PLoS ONE: VEZT, roman pretpostavljenim supresor tumora, smanjuje rast i torn smjeru želučanog raka

Sažetak pregled

Vezatin (VEZT), An adherens spojevi transmembranski protein, identificiran je kao navodni tumor supresor u našem prethodnom istraživanju. Međutim, uloga VEZT u nastanku tumora i dalje izmiče. cilj mi pojasniti svoju epigenetičku regulacija i bioloških funkcija u raka želuca. U ovom istraživanju, pokazali smo da je razina ekspresije VEZT je uključen u limfni metastaza, dubini invazije i TNM pozornici u 104 bolesnika s rakom želuca. Bisulfat lančane reakcije polimeraze sekvenciranje (BSP) metode pokazali su da VEZT je hypermethylated u tkivima i odgovarajuće krvi pacijenata oboljelih od raka želuca u usporedbi sa zdravim kontrolama. Helicobacter pylori pregled ( H. Pylori pregled) infekcija potiče metilacije i odsutnost VEZT u GES-1 stanica. Vraćanje izraz VEZT u MKN-45 i NCI-N87 stanica raka želuca inhibira rast, invaziju i tumorigenezi in vitro i in vivo pregled. Globalna analiza mikropostrojima se primjenjuje za analizu molekularne osnove biološke funkcije VEZT nakon VEZT transfekcije u kombinaciji s realnom vremenu PCR i kromatina eseja imunoprecipitacije. G proteinski vezani receptor 56 (GPR56), stanični rast, staničnu diobu ciklusa 42 (CDC42), migraciju /invazija i faktora transkripcije 19 (TCF19) progresiju staničnog ciklusa, identificirani su kao ciljanih gena izravna VEZT. TCF19, roman meta VEZT, funkcionalno je potvrđen. Prekomjerna ekspresija TCF19 u MKN-45 stanica povećan napredak staničnog ciklusa i sposobnost rasta. Ova studija pruža novi uvid u regulaciji gena VEZT, što može postati potencijalna meta za terapijske strategije protiv raka pregled

Izvor:. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, roman pretpostavljenim supresor tumora, smanjuje rast i torn smjeru želučanog raka. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409 pregled

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan pregled

Primljeno: 1. travnja 2013., Prihvaćeno: 1. kolovoz 2013; Objavljeno: 17. rujna 2013 pregled

Copyright: © 2013 Miao i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan u sklopu koje subvencija iz Nacionalnog mladenačke Science Foundation of China (81101858), Natural Science Foundation Shandong provinciji u Kini (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), projekt Key Research iz Shandong znanosti i tehnologije komisije (2011GGB14158, 2007H2071), mladenački znanstvena zaklada Shandong provinciji u Kini (BS2010YY060). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je drugi vodeći uzrok raka kod muškaraca povezanih smrti i treći vodeći uzrok raka u žena povezanih smrti u svijetu [1]. To je glavni javni zdravstveni problem širom svijeta. [2] U Kini postoji 400.000 novih slučajeva raka želuca i 300.000 smrtnih slučajeva godišnje. Mnogi slučajevi koji su patili od raka želuca su izgubili ljekovito priliku s izrazito lošim ishodom [3]. Dakle, razvoj nove i učinkovite terapijske metode je bitno da se smanji smrtnost od raka želuca. Poznato je da se patogeneza želučanog karcinoma je više činilaca, koji uključuje i genetsku predispoziciju i okolišni čimbenici. Postoji veliki broj genetskih preinake uključujući gena za suzbijanje tumora, onkogeni, stanične adhezijske molekule i faktora rasta. [4] pregled

Iako molekularni mehanizmi želuca karcinogeneze ostaje nejasna, epigenetičko utišavanje gena tumora povezanih s promoterom Hipermetilacija nedavno pojavio kao važan mehanizam nastanku tumora. Profil promotor Hipermetilacija razlikuje u svakoj vrsti raka i unutar svakog gena, pružajući tumora tip- i gena specifičnih za Hipermetilacija profile koji se mogu uključiti u odgovarajućem molekularnom mehanizmu nastanku tumora. Identifikacija novog gena na meti promotora Hipermetilacija može pružiti uvid u mehanizme kojima se inaktiviraju tumorskih potiskuju putova i važno je za identifikaciju tumorskih markera u rakom želuca [5,6]. Pregled

U zadnje vrijeme , identificirali smo, što je adherens čvorišta transmembranski protein, VEZT kao tumor supresorski gen kandidata. cilj nam je razjasniti epigenetičku regulacija i bioloških funkcija od VEZT u raka želuca. VEZT, sveprisutna integralni protein, neizravno je povezana s E-kadherina-katenina kompleksa i aktin citoskeleta [7,8]. Njegove funkcije su uglavnom bili provedeni u epitelnim stanicama. Gubitak VEZT je postupno štetna za razvoj embrija [9,10], i VEZT je kritična za očuvanje integriteta staničnih čvorišta tijekom dugotrajne mehaničke stres koji se javlja na razini unutarnjeg uha stanice kose kao odgovor na zvukove. Štoviše, unutarnjeg uha specifične VEZT uvjetno poništenja dovodi do progresivnog gluhoće [7]. VEZT je visoko izražen u mozgu [8,11]. VEZT obogaćen dendritičke bodljama u miša hipokampusa neurona. Korištenje VEZT knock-down i uvjetno nokaut prije (D6cre) ili nakon (CamKIIαcre) rođenje, VEZT regulira morfologiju kralježnice. Morfološke promjene nisu povezani s kompromitiranim sinaptičkih kontakata, ali postsinaptični VEZT igra ključnu ulogu u morfo-funkcionalni sazrijevanja ekscitatornih sinaptičke elemenata [12]. Pregled

inaktivacija gena VEZT je identificiran kod raka želuca, a metilacija CpG otočića unutar promotorske regije gena VEZT doprinijeti njegovom inaktivacije kao što je određeno u prethodnom istraživanju koje su proveli našem laboratoriju [13]. Mehanizam metilacijom i točna uloga VEZT u razvoju raka želuca trenutno nepoznati. Ciljnih gena i srodne putovi VEZT još nisu identificirani. U ovom istraživanju, sustavno analizirali mehanizam metilacije i metilacije statusa promotora gena VEZT. Također smo analizirali njegove funkcionalne značajke nakon rekonstitucije VEZT izražavanja in vitro i in vivo
. pregled

Materijali i metode

Stanične linije i uzorci tkiva pregled

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, besmrtne ljudske želučane sluznice stanične linije GES-1 (pod uvjetom da je institut za digestivnu kirurgiju od Ruijin bolnici učlanjene u Šangaju Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] i ljudske endotelne stanice umbilikalne vene (HUVEC) su sačuvani u našem institutu. Rak želuca stanične linije SNU-1 i NCI-N87 stanice su dobivene od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ukratko, stanice koje su uzgajane u RPMI1640 uz dodatak 10% fetalnog telećeg seruma i 2 mM L-glutamina. Stanice su održavane na 37 ° C u prisutnosti 5% CO _{2. Pregled}

Primarni gastričkog tumora i normalnog tkiva želučane sluznice su prikupljeni iz bilo rutinskom terapijskog zahvata ili gastrointestinalna endoskopije na odjelu. Ostatak je H. pylori pregled, stanje infekcije određena je na osnovu brzog testa ureaze kao što je prethodno opisano [18]. pregled

Etika Izjava pregled

Pismeni informirani pristanak u studiju koji je dobiven od svih sudionika. 4 tjedna star BALB /c golim miševima su kupljeni od pokusnoj životinji Centar kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina) i održava se u životinja laboratorija Centra pokrajinskog bolnice povezane na Sveučilištu Shandong (Jinan, Kina) na 12/12 h svjetlo /tamno ciklus (svjetlo se gasi u 19: 00) s hranom i vodom dostupnom adlibitum. Pokusi na životinjama su odobreni od strane njega i uporaba odbora institucionalna životinja u Zemaljskom bolnice povezane na Sveučilištu Shandong (dozvola broj: SHANS87492). Protokol istraživanja odobrio je Etičko povjerenstvo pokrajinskog bolnice povezane na Sveučilištu Shandong. Pregled

Obrada Laser mikrodisekcijom za tkiva i stanica pregled

Tkiva su uklonjene u najkraćem roku nakon resekcije i fiksirana u formalinu, uklopljena u parafin, te izrezati na 8-um-debljim dijelovima za hematoksilinom i eozinom (H &E) bojenja. Sva tkiva ispitani su histološki i iskusni patolozi su potvrdili dijagnozu. Jedan dio svakog uzorka je ugrađen u tkivu-Tek ^{® optimalne rezanje Temperatura ™ (listopad) spoj srednje (VWR Znanstveni Proizvodi, San Diego, CA, USA) u kriostat i sjedne smrznut mikrodisekcijom. Pregled}

Stanice i zamrznuti odjeljak Rezovi su obojeni neposredno prije laserom hvatanje mikrodisekcijom (LCM) na ledu. Ukratko, sekcije su laserski microdissected pomoću LM200 sustav (Olympus, Japan /Arkturus Engineering Inc., SAD). Područja interesa su izabrani pod mikroskopom, a prekrivena etilen vinil termoplastičnog (EVA) film montiran na optički prozirni poklopac. Infracrveni laser se aktivira pritiskom na gumb, koji se topi u filmu neposredno iznad ciljne stanice. Ovo taljenje izazvao vezanje da se dobiju između stanica i filma za prijenos koji je jači od vezivanja između stanica i preparatima. Parametri korišteni za LCM uključene laserski promjer od 7,5 um, lasera snage 50-60 MW. Pet tisuća laserski puls ispuštanja po uzorku su se koristili za "hvatanje" oko 10 000 morfološki stanice od svakog slučaja. Svaka populacija procjenjuje se > 95% "homogeno" određena je mikroskopskim vizualizaciju uhvaćenih stanica. Kapice sa snimljenim stanice su zatim ugraditi na 0,5 ml microcentrifage cijevi. Nakon mikrodisekcijom, DNA, RNA ili proteina može biti izvađen iz alikvota microdissected uzoraka.

Metilacija analiza pregled

Genomska DNA dobivene iz microdissected stanične linije, želučanog tkiva raka i plazmi (0,2 ml ) se pročisti pomoću DNAzol (Invitrogen). Pročišćeni DNA obrađen s natrijevim bisulfitom (Sigma, Phoenix, USA), a zatim se analizira BSS ili lančane reakcije polimeraze specifična (MSP) kako je prethodno opisano [13,15]. Pojačavaju bisulfit PCR produkti su subklonirani u vektorskom sustavu TA (Promega) u skladu s uputama proizvođača. Sekvencioniranje DNA je provedena na tri pojedinih klonova (Sangong). PCR produkti su potvrđena elektroforezom na agaroznom gelu i vizualizirano pomoću etidijeva bromida bojenje. Primeri korišteni su sažete u tablici S1. Pregled

mikroskopske promatranje pregled

H. pylori pregled sojevi NCTC11637 (oba CagA- i VacApositive) osigurana su prof Guo Odjela za medicinsku mikrobiologiju i parazitologiju, instituta za medicinske znanosti, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H. pylori pregled sojevi su uzgojene rutinski 72 h na Columbia agar baze (bioMérieux, Francuska) s 5% ovčje krvi u mješovitim zraku koji sadrži 10% CO _{2, 5% O2 i 85% N 2 na 37 ° C. Zatim smo pretvaraju H. pylori
na tekućem mediju koji sadrži infuzije jezgre mozga (BD, SAD), 10% ovčje krvi, a isto antibiotike kao oni koji se koriste u Columbia agar baze. Tekući medij se mućka na mućkalici (Forma Scientific, SAD) pri konstantnom brzinom vrtnje od 120 okretaja u minuti. H. pylori pregled su brojani pomoću spektrofotometra (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japan), i ispere sa sterilnim PBS-om (pH 7.4, 5000 rpm, 10 min) prije upotrebe. GES-1 stanice (4 × 10 ^{5) rasle su do konfluencije na staklo te prekrivene, u šest jažica, a zatim GES-1 stanice su zaražene s H. pylori
pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 100: 1. Nakon inkubacije od 24 h, morfološke promjene GES-1 stanice su promatrane pomoću H-800 prijenos elektronskog mikroskopa. Pregled}}

stvarnom vremenu QRT-PCR analiza pregled

se dobije ukupna RNA Pročišćena od microdissected stanica, ukupna RNA je ekstrahirana pomoću trizolne otopine. Reverzna transkripcija (RT) izveden je u 20-ul reakcije u skladu s preporukama proizvođača (Qiagen). Realnom vremenu QRT-PCR analize su provedene primjenom primera navedenih u Tablici S1. Prijepis razine ekspresije utvrđene kvantificirajući intenzitet PCR proizvoda je normalizirana na gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) izražavanja. Kvantitativno mjerenje mRNA provedena je uporabom ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Ovi podaci su analizirani pomoću komparativnu Ct metodu. Pregled

Western blot pregled

Ukupno bjelančevina je izvađen iz microdissected stanica. Signal ekstrakcija proteina pufera 1 sustav (430-7608-lista) Bio-Rad Corporation je upotrijebljena za ekstrakciju proteina u našim pokusima i koncentracija je izmjerena pomoću DC postupkom protein ispitivanje Bradford (Bio-Rad). Ukupno 100 ug proteina iz svakog uzorka su razdvojeni sa 10% SDS-PAGE gelu i prenese u uravnoteženi polivinilidenfluorid membranu (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) Proteini su detektirane pojačanom kemiluminescencijom (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA), nakon inkubacije sa specifičnim primarnim antitijelima, VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), CAG A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000) i IRX5 (1: 2000), na 4 ° C preko noći i tada se sekundarna antitijela. Razine proteina su normalizirani do ukupne GAPDH koristeći monoklonalno anti-GAPDH antitijela (Sigma), kao što je ranije opisano [15]. pregled

Konstrukcija ekspresijskog vektora za VEZT and TCF19 pregled

VEZT i TCF19 nadekspresijom vektor pEGFP -N1-VEZT i pEGFP-N1-TCF19 su pomoću preklapanja PCR ili PCR metode, odnosno i prajmeri upotrijebljeni za dva vektora su prikazani u tabeli S1. PCR produkti su potvrđeni izravnim sekvenciranjem DNA i kloniran u ekspresijski vektor sisavaca pEGFP-N1 kao što je prethodno opisano [15]. MKN-45 i NCI-N87 rak želuca stanične linije korištene za studije prekomjernom ekspresijom. Dobivena se stabilno transfektirane klonova G418 odabira (Promega). Stabilna transfektat od pEGFP-N1 praznim vektorom je korišten kao kontrola. Za transfekciju, kompleksi lipofektamin 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, USA) i jednog od plazmida navedenih proizveden je u skladu s uputstvima proizvođača, a ti kompleksi se direktno miješaju se sa stanicama u stanične kulture ploča s 24 jažica, pri gustoći od 4 × 10 ^{4 stanica po dobro. Razina VEZT ili TCF19 ekspresije nakon transfekcije je ispitivana u realnom vremenu PCR. Pregled}

invazija, migracija i testom endotelnih cijevi formiranje pregled

Cell invazija, migracija i endotelne formiranje cijevi Ispitivanja su provedena pomoću MKN -45 i NCI-N87 stanice. Stanične kulture je izveden u transjažičnih komora (Corning, NY, USA). Za test invazije, umetak membrane su prevučene s razrijeđenom Matrigel (San Jose, CA, USA). Stanice (1 × 10 ^{5) su dodani u gornju komoru i kultivirane su tijekom 48 sati. Za ispitivanje migracije, umetak membrane nisu obložene Matrigel ali su uzgojene pod istim uvjetima. Na kraju, insert Membrane su isječene i obojeni Kristal violet bojom (0,04% u vodi, 100 ml), i migrirale stanice su izbrojene pod invertiranog mikroskopa i fotografirane pregled}

vitro angiogenezu je procijenjena korištenjem. endotelne formacija cijevi assay kit (San Diego, CA, USA). Ukratko, u svaku jažicu od prechilled kulture ploča s 96 jažica je prevučena tankim slojem ECM gela. HUVEC su ponovno suspendirane u supernatantima prikupljenim iz transfektiranih stanica. HUVEC (2 x 10 ^{4 stanica /jažica), dodani su polimeriziranog ECM gelu sa 300 mL supernatantima. Nakon 18-h inkubacije, formiranje cijev sposobnost ocijenjena određivanjem cjevasti broj, cjevasti duljinu i broj cjevastih presjeka 'čvorova u pet slučajnih polja pomoću Image Pro Plus softver (Media kibernetike Inc, Bethesda, MD, USA) prema za Mirshahi metodi [19]. pregled}

staničnog rasta i mekog agara koloniziranje test pregled

želucu stanice raka (2 × 10 ^{3 stanica) inkubirane su s 100 ul medija za kulturu u 96 -multiwell ploče za jedan dan na 37 ° C u 5% CO _{2. Stanice su transficirane s plazmidom za 24, 48, 72, 96 i 120 sati. Broj stanica je određena pomoću stanica brojenja kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan). Ukratko, CCK-8 (10 ul) se doda u svaku jažicu. Nakon 1 h inkubacije pri 37 ° C, apsorbancija pri 450 nm je mjerena pomoću čitača ploča ARVO MX (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Broj stanica određena je relativnom apsorbancije pri 450 nm. Pregled}}

želucu stanice raka su tripsinizirane na jednom staničnih suspenzija od 3 x 10 ^{3 stanicama i zatim su stavljene u šest jažica u potpuni medij za kulturu je sadržavao 0.3% agar nanese na vrh 0,6% agara. Ploče se inkubiraju na 37 ° C u prisutnosti 5% CO _{2 16 dana. Kolonije koje sadrže najmanje 50 stanica su pogodak. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija od pet nasumično postignutih polja. Pregled}}

Rast tumora u miševima

stanica (1 x 10 ^{6 stanica u 100 ml) od stanica raka linije transfektiranih s praznim vektorom ili VEZT vektoru ekspresije su sakupljene i inokulirane supkutano u desni bok regijama 4 tjedna starim mužjacima BALB /c golih miševa (kineske akademije znanosti, Šangaj, Kina). Tumor čvorići su mjereni svaka 4 dana s čeljustima. Miševi su žrtvovani nakon 1 mjeseca. izračunate su krivulje rasta tumora i stope inhibicija rasta. Dva miša su korištena za eksperimentalne i kontrolne skupine, te tri neovisna eksperimenta kao što je prethodno opisano [15,16]. Pregled}

Globalna analiza cDNA mikropostrojima i ciljni gen provjera pregled

Pročišćeni ukupna RNA podvrgnuta je dobiva iz microdissected stanica. Korišten je cijeli ljudski genom oligo mikropostrojima (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Nakon hibridizacije i ispiranja, microarray slajdovi su skenirane sa Agilent DNA microarray skener. Nastale tekstualne datoteke preuzete iz Agilent određivanja značajki softvera (verzija 9.5.3) su uvezeni u Agilent GeneSpring GX softvera (verzija 7.3) za daljnju analizu. Različito izražena geni su identificirani kroz višestruki broj promjena screening. Za provjeru ciljnog gena smo se u realnom vremenu PCR i kromatina imunoprecipitaciji testa. Početnice za ciljnih gena su dani u Tabeli S1. Pregled

Analiza protočnom citometrijom staničnog ciklusa pregled

dan prije transfekcije, 1 × 10 ^{nasađene 6 stanice MKN-45 stanice u pločama za uzgajanje kultura sa 6 jamica bez antibiotika. Stanice su transfektirane sa praznim vektorom ili TCF19 vektor ekspresije. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su sakupljene i fiksirane u 70% etanolu pri -20 ° C preko noći, a zatim obojeni sa 250 ug /ml propidij jodida (Sigma-Aldrich), 5 ug /mL RNAze A (Sigma-Aldrich) i 5 mmol /L EDTA u PBS (pH 7.4) kroz 30 min. Analiza staničnog ciklusa je učinio FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Pregled}

Statistička analiza pregled

Statistička analiza je provedena pomoću SPSS15.0 softver (SPSS Inc., USA). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija iz najmanje tri odvojena pokusa. Korelacija između VEZT izražavanja u tumorima i kliničko varijabli je izračunata uz Kruskal-Wallis rank testa i Mann-Whitney U testa. Razlike između skupina analizirane su pomoću t-test i hi-kvadrat test. Vrijednost p izvoznici < 0,05 smatrala se statistički značajnom. Pregled

Rezultati

Odnos razine VEZT ekspresije i kliničkopatološkim čimbenika u bolesnika s rakom želuca Netlogu

Istraživali smo odnos između VEZT razinama ekspresije u 104 uparenim želuca raka tkiva i kliničkopatološkim čimbenici u bolesnika s karcinomom želuca. Otkrili smo da je razina ekspresije VEZT je značajno povezana s limfni metastaza, dubini invazije i TNM fazi (Tablica 1, P izvoznici < 0,05). Međutim, VEZT razine ekspresije nisu bili povezani sa spolom, dobi, veličini tumora, diferencijacije stanica, bruto izgledu, mjestu tumora i udaljenih metastaza. Pregled Čimbenici
br pacijenata pregled Srednja izražavanje VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor Veličina < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site od tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth od invasionT22518.35 raka ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 distalni metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. odnos između VEZT razinama ekspresije u tkivima raka i kliničkopatološkim čimbenici u bolesnika s karcinomom želuca. pregled, analizirali smo odnos između VEZT razinama ekspresije u tkivima raka i kliničkopatološkim čimbenika u uzorcima u odnosu na susjedne normalnog tkiva (n = 104), rak želuca. Otkrili smo da je razina ekspresije VEZT je značajno povezana s limfni metastaza, dubini invazije i TNM fazi (Tablica 1, P izvoznici < 0,05). Međutim, VEZT razine ekspresije nisu bili povezani sa spolom, dobi, veličini tumora, diferencijacije stanica, bruto izgledu, mjestu tumora i udaljenim metastazama #:. TNM, tumor-čvor-metastaza; * p izvoznici < 0.05. CSV Preuzmite CSV

Metilacija analiza normalnih želučanog tkiva, osnovnih želučanog tkiva raka i periferne krvi pacijenata karcinom želuca i zdravih kontrola

Na temelju prethodne studije iz našeg laboratorija, pretpostavili smo da je metilacija VEZT promotora bio je drugačiji kod pacijenata karcinom želuca i zdravih kontrola; koristili smo online bioinformatičkih softver za analizu promotorske regije i metilacija status VEZT gena (Slika 1A). Ispitali smo razinu metilacije VEZT promotora u 30 uzoraka tkiva DNK od bolesnika s primarnim želučanog tkiva raka, što odgovara plazma DNA i kontrolu pomoću BSP metode, koje su pokrivali područja -171bp da -428bp (Slika 1A). Srednja metiliranog razine VEZT u 30 osnovnim želučane tkiva karcinoma i 30 normalnih želučanog tkiva su bili 67,78 ± 25.90% i 42.42 ± 30.30%, odnosno (Slika 1B). Primarni želučani tkiva karcinoma pokazuju višu razinu metilacija u promotorske regije VEZT u usporedbi sa normalnim tkivom želučanih (Slika S1A Slika 1B, P 0,05). Srednja metiliran razina u plazmi DNA u osnovnim pacijenata oboljelih od raka želuca i zdravih slučajeva kontrolom 69.00 ± 23.90% i 46.71 ± 26.31%, odnosno (slika 1C). Metiliranog razina plazme DNA u primarnim bolesnika s karcinomom želuca pokazuju višu razinu metilacija u promotorske regije VEZT u usporedbi sa zdravim kontrolnom slučaju (slika S1B, Slika 1C, P 0,05). Tako, značajna metilacija zabilježeno je u želučanoj skupine raka u usporedbi sa zdravim kontrolama. Razina metiliranog VEZT u tkivu i plazmi može služiti kao molekularni marker za rak želuca. Pregled

H. pylori pregled infekcija potiče metilacije i odsutnost VEZT pregled

Znatan broj studija objavljena pokazujući da H. pylori pregled infekcija je neovisan čimbenik rizika za metilacije [20,21,22]. Stoga, pretpostavljamo da H. pylori pregled uzrokuje VEZT metilacije, a naknadno karcinogeneze. U početku, ispitali smo razine metiliranjem VEZT promotora u DNA od 23 uzoraka tkiva kod pacijenata s H. pylori pregled pozitivnih kronični gastritis i kontrola pomoću BSP i MSP metode, koje je obuhvatilo regijama -171bp da -428bp i -342 bp do -513 bp, odnosno (Slika 1A). Razine srednja metilacije VEZT promotora u h. pylori
pozitivnih i kontrole bili su 75,74 ± 28,16% i 31,20 ± 25,67%, respektivno. Prema tome, značajna razlika u metilacije zabilježeno je u H. pylori pregled pozitivnih kronični gastritis skupine u usporedbi s kontrolnom skupinom ( P pregled < 0.01, Slika 2). Promotorske regije VEZT općenito je metiliran u bolesnika s kroničnim gastritisom prema MSP analizom (Tablica S2); Međutim, pronašli smo četiri slučaja H. pylori
pozitivnih kronični gastritis koji su bili relativno nemetiliran. Uočili smo 19 slučajeva H. pylori pregled pozitivnih kronični gastritis koji prikazuje Hipermetilacija (Tablica S2). Da bi se utvrdilo je li H. pylori pregled infekcija potiče promoter metilacije gena VEZT In vitro pregled, otkrili smo da H. pylori pregled infekcije su povezane s ekspresije IL-6, AKT, TNF-Pasoš, IL-8, ATF3 i IRX5 proteina nakon H. pylori infekcija pregled i inkubirane 24 sata na GES-1 stanicama primjenom Western blot. Naši rezultati su pokazali H. pylori pregled infekcija promovira ekspresiju IL-6, Akt, TNF-Pasoš, IL-8, ATF3 i IRX5 proteina i H. pylori pregled infekcije bio je uspješan u GES-1 stanice (slika 2B, 2C). Kako bi se dodatno potvrđuju da je H. pylori pregled infekcija je doista odgovoran za metilacije ili odsutnost VEZT, analizirali smo stanje promotor metilacije VEZT u GES-1 stanica od strane MSP i BSP-a. Kao što je prikazano na slici 2D i 2E, promotor VEZT je Hipermetilacija u H. pylori pregled -infected GES-1 stanice, ali unmethylation uočeno je u stanicama nezaraženih s H. pylori pregled (Slika 2D i E). Razina ekspresije proteina VEZT je također bio niži u H. pylori
-infected stanica nego u stanicama nezaraženih s H. pylori pregled (Slika 2C). pregled

Funkcionalna analiza nakon vraćanja VEZT izraz in vitro pregled

česta utišavanje ili smanjenje VEZT u želučanim staničnim linijama karcinoma sugerira da je vjerojatno tumor-supresor gena u našem prethodnom istraživanju. U cilju testiranja ove točke, prikazan smo VEZT izraz u nekoliko želučanog raka stanične linije u realnom vremenu PCR i Western blot. Različite razine ekspresije VEZT pronađeni su u šest staničnih linija analizirana (Slika 3A). konstruirali smo pEGFP-N1-VEZT ekspresijskog vektora i transficirana pEGFP-N1 vektor u želučanom raka stanične linije MKN-45 i NCI-N87, koji ne pokazuju ili nisku razinu ekspresije VEZT. Nakon transfekcije, ispitali smo ekspresiju VEZT u tim staničnim linijama u realnom vremenu PCR, koja je pokazala da je razina transkript izraz VEZT bila doregulirani 41.99 puta (Slika 3B, P 0,01) u tim staničnim linijama, dok je s kontrolnim stanicama transfektirane. Također smo ispitali sposobnost želučanih stanica raka ekspresijom VEZT da napadnu i migrirati od prerastanja invazije i migracija testovima (Slika 3c). Invazivni Sposobnost MKN-45 stanica u VEZT /N1 skupine bila je značajno smanjena u usporedbi s kontrolnim stanicama transfektirane (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45 P pregled < 0,001). Broj MKN-45 stanica u VEZT transfektiranoj uzorka koji migrirale kroz transjažična umetak je također znatno smanjena u usporedbi s kontrolnim stanicama transfektirane (48.28 ± 2.16 vs. 142,13 ± 7.42 P pregled < 0,001). pregled

HUVEC su suspendirane u supernatantima prikupljenim od kontrole i VEZT /N1. Nakon 18 sati inkubacije, sakupljen supernatant iz VEZT /N1 stanice pokazalo je snažnu inhibicijski učinak na formiranje cjevastih konstrukcija HUVEC, u odnosu na broj, duljine i sijeku čvorova u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 3C). Kao što je prikazano na Slici 3D, rast stanica MKN-45 stanica bila je značajno potisnut na obnovu VEZT ekspresije u odnosu na kontrolnu skupinu ( P pregled i 0.05). Ispitati ponovljivosti našim saznanjima, procjenjuje sposobnost NCI-N87 stanica raka želuca da napadne, migriraju i oblik cjevaste strukture na VEZT prekomjernom ekspresijom. Ovi rezultati su bili slični onima opisanim u MKN-45 stanica karcinoma, koji ukazuju na to da VEZT ima važnu inhibicijsku ulogu u invaziji, migraciju i cjevastog formiranja stanica raka. Pregled

Učinak VEZT prekomjernoj ekspresiji u tumorogenosti raka stanice na miševe

ekspresiju VEZT suprimira rast i MKN-45 i NCI-N87 CCK-8 testu u odnosu na kontrolnu skupinu (Slika 3D, p 0,05). Ovaj nalaz je dodatno potvrđena testom formiranja kolonije, po rastu želučane stanice raka na mekom agaru nakon transfekcije s VEZT-ekspresijom vektora. Kolonija stope Dobivanje MNK-45 stanica bile s 13,56 ± 0,53% u VEZT /N1 grupe i 1.2 ± 0.31% u kontrolnoj skupini ( P pregled < 0.001, slika 4E). Brzina formiranja kolonija NCI-N87 stanica pokazuje sličan trend. Dalje je ispitan učinak VEZT prekomjernom ekspresijom na tumorski rast inokulacijom MKN-45 ili NCI-N87 /N1 i VEZT /N1 stanica supkutano u desni bok regijama golih miševa. Tumorogenosti znatno smanjena u VEZT-transficiranim stanicama. Brzi rast tumora je opažena kod kontrolnih skupina nakon 1 mjeseca (slika 4F). Tumor suppressive Uloga VEZT ekspresije bila je očita u obje stanične linije karcinoma testirane (Slika 4G, p 0,01), što ukazuje da VEZT potiskuje tumorogenosti stanica raka. Ovi rezultati pokazuju da je ekspresija VEZT inhibira torn smjeru od raka želuca i In vitro
i in vivo pregled. Pregled

Identifikacija ciljnih gena nakon VEZT transfekcije gena Netlogu

Da se razjasni molekularni mehanizam u podlozi inhibitorni efekt VEZT na stanicama invazije, rast, migracije i torn smjeru od raka želuca. Analizirali smo Genom-wide transcriptome profil MKN-45 /N1 i VEZT /N1 stanica po Agilent oligo microarray. Prema fold-promjene (> 3.0), screening između MKN-45 /N1 i VEZT /N1 stanice, otkrili smo 193 regulira prema gore gene i 135 regulirani gena (Tablica S3). Tražili smo gene koji se preklapa s rakom i gena seta molekularne funkcije vezane za MSigDB (C4 i C5 genskih skupova; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp~~HEAD=dobj~~number=plural). Odabrali smo 49 povezane s rakom gene koji sadrže 23 regulira prema gore gene i 26 regulirani gene za klastera mapiranje na MeV mikropostrojima analizu platformi (www.tm4.org/mev.html~~pobj, slika 4a). Real-time PCR je provedena za provjeru tih gena (Tablica S4) i potvrdio svoje Microarray nalaz za 8 nadregulirani gena i 10 regulirani gena (slika 4b). Imena gena i funkcionalnim primjedbe navedene su u tablici S5. Da bi se utvrdilo da li su to izravni ciljani geni VEZT, proveli smo imunoprecipitacijski testovi kromatina pomoću VEZT antitijela, a zatim analizirali povukao prema dolje DNA. identificirali smo tri regulirani gena, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) i GPR56 (NM_001145770) kao izravne VEZT ciljeva (slika 4c). pregled

korelacije između VEZT i njegovih daljnjih ciljeva, kao i njihova povezanost s inhibicija želučane invaziju stanica raka, rasta, migracije i torn smjeru raka želuca In vitro pregled i in vivo pregled, prikazani su na slici 5C.

• PLoS ONE: Identifikacija i karakterizacija novih N-glikana na bazi Biomarkeri u želučanom Cancer
• PLO-ON: Genetski polimorfizmi u TOX3 je povezana s preživljenje rak želuca u kineskoj Population