Финансирование:. Эта работа была частично поддержана грантами от Национального юношеского научного фонда Китая (81101858), то фонд естественных наук провинции Шаньдун Китая (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), научно-исследовательского проекта Ключ от Шаньдун науки и Комиссии по технологиям (2011GGB14158, 2007H2071), Юношеская научный фонд провинции Шаньдун Китая (BS2010YY060). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является второй ведущей причиной мужского связанной с раком смерти и третьей ведущей причиной женской смертности от рака во всем мире, связанных с [1]. Это является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире [2]. В Китае, есть 400000 новых случаев рака желудка и 300000 случаев смерти в год. Во многих случаях, которые страдают от рака желудка потеряли лечебный шанс с очень плохим исходом [3]. Таким образом, разработка новых и эффективных терапевтических методов имеет важное значение для снижения смертности от рака желудка. Было известно, что патогенез желудочных карцином является многофакторной, которая включает в себя генетическую предрасположенность и факторы окружающей среды. Есть целый ряд генетических чередованием в том числе генов-супрессоров опухолей, онкогенов, молекул клеточной адгезии и факторов роста [4].
<Р> Хотя молекулярные механизмы канцерогенеза желудка остаются неясными, эпигенетические глушение генов, связанных с опухолевыми промоутером гиперметилированием в последнее время появились в качестве важного механизма онкогенеза. Профиль промотор гиперметилирование отличается в каждом типе рака и в пределах каждого гена, обеспечивая type- опухоли и ген-специфические профили гиперметилирование, который может включать в соответствующий молекулярный механизм онкогенеза. Идентификация нового гена мишенью гиперметилированием промотора может дать представление о механизмах инактивации опухолевых подавляющих путей и имеет важное значение для выявления опухолевых маркеров при раке желудка [5,6]
.
В последнее время , мы определили, в слипчивые соединения трансмембранный белок, VEZT в качестве гена опухолевого супрессора кандидата. Мы стремились разъяснить эпигенетической регуляции и биологические функции VEZT при раке желудка. VEZT, повсеместным интегральный белок, косвенно связан с Е-кадгерин-катенина комплекса и цитоскелета [7,8]. Его функции в основном были исследованы в эпителиальных клетках. Потеря VEZT прогрессивно пагубные последствия для эмбрионального развития [9,10], и VEZT имеет решающее значение для сохранения целостности клеточных переходов при длительном механического напряжения, происходящих на уровне клеток внутреннего уха волос в ответ на звук. Кроме того, внутреннее ухо специфические VEZT условное признание недействительным приводит к прогрессирующей глухоты [7]. VEZT высоко экспрессируется в головном мозге [8,11]. VEZT обогащен дендритных шипиков в мыши нейронов гиппокампа. Использование VEZT нокдауна и условного нокаута до (D6cre) или после (CamKIIαcre) при рождении, VEZT регулирует позвоночника морфологии. Морфологические изменения не связаны с ослабленной синаптических контактов, но постсинаптические VEZT играет решающую роль в морфо-функционального созревания возбуждающих постсинаптических элементов [12]. Клеточные линии и образцы ткани Этика Заявление Построение вектора экспрессии VEZT и TCF19 роста клеток и образование мягкого агара колонии анализа клеток (1 × 10 6 клеток в 100 мл) от раковых клеток линии, трансфицированные пустым вектором или вектором экспрессии, VEZT собирали и инокулировали подкожно в правый фланг регионов 4-недельного возраста мужского пола BALB /с голым мышам (китайской академии наук, Шанхай, Китай). измеряли опухолевые узелки каждые 4 дня с суппортами. Мышей умерщвляли через 1 мес. Рассчитаны кривые опухолевого роста и скорости ингибирования роста. Две мыши были использованы для экспериментальной и контрольной групп, а также три независимых эксперимента, как описано ранее [15,16]. Связь уровней экспрессии VEZT и клинико-патологическими факторами у больных с желудочной Метилирование анализ нормальных тканей желудка, желудочных первичных раковых тканей и периферической крови из желудка больных раком и здоровых людей Функциональный анализ после восстановления экспрессии VEZT в пробирке
<Р> Инактивация гена VEZT был идентифицирован при раке желудка, а также метилирование CpG островков в пределах промоторной области гена VEZT способствуют его инактивацию, как определено в предыдущем исследовании, проведенном нашей лаборатории [13]. Механизм метилирования и точная роль VEZT в развитии рака желудка в настоящее время неизвестно. Генов-мишеней и связанные с ними Пути VEZT еще не были идентифицированы. В данном исследовании мы систематически проанализировали механизм метилирования и метилирования статус промотора гена VEZT. Мы также проанализировали свои функциональные особенности после восстановления VEZT выражения в пробирке и в естественных условиях
.
Материалы и методы
<р> MKN -45, MKN-28, SGC-7901, то увековечил человеческой линии клеток слизистой оболочки желудка ГЭС-1 (при условии, Институтом пищеварительной хирургии больницы Жуйцзинь филиалом Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] и клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVECs) сохранились в нашем институте. Желудочный линии раковых клеток SNU-1 и NCI-N87 клетки были получены из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). В кратком изложении, клетки выращивают в RPMI 1640, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка и 2 мМ L-глутамина. Клетки выдерживали при 37 ° С в присутствии 5% CO <суб> 2.
<Р> Первичный желудка опухолевых и нормальных тканей слизистой оболочки желудка были собраны с любой обычной терапевтической хирургии или гастроинтестинальной эндоскопии в нашем отделении. Остаток был H. Pylori
статус инфекция была определена на основе быстрого уреазного теста, как описано ранее [18].
<р> Письменное информированное согласие в исследовании было получено от всех участников. 4-недельного возраста мужчина BALB /C голых мышей были приобретены у подопытных животных Центра Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и поддерживается в животных лабораторный центр провинциальной больницы аффилированными университета Шаньдун (Цзинань, Китай) на 12/12 ч цикл свет /темнота (свет выключали в 19: 00) с пищей и водой, доступными AdLibitum. Эксперименты на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в провинциальной больнице аффилированными Шаньдун университет по формуле (разрешение номер: SHANS87492). Протокол исследования был одобрен этическим комитетом областной больницы аффилированными Шаньдун университет.
Обработка Лазерная микродиссекции для тканей и клеток
<р> Тканей были удалены как можно скорее после резекции и фиксировали в формалине, заливали в парафин, и разрезать на 8-мкм срезы толщиной для гематоксилином и эозином (H &Amp; E) окрашивание. Все ткани исследуют гистологически, и опытные патологоанатомы подтвердили диагнозы. Часть каждого образца было заложено в Tissue-Tek ® Оптимальная температура резания ™ (ОКТ) Соединение среды (VWR Scientific Products, Сан-Диего, штат Калифорния, США) в криостат и щелкает замораживали для микродиссекции.
<Р> Клетки и гистологическое слайды окрашивали непосредственно перед лазерной захвата микродиссекции (LCM) на льду. Вкратце, срезы лазера микродиссекции с использованием LM200 системы (Olympus, Япония /Арктур Engineering Inc, США). Интересующие области были выбраны под микроскопическим руководством, и покрыт этиленвинилацетат термопластичного (EVA) пленки установлен на оптически прозрачной крышкой. Инфракрасный лазер активируется нажатием кнопки, которая плавит пленку непосредственно над клетками-мишенями. Этот расплав вызвало связывание с образованием между клетками и переводной пленки, которая была сильнее, чем связывание между клетками и горками. Параметры, используемые для LCM включали диаметр лазерного 7,5 мкм, мощность лазера 50-60 мВт. Пять тысяч лазерных импульсов разрядов в образце были использованы для "захвата" приблизительно 10 000 морфологически клетки от каждого конкретного случая. Каждая популяция была оценена в &ГТ; 95% "гомогенный", как определено микроскопической визуализации захваченных клеток. Колпачки с захваченными клетками затем монтировали на 0,5 мл пробирки microcentrifage. После того, как микродиссекции, ДНК, РНК или белка может быть извлечена из аликвот микродиссекции образцов.
Метилирование анализ
<р> геномную ДНК, полученные из микродиссекции клеточных линий, желудочный раковых тканей и плазмы (0,2 мл ) очищали с помощью DNAzol (Invitrogen). Очищенную ДНК обрабатывали раствором бисульфита натрия (Sigma, Феникс, США), а затем анализировали с помощью БСП или конкретных полимеразной цепной реакции (ПНС), как описано ранее [13,15]. Усиленные бисульфита ПЦР-продукты субклонировали в векторной системы ТП (Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя. Секвенирование ДНК выполняли на трех отдельных клонов (Sangong). Продукты ПЦР были подтверждены с помощью электрофореза в агарозном геле и визуализировали с помощью окрашивания бромидом этидия. Праймеры, используемые приведены в таблице S1.
Электронно-микроскопическое наблюдение
<р> <ЕМ> Н. Pylori
штаммы NCTC11637 (оба CagA- и VacApositive) были предоставлены профессором Го Департамента медицинской микробиологии и паразитологии, институты медицинских наук, Shanghai Jiao Tong University, Школа Медицины. H. штаммы пилори
культивировали обычно в течение 72 часов на агаровой базе Columbia (bioMérieux, Франция) с 5% овечьей крови в смешанном воздухе, содержащем 10% CO <суб> 2, 5% O2 и 85% N <югу> 2 в 37 ° C. Затем мы преобразовали H. пилори
в жидкой среде, содержащей сердечный мозг настой (BD, США), 10% овечьей крови, и те же антибиотики, которые используются в агар базы Колумбии. Жидкая среда встряхивали на качалке (Forma Scientific, США) с постоянной скоростью вращения 120 оборотов в минуту. H. пилори
подсчитывали с использованием спектрофотометра (BioSpec-мин, Shimadzu Scientific Instruments, Япония) и промывали стерильной PBS (рН 7,4, 5000 оборотов в минуту, 10 мин) перед использованием. GES-1 клеток (4 × 10 5) выращивали до сливающийся на стеклянной крышке не скользит в шести-луночные планшеты, а затем клетки ГЭС-1 были заражены H. пилори
на множественность инфекции (MOI) 100: 1. После инкубации в течение 24 ч, наблюдались морфологические изменения ГЭС-1 клеток с использованием Н-800 просвечивающий электронный микроскоп.
в режиме реального времени QRT-PCR-анализ
<р> была получена Очищенную суммарную РНК от микродиссекции клеток, Суммарную РНК экстрагировали с использованием раствора тризола. Обратной транскрипции (RT) проводили в реакции 20-мкл в соответствии с рекомендациями изготовителя (Qiagen). В режиме реального времени QRT-PCR-анализ проводили с использованием праймеров, перечисленных в таблице S1. Уровни экспрессии транскриптов определяли путем количественной оценки интенсивности ПЦР-продукта нормализованы к выражению (GAPDH) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы. Количественное измерение уровней мРНК проводили с использованием ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Фостер Сити, США). Эти данные были проанализированы с использованием сравнительного метода Ct.
вестерн-блоттинга
<р> Общий белок экстрагируют из микродиссекции клеток. Сигнал экстракции белка буфер 1 система (430-7608-ПБМ) в Bio-Rad Corporation использовали для экстракции белка в наших экспериментах, и концентрацию измеряли методом белок-анализа DC Брэдфорда (Bio-Rad). В общей сложности 100 мкг белка из каждого образца разделяли с помощью 10% -ном SDS-PAGE и переносили в уравновешенную поливинилидендифторидную мембрану (Amersham Biosciences, Бакингемшир, Великобритания) Белки были обнаружены усиленной хемилюминесценции (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , США) после инкубации с конкретной первичным антителом VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), АКТ (1: 1000), Cag А (1: 3000), ИЛ-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), и IRX5 (1: 2000) при температуре 4 ° С в течение ночи, а затем вторичное антитело. уровни белка были нормализованы к общему GAPDH с использованием моноклональных анти-GAPDH антитела (Sigma), как описано ранее [15].
сверхэкспрессии вектора <р> VEZT и TCF19 pEGFP -N1-VEZT и pEGFP-N1-TCF19 были построены с использованием перекрывания ПЦР или ПЦР-метод, соответственно, и праймеры, используемые для двух векторов суммированы в таблице S1. Продукты ПЦР были подтверждены путем прямого секвенирования ДНК и клонировали в вектор экспрессии млекопитающих pEGFP-N1, как описано ранее [15]. MKN-45 и NCI-N87 линии рака желудка клеток использовали для исследований избыточной экспрессии. Мы получили стабильно трансфецированных клонов путем G418 селекции (Promega). Стабильная трансфектант пустого вектора pEGFP-N1 использовали в качестве контроля. Для трансфекции комплексов Липофектамином 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, США) и одной из плазмид, указанных выше, был подготовлен в соответствии с инструкциями производителя, и эти комплексы были непосредственно смешаны с клетками в 24-луночные культуральные планшеты при плотности 4 × 10 4 клеток на лунку. Уровень экспрессии VEZT или TCF19 после трансфекции анализировали с помощью ПЦР в реальном времени.
Invasion, миграция и анализы формирования эндотелиальной трубки
<р> инвазии клеток, миграцию и анализы формирования трубки эндотелиальные были выполнены с использованием MKN -45 и NCI-N87 клетки. Культура клеток проводили в Transwell камерах (Corning, Нью-Йорк, США). Для анализа вторжения, вставки мембраны были покрыты разбавленного Матригель (Сан-Хосе, Калифорния, США). Клетки (1 × 10 5) добавляли в верхнюю камеру и культивировали в течение 48 часов. Для анализа миграции, вставка мембраны не покрывали матригелем но культивировали при тех же самых условиях. И, наконец, вставка мембраны вырезали и окрашивали кристаллическим фиолетовым (0,04% в воде, 100 мл), и перенесенные клетки подсчитывали под инвертированным микроскопом и фотографировали
<р> В пробирке ангиогенеза оценивали с помощью. эндотелиальной образование трубки набора для анализа (Сан-Диего, штат Калифорния, США). Если коротко, то в каждую лунку prechilled культуральных планшетов 96-луночный покрывают тонким слоем геля ЕСМ. HUVECs ресуспендировали в супернатантах, собранных из трансфицированных клеток. HUVECs (2 × 10 4 клеток /лунку) добавляли к полимеризованного геля ЕСМ 300 мл надосадочной жидкости. После 18-часовой инкубации, способность формирования трубки оценивали путем определения числа трубчатую, трубчатая длину и количество трубчатых узлов пересекающихся в пяти случайных полей с помощью Image Pro Plus программное обеспечение (Media Кибернетика Inc., Bethesda, MD, USA) в соответствии методу Mirshahi [19].
<р> раковые клетки желудка (2 × 10 3 клеток) инкубировали с 100 мкл культуральной среды в 96 -multiwell пластины в течение одного дня при температуре 37 ° С в 5% CO <югу> 2. Клетки трансфицировали плазмидой в течение 24, 48, 72, 96 и 120 часов. Число клеток оценивали с помощью подсчета клеток набор-8 (ССК-8) (DOJINDO, Япония). В кратком изложении, ССК-8 (10 мкл) добавляли в каждую лунку. Через 1 ч инкубации при 37 ° С, оптическую плотность при 450 нм измеряли, используя планшет-ридер АРВО MX (PerkinElmer, штат Массачусетс, США). Число клеток определяли с помощью относительной оптической плотности при длине волны 450 нм.
<Р> желудочные раковые клетки трипсином в одноклеточных суспензий 3 х 10 3 клетки, а затем высевают в шесть-луночные планшеты в комплекте культуральной среды, содержащей 0,3% агара слой поверх 0,6% агара. Чашки инкубировали при 37 ° С в присутствии 5% CO <суб> 2 в течение 16 дней. Колонии, содержащие по крайней мере, 50 клеток были забиты. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение пяти случайным образом забитых полей.
Рост опухоли в голых мышах
Глобальный анализ кДНК микрочипов и ген-мишень проверки
<р> Очищенную суммарную РНК полученные из микродиссекции клеток. был использован весь человеческий геном олиго микрочипов (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США). После гибридизации и промывки микрочипов слайды были отсканированы с микрочипов сканером Agilent ДНК. Полученные текстовые файлы, извлеченные из компании Agilent Feature Extraction программного обеспечения (версия 9.5.3) были импортированы в программное обеспечение Agilent GeneSpring GX (версия 7.3) для дальнейшего анализа. Дифференциально выраженные гены были идентифицированы с помощью скрининга складными изменения. Для проверки гена-мишени мы использовали ПЦР в реальном времени и хроматина анализа иммунопреципитации. Праймеры для генов-мишеней, перечислены в таблице S1.
Цитометрический анализ клеточного цикла
<р> За один день до трансфекции, 1 × 10 6 клеток MKN-45 клеток высевали в 6-луночные планшеты для культивирования без антибиотиков. Клетки, трансфицированные пустым вектором или вектором экспрессии TCF19. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки собирали и фиксировали в 70% -ном этаноле при температуре от -20 ° С в течение ночи, а затем окрашивали 250 мкг /мл пропидиума йодистого (Sigma-Aldrich), 5 мкг /мл РНКазы А (Sigma-Aldrich) и 5 ммоль /л EDTA в PBS (рН 7,4) в течение 30 мин. Анализ клеточного цикла был сделан FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, США).
Статистический анализ
<р> Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS15.0 (SPSS Inc, США). Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от по крайней мере, трех отдельных экспериментов. Корреляции между экспрессией VEZT в опухолях и клиникопатологическими переменных рассчитывали с помощью теста ранга Крускала-Уоллиса и теста Манна-Уитни U. Различия между группами были проанализированы с использованием Student T-тест и критерий хи-квадрат. Значение р
&л; 0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
рака <р> Мы исследовали взаимосвязь между уровнями экспрессии VEZT в 104 парного желудка раковые ткани и клинико-патологических факторов у больных раком желудка. Мы обнаружили, что уровень экспрессии VEZT был в значительной степени связано с лимфатической метастаз, глубиной инвазии рака и TNM стадии (таблица 1, P
≪ 0,05). Однако уровни экспрессии VEZT не были связаны с полом, возрастом, размер опухоли, дифференциации клеток, валовой внешний вид, место опухоли и отдаленных метастазов.
Факторы
No. пациентов
Среднее выражение VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor размер &л; 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site из tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth из invasionT22518.35 рака ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 Дистальный metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Взаимосвязь между уровнями экспрессии VEZT в раковых тканях и клинико-патологическими факторы у больных раком желудка.
Мы проанализировали взаимосвязь между уровнями экспрессии VEZT в раковых тканях и клинико-патологическими факторами в желудочном образцах рака по сравнению с нормальной тканью (п = 104). Мы обнаружили, что уровень экспрессии VEZT был в значительной степени связано с лимфатической метастаз, глубиной инвазии рака и TNM стадии (таблица 1, P
≪ 0,05). Однако уровни экспрессии VEZT не были связаны с полом, возрастом, размер опухоли, дифференциации клеток, валовой внешний вид, место опухоли и отдаленных метастазов #:. TNM, опухоль-узлов метастазы; * р
&л; 0.05. CSV Загрузить CSV
<р> На основании предыдущего исследования из нашей лаборатории, мы предположили, что метилирование промотора VEZT отличался в желудочных больных раком и здоровых людей; мы использовали программное обеспечение для онлайн биоинформатики для анализа промоторной области и метилирования статус гена VEZT (рис 1А). Мы исследовали уровень метилирования промотора VEZT в 30 образцах ткани ДНК от больных с первичными желудочных раковых тканей, соответствующие ДНК плазмы и управления с использованием методов BSP, который охватывает регионы -171bp к -428bp (Рис. 1А) Средние уровни метилируется VEZT в 30 первичных раковых тканей желудка и 30 нормальных тканей желудка были 67,78 ± 25,90% и 42,42 ± 30,30%, соответственно (рис 1B). Первичные раковые ткани желудка показали более высокие уровни метилирования в промоторной области VEZT по сравнению с нормальными тканями желудка (рис S1a, Рисунок 1B, P < 0,05). Средний уровень метилированной ДНК плазмы в первичных больных раком желудка и случаи здоровых контрольных были 69.00 ± 23.90% и 46.71 ± 26,31%, соответственно (рис 1C). Метилированный уровень ДНК плазмы в первичных больных раком желудка показали более высокие уровни метилирования в промоторной области VEZT по сравнению со здоровыми случае управления (Рисунок S1B, Рисунок 1C, P &л; 0,05). Таким образом, значительное метилирование наблюдалось в желудочном группе рака по сравнению со здоровыми. Уровень денатурированного VEZT в тканях и плазме крови может служить в качестве молекулярного маркера рака желудка.
H. Pylori
инфекция индуцирует метилирование и молчание VEZT
<р> Значительное число исследований было опубликовано, продемонстрировавшее, что H. Pylori
инфекция является независимым фактором риска для метилирования [20,21,22]. Таким образом, мы предполагаем, что H. пилори
вызывает VEZT метилирование и впоследствии канцерогенеза. Во-первых, мы исследовали уровень метилирования промотора VEZT в ДНК из 23 образцов ткани у пациентов с H. Pylori
-положительным хронический гастрит и контроль с помощью BSP и MSP методов, которые охватывают регионы -171bp к -428bp и -342 б.п. до -513 б.п., соответственно (рис 1А). Уровни среднего метилирование промотора VEZT в H. пилори
-положительным и контроль были 75,74 ± 28,16% и 31,20 ± 25,67%, соответственно. Таким образом, наблюдается существенная разница в метилирования в H. Pylori
-положительным хронический гастрит группы по сравнению с контрольной группой ( P
&л; 0,01, рис, 2А). Промоторной области VEZT в целом метилируется у пациентов с хроническим гастритом в соответствии с анализом (табл MSP S2); Тем не менее, мы нашли четыре случая H. пилори
-положительным хронический гастрит, которые были относительно неметилированным. Мы наблюдали 19 случаев H. Pylori
-положительным хронический гастрит, который отображается гиперметилирование (Таблица S2). Для того, чтобы определить, является ли H. Pylori
инфекция индуцирует метилирования промотора гена VEZT в пробирке
, мы обнаружили, что H. Pylori
инфекции были связаны с экспрессией IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 и IRX5 белка после H. Pylori
инфекции и инкубировали в течение 24 ч в клетках GES-1 с использованием Вестерн-блоттинга. Наши результаты показали, H. Pylori
инфекция способствует экспрессии IL-6, АКТ, TNF-а, IL-8, ATF3 и IRX5 белка и H. Pylori
инфекция была успешной в GES-1 клеток (рис 2B, 2C). Для дальнейшего подтверждения того, что что H. Pylori
инфекция действительно отвечает за метилирование или глушителей VEZT, мы проанализировали статус метилирования промотора VEZT в клетках GES-1 и ССП БСП. Как показано на рис 2D и 2Е, промотор VEZT был гиперметилирование в H. наблюдалась Pylori
-infected ГЭС-1 клетки, но unmethylation в клетках неинфицированных с H. пилори
(Рисунок 2D, и Е). Уровень экспрессии белка VEZT был также ниже в H. пилори
-infected клеток, чем в клетках неинфицированных с H. пилори
(рисунок 2С).
<р> Частые глушителей или подавление VEZT в желудочном линиях раковых клеток позволяет предположить, что он, скорее всего, опухоль-супрессоров генов в нашем предыдущем исследовании. Для того, чтобы проверить эту точку, мы провели скрининг экспрессии VEZT в нескольких желудочных линий раковых клеток с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга. Различные уровни экспрессии VEZT были найдены в шести клеточных линиях анализируемых (фиг.3А). Мы построили вектор экспрессии pEGFP-N1-VEZT и трансфицировали вектор pEGFP-N1 в желудочную линии клеток рака MKN-45 и NCI-N87, который показал отсутствие или низкий уровень экспрессии VEZT. После трансфекции, мы исследовали экспрессию VEZT в этих клеточных линий с помощью ПЦР в реальном времени, который показал, что уровень экспрессии транскрипт VEZT был повышающей регуляции 41,99 раза (фигура 3В, Р &л; 0,01) в этих клеточных линиях по сравнению с с контрольными трансфецированных клеток. Мы также исследовали способность клеток рака желудка с гиперэкспрессией VEZT к вторжению и мигрируют вторжением Transwell и анализов миграции (рис 3C). Инвазивная способность клеток MKN-45 в /N1 группе VEZT была значительно снижена по сравнению с контрольными трансфецированных клеток (78,32 ± 5,27 против 174,13 ± 2,45, P
≪ 0,001). Число MKN-45 клеток в VEZT трансфецированные образце, который мигрировал через Transwell вставку также значительно снижена по сравнению с контрольными трансфецированных клеток (48,28 ± 2,16 против 142,13 ± 7,42, P
≪ 0,001).
<р> HUVECs были приостановлены в супернатантах, собранных из-под контроля и VEZT /N1. После 18-часовой инкубации, супернатант собирали из клеток VEZT /N1 показали сильное ингибирующее действие на формирование трубчатых структур HUVECs по отношению к количеству, длине и пересекающихся узлов по сравнению с контрольной группой (рис 3C). Как показано на фиг.3D, клеточный рост клеток MKN-45 был в значительной степени подавленным после восстановления VEZT экспрессии по сравнению с контрольной группой ( P
≪ 0,05). Для изучения воспроизводимости наших выводов, мы оценивали способность NCI-N87 рака желудка клетки вторгнуться, мигрировать и образовывать трубчатые структуры на VEZT избыточной экспрессии. Эти результаты были аналогичны тем, которые описаны в MKN-45 раковых клеток, которые предполагают, что VEZT играет важную роль в тормозящее вторжения, миграции и трубчатым образование раковых клеток.
Влияние VEZT сверхэкспрессии на туморогенности рака клетки в голых мышах
<р> Выражение VEZT подавляет рост обоих MKN-45 и NCI-N87 с помощью CCK-8 анализа по сравнению с контрольной группой (рис 3D, P < 0,05). Это открытие было дополнительно подтверждено с помощью анализа образования колоний, путем выращивания клеток рака желудка на мягком агаре после трансфекции с VEZT-гиперэкспрессией вектор. Colony скорости образования клеток MNK-45 были 13,56 ± 0,53% в /N1 группе VEZT и 1,2 ± 0,31% в контрольной группе ( P
&л; 0,001, рис 4Е). Скорость образования колонии клеток NCI-N87 показал аналогичную тенденцию. Далее, мы исследовали влияние VEZT избыточной экспрессии на рост опухоли путем засева MKN-45 или NCI-N87 /N1 и VEZT /N1 клеток подкожно в правый фланг регионов голых мышей. Туморогенность была значительно снижена в VEZT-трансфицированных клетках. Такой быстрый рост опухоли наблюдали в контрольных группах через 1 месяц (рис 4F). Подавляющих роль опухоли экспрессии VEZT было очевидно в обеих клеточных линий рака тестируемых (рис 4G, P &ЛТ; 0,01), предполагая, что VEZT подавляет туморогенности раковых клеток. Эти результаты показали, что экспрессия VEZT ингибирует туморогенности рака желудка и в пробирке
и В естественных условиях
.
Идентификация генов-мишеней после VEZT трансфекции гена
<р> Чтобы выяснить молекулярный механизм, лежащий в основе угнетающее действие на клетки VEZT вторжения, роста, миграции и туморогенности рака желудка. Мы проанализировали генома транскриптом профиль MKN-45 /N1 и клеток VEZT /N1 по Agilent олиго микрочипов. Согласно откидные изменение (&GТ; 3,0), скрининг между MKN-45 /N1 и VEZT /N1 клеток, мы обнаружили 193 активируемых генов и 135 генов подавляются (таблица S3). Мы искали гены, которые внахлест с раком связаны и молекулярные функции, связанные наборы генов в MSigDB (C4 и C5 генных наборов; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~HEAD=dobj~~number=plural). Мы выбрали 49 раковых генов, ассоциированных, которые включают 23 активируемых генов и 26 генов подавляются для отображения кластера на платформе анализа микрочипов МэВ (www.tm4.org/mev.html~~pobj, рис 4а). ПЦР в реальном времени проводили для проверки этих генов (таблица S4) и подтвердили наши выводы микрочипов 8 активируемых генов и 10 генов подавляются (рис 4б). Названия генов и функциональных аннотаций приведены в таблице S5. Для того, чтобы определить, являются ли эти прямые целевые гены VEZT, мы провели анализы иммунопреципитации хроматина с использованием VEZT антитела, а затем анализировали растянутой вниз ДНК. Мы определили три подавляются гены, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) и GPR56 (NM_001145770) в качестве прямых целей VEZT (рис 4C)
. <Р> корреляции между VEZT и его нижестоящих мишеней, а также их связь с ингибирование клеток рака желудка вторжения, роста, миграции и туморогенности рака желудка в пробирке
и в естественных условиях
, были показаны на рисунке 5С. пилори
инфекции. H.
Вакцинация против ротавируса не связана с риском сахарного диабета 1 типа
Пищевые продукты, улучшающие работу кишечника, могут положить конец детскому недоеданию во всем мире
Многопрофильный подход к разработке лекарств против COVID-19
Анализ крови на микробную ДНК может предупредить о раке
Perfectus Biomed примет участие в конференции IPS в Ливерпуле
Антиоксиданты в рационе могут повысить риск рака кишечника.
Создание физической и генетической карты Cannabis sativa
В Каннабис сатива растение обычно используется в различных лекарственных, сельскохозяйственный в промышленных и рекреационных целях по всему миру. Несмотря на широкое распространение, остается мало
Половина используемых лекарств повреждает кишечные бактерии,
говорит новое исследование Яркая презентация на UEG Week 2019, в Барселоне, показывает, что микробиом кишечника подвергается высокому риску повреждения каждый раз, когда мы используем лекарство из одн
Повышение рисков биозащиты, создаваемых синтетической биологией
Исследование, проведенное по заказу Министерства обороны США, показало, что существует несколько инструментов генной инженерии, которые можно использовать для создания биологического оружия за коротки