1 kaip anksčiau aprašyta [15]. MKN-45 ir NVI-N87 skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo naudojamos raiškos studijas. Gavome stabiliai perkeltų klonai iki G418 pasirinkimas (Promega). Stabili transfectant iš pEGFP-N1 tuščius vektorius buvo panaudotas kaip kontrolei. Transfekcijai, kompleksai Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, JAV) ir vienos iš minėtų plazmidžių buvo paruoštas pagal gamintojo instrukcijas, ir tie kompleksai buvo tiesiogiai maišyti su ląstelių 24 duobučių ląstelių kultūros plokščių esant 4 tankio × 10 ^{4 ląsteles už gerai. Iš VEZT ar TCF19 išraiškos lygis po transfekciją buvo tiriami realaus laiko PGR.}

invazija, migracija ir endotelio vamzdžių formavimo tyrimai

Mobilusis invazija, migracija ir endotelio vamzdis formavimo tyrimai buvo atliekami naudojant MKN -45 ir NVI-N87 ląstelės. Ląstelių kultūros buvo atliktas transwell kamerose (Corning, NY, JAV). Dėl invazijos metodu, įdėklą membranos buvo padengtas praskiesto Matrigel (San Chosė, CA, JAV). Ląstelės (1 × 10 ^{5) buvo pridėta prie viršutinės kameroje ir buvo kultivuojamos 48 h. Už migracijos testą, įterpti Membranos buvo nepadengta Matrigel bet buvo auginamos tomis pačiomis sąlygomis. Pagaliau, yra intarpas, Membranos buvo sumažinti ir nudažomi su violetinei (0,04% vandenyje; 100 ml), ir, išsiskyrusio ląstelės buvo skaičiuojamas pagal apversto mikroskopu ir buvo fotografuojami}

in vitro angiogenezę buvo įvertintas naudojant. endotelio vamzdis formavimas tyrimas rinkinys (San Diego, CA, USA). Trumpai, kiekvienas iš prechilled 96-šulinėlių auginimo plokščių gerai buvo padengtas plonu sluoksniu ECM gelio. HUVECs buvo resuspenduota surinktų iš perkeltų ląstelių nuopile. HUVECs (2 × 10 ^{4 ląstelių /gerai) buvo pridėta prie polimerizuoto ECM želė su 300 ml nuopile. Po 18-h inkubacijos vamzdis formavimas gebėjimas buvo įvertintas nustatant kanalėlių numerį, vamzdiniai ilgį ir kanalėlių susikertančių mazgų skaičių penkių atsitiktinių laukų, naudojant Image Pro Plus programinė įranga (Media kibernetikos Inc., Bethesda, MD, JAV) pagal į Mirshahi metodu [19].}

ląstelių augimą ir minkštas agaras kolonija formavimas tyrimas

Skrandžio vėžio ląstelės (2 × 10 ^{3 ląstelių) buvo inkubuojami su 100 įxL mitybine terpe 96 -multiwell plokštės vieną dieną 37 ° C 5% CO _{2. Ląstelės buvo transfekuota su 24 plazmidės, 48, 72, 96, ir 120 valandų. Ląstelių skaičius buvo įvertintas naudojantis mobilųjį skaičiavimo rinkinys-8 (CCK-8) (Dojindo, Japonija). Trumpai, CCK-8 (10 pL) buvo įtraukta į kiekvieną šulinėlį. Po 1 h inkubacijos 37 °, absorbcija esant 450 nm buvo matuojamas naudojant Arvo MX plokštelių skaitytuvas (PerkinElmer, Masačusetsas, JAV). Ląstelių skaičius buvo nustatomas pagal santykinį absorbcijos 450 nm.}}

skrandžio vėžio ląstelės buvo tripsinizuojamos į vieno ląstelių suspensijos 3 x 10 ^{3 ląstelės, o vėliau buvo padengtas iš šešių duobučių lėkštelėse visiškai kultūra terpėje, turinčioje 0,3% agaro sluoksniuotos ant 0,6% agaro. Plokštelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje, kaip apibrėžta 5% CO _{2 buvimą per 16 dienų. pelnė kolonijos, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 50 ląstelių. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis penkių atsitiktinai įmušė srityse.}}

Naviko augimas nuogas Pelės

Cells (1 × 10 ^{6 ląstelės 100 ml) iš vėžinių ląstelių linijos Transfekuoti su tuščiu vektoriumi ar VEZT ekspresijos vektorius buvo surinkti ir oda pasėta į dešinio krašto regionų 4 savaičių amžiaus vyrų BALB /c nuogas pelėmis (Kinijos mokslų akademija, Šanchajus, Kinija). Naviko mazgeliai buvo matuojamas kas 4 dienas su žnyplių. Pelės buvo paaukota po 1 mėnesį. Naviko augimo kreivės ir augimo slopinimas normos buvo apskaičiuotos. Du pelėms buvo naudojamas eksperimentinių ir kontrolinių grupių ir trys nepriklausomi eksperimentai buvo atliekami kaip aprašyta anksčiau [15,16].}

Pasaulinis kDNR Mikrogardelė analizė ir tikslinio geno patikrinimas

Išgrynintas RNR buvo gaunamas iš microdissected ląstelių. buvo naudojamas visas žmogaus genomas oligo Mikrogardelė (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, JAV). Po hibridizacijos ir plovimo, mikrogardeliq skaidres nuskaityta su Agilent DNR mikrogardeliq skenerio. Gauti tekstiniai failai, išgauti iš "Agilent požymių išskyrimas Programinė įranga (versija 9.5.3) buvo importuoti į" Agilent GeneSpring GX programinės įrangos (versija 7.3) dėl tolimesnės analizės. Skirtingai išreikšti genai buvo nustatyti per kartų kaitos atrankos. Dėl tikslinio geno patikrinimo mes naudojamas realiojo laiko PGR ir chromatino Imunoprecipitacijos tyrimą. Už tikslinių genų gruntai yra išvardyti S1 lentelėje.

tėkmės citometrijos analizė ląstelės ciklo

Vieną dieną prieš transfekciją, 1 × 10 ^{6 ląstelės MKN-45 ląstelių buvo pasėjamos į 6-šulinėlių auginimo plokščių be antibiotikų. Ląstelės buvo transfekuota su tuščiu vektoriaus arba TCF19 ekspresijos vektoriumi. Keturiasdešimt aštuonias valandas po to, kai transfekciją, Ląstelės buvo surinktos ir nustatytas 70% etanolio -20 ° C temperatūroje per naktį, ir vėliau yra nudažomi su 250 g /ml propidiumo jodido (Sigma-Aldrich), 5 g /ml RNazės A (Sigma-Aldrich) ir 5 mmol /l EDTA PBS (pH 7,4) 30 min. Ląstelės ciklo analizė buvo atliekama FACScan (Bekmano instrumentų, Fullerton, CA, JAV).}

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS15.0 programinė įranga (SPSS Inc, JAV). Duomenys išreikštas vidurkis ± standartinis nuokrypis nuo mažiausiai trejus atskirus eksperimentus. Koreliacijos tarp VEZT raiškos navikų ir clinicopathologic kintamųjų buvo apskaičiuojamas su Kruskal-Wallis testas ir Mann-Whitney U testą. Skirtumai tarp grupių buvo analizuojami naudojant Stjudento t-testas ir Chi kvadrato testas. A vertė P
< 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Ryšiai VEZT ekspresijos lygį ir klinikos veiksnių pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu

tirtų tarp VEZT raiškos lygmenų 104 suporuotas skrandžio vėžio audinių ir klinikos veiksniai pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Mes nustatėme, kad pasakymas lygis VEZT buvo reikšmingai susijęs su limfinės metastazių, gylis vėžio invazijos ir TNM etape (1 lentelė P
< 0,05). Tačiau VEZT ekspresijos lygis nebuvo susijusios su lyties, amžiaus, naviko dydį, ląstelių diferenciacijos, bendrojo išvaizda, svetainės naviko ir tolimą metastazių.
Veiksniai
kodas pacientų
reiškia išraišką VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor dydis < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site iš tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth vėžio invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5.41 distalinio metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Sąryšis tarp VEZT ekspresijos lygį vėžiu audinių ir klinikos veiksniai pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu.
Tyrėme tarp VEZT raiškos lygmenų vėžiu audinių ir klinikos veiksnių skrandžio vėžio mėginių, palyginti su gretimuose normaliuose audiniuose (n = 104). Mes nustatėme, kad pasakymas lygis VEZT buvo reikšmingai susijęs su limfinės metastazių, gylis vėžio invazijos ir TNM etape (1 lentelė P
< 0,05). Tačiau VEZT ekspresijos lygis nebuvo susijęs su lyties, amžiaus, naviko dydį, ląstelių diferenciacijos, bendrojo išvaizda, svetainės naviko ir tolimą metastazių #:. TNM, naviko mazgas-metastazių; * P
< 0,05. CSV Parsisiųsti CSV

Metilinimas analizė normaliomis skrandžio audinių, pirminių skrandžio vėžio audiniuose ir periferinio kraujo iš skrandžio karcinoma sergantiems pacientams ir sveikų

Remiantis ankstesniame tyrime iš mūsų laboratorijoje, mes postuluojama, kad VEZT promotoriaus metilinimo buvo skirtinga skrandžio karcinoma sergantiems pacientams ir sveikų; mes naudojome internetu bioinformatikos programinės įrangos analizuoti rengėjas regione ir metilinimo statusą VEZT genų (1a pav.) Mes išnagrinėjome metilinimo lygis VEZT promotoriaus 30 audinio mėginiai DNR pacientams, sergantiems pirmine skrandžio vėžio audiniuose, atitinkantis plazmos DNR ir kontrolę, naudojant BSP metodus, kurie apėmė -171bp regionai -428bp (1a pav.) Vidutiniai denatūruotas lygiai VEZT per 30 pradinių skrandžio vėžio audiniuose ir 30 normalių skrandžio audinių buvo 67.78 ± 25.90% ir 42.42 ± 30.30% atitinkamai (1b pav.) Pirminiai skrandžio vėžio audiniuose parodė aukštesnius metilinimas lygius VEZT promotoriaus regione, palyginti su normaliomis skrandžio audinių (pav S1A, 1B pav, p < 0,05). Vidutinė metilo lygis plazmoje DNR pradinėse skrandžio vėžiu sergančių pacientų ir sveikų atvejais buvo 69.00 ± 23.90% ir 46.71 ± 26.31% atitinkamai (1c pav.) Metilintas lygis plazmos DNR pirminių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, parodė, didesnes metilinimo lygius VEZT promotoriaus regione, lyginant su sveikų asmenų kontroline atveju (pav S1B, pav 1C, P < 0,05). Taigi, reikšmingas metilinimas buvo pastebėtas skrandžio vėžio grupėje, palyginti su sveikų. Iš denatūruotą VEZT audiniuose ir plazmoje lygis galėtų tarnauti kaip molekulinės persekiotoją skrandžio vėžio.

H. pylori
infekcija sukelia metilinimo ir nutildymo iš VEZT

Nemažai tyrimų buvo paskelbta, rodančius, kad H. pylori
infekcija yra nepriklausoma rizikos veiksnys metilinimo [20,21,22]. Todėl mes manome, kad H. pylori
sukelia VEZT metilinimas ir vėliau Kancerogeninis. Iš pradžių, mes išnagrinėjo metilinimo lygis VEZT promotoriaus į DNR iš 23 audinių mėginių iš pacientų su H. pylori
-positive lėtinis gastritas ir kontrolė, naudojant BSP ir MSP metodus, kurie apėmė -171bp regionai -428bp ir -342 BP -513 bp, atitinkamai (1a pav.) Vidutiniai metilinimo lygiai VEZT promotoriaus H. pylori
-positive ir kontrolė buvo 75,74 ± 28,16% ir 31,20 ± 25,67%, atitinkamai. Taigi, didelis skirtumas metilinimo buvo pastebėtas H. pylori
-positive lėtinis gastritas grupė palyginti su kontroline grupe ( P
< 0,01, 2A pav.) Projekto rengėjas regionas VEZT paprastai buvo denatūruotas pacientams, sergantiems lėtiniu gastritu pagal MSP analizė (lentelė S2); Tačiau, mes nustatėme, keturi atvejai, H. pylori
-positive lėtiniu gastritu, kad buvo santykinai nemetilintas. Matėme 19 atvejai, H. pylori
-positive lėtinis gastritas, kad rodomas hypermethylation (lentelė S2),. Norėdami nustatyti, ar H. pylori
infekcija sukelia promotorių metilinimas dėl VEZT geno in vitro
, mes nustatėme, kad H. pylori
infekcija buvo susiję su IL-6, AKT, TNF-A, IL-8, ATF3 ir IRX5 baltymo ekspresiją po H. pylori
infekcija ir inkubuojami 24 h GES-1 ląstelių Imunoblotingo metodu. Mūsų rezultatai parodė, H. pylori
infekcija skatino IL-6, AKT, TNF-A, IL-8, ATF3 ir IRX5 baltymų ir H išraiška. pylori
infekcija buvo sėkmingai GES-1 ląstelių (2b pav, 2C). Siekiant dar labiau patvirtina, kad H. pylori
infekcija yra iš tiesų atsakingas už metilinimo ar nuslopinami iš VEZT, mes išanalizavo rengėjas metilinimo statusą VEZT į GES-1 ląstelių pagal JEP ir BSP. Kaip parodyta 2D paveiksle 2E, kad VEZT rengėjas buvo hypermethylation į H. pylori
-infected GES-1 ląstelės, bet unmethylation buvo stebimas ląstelių sveikų su H. pylori
(2D pav, ir E). Baltymų raiška lygis VEZT taip pat buvo mažesnis H. pylori
-infected ląsteles nei ląstelių sveikų su H. pylori
(2C pav.)

funkcinė analizė atkūrus VEZT išraiška in vitro

dažnai triukšmo slopinimo arba downregulation iš VEZT skrandžio vėžio ląstelių linijų rodo, kad tikėtina, augliui slopintuvas genas mūsų ankstesniame tyrime. Siekiant išbandyti šį tašką, mes tikrinami VEZT išraišką keliose skrandžio vėžio ląstelių linijų realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė. Įvairūs VEZT ekspresijos lygis buvo rasta šešių ląstelių linijų analizuojamų (3a paveikslas). Mes sukonstravo pEGFP-N1-VEZT ekspresijos vektorių, ir transfekuotos pEGFP-N1 vektorių į skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN-45 ir NVI-N87, kuris neparodė arba žemo lygio VEZT išraiška. Po transfekciją, mes išnagrinėjo VEZT išraiška šiose ląstelių linijų realaus laiko PGR, kuris parodė, kad stenograma išraiška lygis VEZT buvo reguliuojama 41.99 kartus (3B pav P < 0,01) šių ląstelių linijų, palyginti su su kontrolės-perkeltų ląstelių. Mes taip pat išnagrinėjo skrandžio vėžio ląstelių ekspresija VEZT įsiveržti ir migruoti į transwell invazijos ir migracijos tyrimai (3c pav) pajėgumus. Invazinių gebėjimas MKN-45 ląstelių VEZT /N1 grupės buvo gerokai sumažintas, palyginti su kontrolės-perkeltų ląstelių (78,32 ± 5,27 vs 174,13 ± 2,45 P
< 0,001). Iš MKN-45 ląstelių VEZT-transfekuota mėginio, kad migravo per transwell įterpti numerį taip pat buvo gerokai sumažintas, palyginti su kontrolės-perkeltų ląstelių (48,28 ± 2,16 vs 142,13 ± 7.42 P
< 0,001).

HUVECs buvo sustabdytas, surinktų iš kontrolės ir VEZT /N1 nuopile. Po to, kai 18-h inkubacijos, išaugintoje iš VEZT /N1 ląstelių supernatantą parodė tvirtą slopinantį poveikį vamzdinių struktūrų formavimas HUVECs su atsižvelgiant į skaičius, ilgis ir susikertančių mazgų, lyginant su kontroline grupe (Fig.3C). Kaip parodyta 3D paveikslas, ląstelių augimo MKN-45 ląstelių buvo reikšmingai slopino ant VEZT ekspresijos palyginti atkūrimo su kontroline grupe ( P
< 0,05). Išnagrinėti mūsų išvadas atgaminimas, mes įvertino NVI-N87 skrandžio vėžio ląstelių gebėjimą įsiveržti, migruoti ir forma vamzdinių konstrukcijų ant VEZT raiškos. Šie rezultatai buvo panašūs į tuos, kurie aprašyti MKN-45 vėžinių ląstelių, kurios rodo, kad VEZT turi svarbų slopinančio vaidmenį invazijos, migracijos ir kanalėlių formavimo vėžinių ląstelių.

poveikis VEZT raiškos nuo vėžio tumorogeniš- ląstelės nuogas pelėms

Išsireiškimas VEZT slopino tiek MKN-45 ir NVI-N87 augimą CCK-8 testą, lyginant su kontroline grupe (paveikslas 3D, p < 0,05). Ši išvada dar kartą patvirtino kolonijos formavimosi tyrime, didėjantis skrandžio vėžio ląsteles ant minkšto agaro po transfekciją su VEZT-ekspresija vektorių. Colony formavimo normos MNK-45 ląstelių buvo 13,56 ± 0,53% nuo VEZT /N1 grupės ir 1,2 ± 0,31% kontrolinėje grupėje ( P
< 0,001, 4E pav.) Kolonija formavimas norma NVI-N87 ląstelių parodė panašią tendenciją. Be to, mes išnagrinėjo VEZT raiškos poveikį naviko augimą įdėję sėjimo kultūros MKN-45 arba NVI-N87 /N1 ir VEZT /N1 ląsteles oda į dešinio krašto regionuose nuogas pelių. Tumorogeniš- buvo žymiai sumažintas VEZT-perkeltų ląstelių. Greitas auglys augo kontrolinės grupės po 1 mėnesio (4F pav.) Navikas slopinančio vaidmuo VEZT išraiškos buvo matyti tiek vėžio ląstelių linijų išbandytų (pav 4G, P < 0,01), o tai rodo, kad VEZT slopina vėžinių ląstelių tumorogeniš-. Šie rezultatai parodė, kad VEZT išraiška slopina skrandžio vėžio tumorogeniš- tiek in vitro, parsisiųsti ir vivo
.

Cheminės tikslinių genų po VEZT genų transfekciją

Jei išsiaiškinti molekulinį mechanizmą, lemiančio slopinamąjį poveikį VEZT ląsteles invazijos, augimo, migracijos ir skrandžio vėžio tumorogeniš-. Tyrėme genomo transcriptome profilį MKN-45 /N1 ir VEZT /N1 ląstelių Agilent oligo microarray. Pasak pakeliamus pokyčius (> 3.0), atrankos tarp MKN-45 /N1 ir VEZT /N1 ląstelių, mes nustatėme, 193 aktyvinama genus ir 135 downregulated genus (lentelė S3). Mes ieškoma genus, kurie sutapo su vėžiu susijusi ir molekuliniai funkcija susijusių genų rinkinių MSigDB (C4 ir C5 genų rinkinius; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~HEAD=dobj~~number=plural). Mes pasirinkome 49 vėžį susijusios genus, kurie apima 23 aktyvinama genus ir 26 downregulated genų klasterių žemėlapių dėl MeV Mikrogardelė analizės platforma (www.tm4.org/mev.html~~pobj 4a pav.) Realaus laiko PGR buvo atliekama tikrinant šių genų (lentelė S4) ir patvirtino mūsų microarray išvadas 8 aktyvinama genų ir 10 downregulated genų (4b pav.) Geno vardai ir funkciniai komentarus išvardyti S5 lentelėje. Norėdami nustatyti, ar tai yra tiesioginė tikslinė genai VEZT, mes atlikome chromatino Imunoprecipitacijos tyrimuose, naudojant VEZT antikūno ir tada analizavo ištrauktas į apačią DNR. Mes nustatė tris downregulated genus, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) ir GPR56 (NM_001145770) kaip tiesioginės VEZT tikslų (4c pav.)

koreliacija tarp VEZT ir jos paskesnių tikslus, taip pat jų asociacijos su skrandžio vėžio ląstelių invaziją, augimo, migracijos ir skrandžio vėžio in vitro
tumorogeniš- ir slopinimo vivo
buvo parodyta 5C pav.

• PLoS ONE: identifikavimas ir apibūdinimas Nauji N-glikaną pagrindu biologinių žymenų skrandžio vėžio
• PLoS ONE: genetinis polimorfizmas į TOX3 yra susijusi su išlikimo skrandžio vėžio į Kinijos gyventojų