PLoS ONE: VEZT, een nieuwe kandidaat tumor suppressor, onderdrukt de groei en tumorigeniciteit van Gastric Cancer

Abstract

Vezatin (VEZT), een adherens kruispunten transmembraaneiwit, werd geïdentificeerd als een vermeende tumor suppressor in onze vorige studie. Echter, de rol van VEZT in het ontstaan ​​van tumoren blijft ongrijpbaar. Ons doel was om zijn epigenetische regulatie en biologische functies bij maagkanker te verduidelijken. In deze studie tonen we aan dat het expressieniveau van VEZT is betrokken bij lymfatische metastase, invasie diepte van kanker en TNM in 104 maagkankerpatiënten. Bisulfaat sequentie polymerase ketenreactie (BSP) methoden gaven dat VEZT werd gehypermethyleerd in weefsels en overeenkomstige bloed maagkanker patiënten vergeleken met gezonde controles. Helicobacter pylori
( H. Pylori
) infectie veroorzaakt de methylering en silencing van VEZT in GES-1-cellen. Herstel van VEZT expressie in MKN-45 en NCI-N87 maagkanker cellen remde de groei, invasie en het ontstaan ​​van tumoren In vitro en in vivo
. Global microarray-analyse werd toegepast om de moleculaire basis van de biologische functies van VEZT VEZT na transfectie in combinatie met real-time PCR en chromatine immunoprecipitatie assay geanalyseerd. G-eiwit gekoppelde receptor 56 (GPR56), celgroei, celdelingscyclus 42 (CDC42), migratie /invasie en transcriptiefactor 19 (TCF19), voortgang van de celcyclus, werden als directe VEZT doelwitgenen. TCF19, een nieuw target van VEZT, werd functioneel gevalideerd. Overexpressie van TCF19 in MKN-45 cellen verhoogd celcyclus vooruitgang en het groeivermogen. Deze studie geeft nieuw inzicht in de regulatie van de VEZT gen, dat een potentieel doelwit voor therapeutische anti-kanker strategieën kunnen vertegenwoordigen

Visum:. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, een nieuwe kandidaat tumor suppressor, onderdrukt de groei en tumorigeniciteit van maagkanker. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10.1371 /journal.pone.0074409

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Ontvangen: 1 april 2013; Aanvaard: 1 augustus 2013; Gepubliceerd: 17 september 2013

Copyright: © 2013 Miao et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de National Jeugdige Science Foundation of China (81101858), de Natural Science Foundation van de provincie Shandong China (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key Research Project van Shandong Science and Technology Commissie (2011GGB14158, 2007H2071), de Jeugdige Science Foundation van de provincie Shandong China (BS2010YY060). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van mannelijke kanker-gerelateerde dood en de derde belangrijke oorzaak van vrouwelijke kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Het is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid in de hele wereld [2]. In China zijn er 400.000 nieuwe gevallen van maagkanker en 300.000 sterfgevallen per jaar. Veel gevallen die van maagkanker leed hebben curatieve kans verloren met zeer slechte uitkomst [3]. Daarmee wordt de ontwikkeling van nieuwe en effectieve therapeutische methodes essentieel om maagkanker mortaliteit. Het is bekend dat de pathogenese van maagcarcinomen multifactorieel, welke genetische predispositie en omgevingsfactoren omvat. Er zijn een aantal genetische wisselingen waaronder tumorsuppressorgenen, oncogenen, celadhesie moleculen en groeifactoren [4].

Hoewel de moleculaire mechanismen van maagkanker onduidelijk, epigenetische inactivatie van tumor-gerelateerde genen door promotor hypermethylatie recentelijk naar voren gekomen als een belangrijk mechanisme van tumorigenese. De promotor hypermethylatie profiel verschilt in elk type kanker en in elk gen, waardoor tumor type- en genspecifieke hypermethylatie profielen die in de overeenkomstige moleculaire mechanisme van tumorigenese kan omvatten. De identificatie van een nieuw gen getarget door hypermethylering promoter kan inzicht in de mechanismen voor het inactiveren van de tumor-onderdrukkende trajecten bieden en is belangrijk voor de identificatie van tumor markers bij maagkanker [5,6].

Recently we hebben geïdentificeerd, een contactplaatsen transmembraaneiwit VEZT als een kandidaat tumor-suppressor gen. Ons doel was om de epigenetische regulatie en biologische functies van VEZT bij maagkanker te verduidelijken. VEZT, een alomtegenwoordige integrale eiwit, wordt indirect geassocieerd met E-cadherine-catenine complex en actine cytoskelet [7,8]. De functies voornamelijk onderzocht in epitheelcellen. Verlies van VEZT geleidelijke nadelig voor embryonale ontwikkeling [9,10] en VEZT is essentieel voor de integriteit van de cellulaire verbindingen gedurende langdurige mechanische spanning optreedt op het niveau van binnenoor haarcellen als geluid. Bovendien, het binnenoor specifieke VEZT voorwaardelijke ongeldig leidt tot progressieve doofheid [7]. VEZT wordt sterk tot expressie gebracht in de hersenen [8,11]. VEZT is verrijkt in dendritische in de muis hippocampus neuronen. Met behulp van VEZT knock-down en voorwaardelijke knockout vóór (D6cre) of na (CamKIIαcre) geboorte, VEZT regelt wervelkolom morfologie. Morfologische veranderingen werden niet geassocieerd met een verminderde synaptische contacten, maar postsynaptische VEZT speelt een cruciale rol in de morfo-functionele rijping van de prikkelende postsynaptische elementen [12].

Inactivering van de VEZT gen is geïdentificeerd bij maagkanker en de methylatie van CpG eilanden in de promotorregio van het gen VEZT bijdragen tot de inactivering, zoals bepaald door een eerder onderzoek van ons laboratorium [13]. Het mechanisme van de methylering en de precieze rol van VEZT bij de ontwikkeling van maagkanker zijn nog niet bekend. De doelgenen en verwante routes van VEZT zijn nog niet geïdentificeerd. In deze studie hebben we systematisch analyseren het mechanisme van methylering methyleringsstatus van de promotor van het gen VEZT. We analyseerden ook de functionele kenmerken, na oplossing van VEZT meningsuiting In vitro en in vivo
.

Materialen en methoden

cellijnen en weefselmonsters

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, de vereeuwigd menselijke maagslijmvlies cellijn GES-1 (verstrekt door het instituut van de spijsvertering chirurgie van Ruijin ziekenhuis aangesloten bij Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] en humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) werden bewaard in ons instituut. Maagkanker cellijnen SNU-1 en NCI-N87-cellen werden verkregen van American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). In het kort werden cellen gekweekt in RPMI1640 gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum en 2 mM L-glutamine. Cellen werden bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO _{2 gehandhaafd.}

Primaire maag tumor en normale gastrische mucosale weefsels werden opgehaald van routine therapeutische chirurgie of endoscopie in categorieën. De rest was H. pylori
infectie status werd bepaald op basis van de snelle urease test zoals eerder beschreven [18].

Ethics Verklaring

Geschreven informed consent in de studie werd verkregen van alle deelnemers. 4 weken oude mannelijke BALB /c naakt muizen werden gekocht van de Experimental Animal Center van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China) en gehandhaafd in de Animal Laboratory Center van het Provinciaal Ziekenhuis aangesloten bij Shandong University (Jinan, China) op een 12/12 uur licht /donker-cyclus (lichten uit om 19: 00) met voedsel en water beschikbaar adlibitum. De dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite in het Provinciaal Ziekenhuis aangesloten bij Shandong University (Permit Number: SHANS87492). De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Provinciaal Ziekenhuis aangesloten bij Shandong University.

Verwerking van de Laser microdissectie voor weefsels en cellen

Weefsels werden zo snel mogelijk verwijderd na resectie en in vaste formaline, ingebed in paraffine en in 8-urn dikke secties voor hematoxyline en eosine snijden (H &E) kleuring. Alle weefsels werden histologisch onderzocht, en ervaren pathologen bevestigde de diagnoses. Een deel van elk monster werd ingebed in Tissue-Tek ^{® Optimum grenstemperatuur ™ (LGO) verbinding medium (VWR Scientific Products, San Diego, CA, USA) in een cryostaat en klikt ingevroren voor microdissectie.}

Cellen en vriescoupeonderzoek slides werden gekleurd vlak voor laser capture microdissectie (LCM) op ijs. In het kort, de secties waren laser gemicrodissecteerde met behulp van een LM200 systeem (Olympus, Japan /Arcturus Engineering Inc, VS). Aandachtsgebieden werden geselecteerd onder microscopische begeleiding, en bedekt met ethyleen vinyl thermoplastische (EVA) film gemonteerd op optisch transparant cap. De infrarood laser werd geactiveerd door een druk op de knop, die de film direct boven de doelcellen smelt. Deze smelt veroorzaakt een binding te vormen tussen de cellen en de transferfolie die sterker zijn dan de binding tussen de cellen en de glijbanen was. De parameters die voor LCM inclusief een laser diameter van 7,5 urn, laservermogen van 50-60 mW. Vijfduizend laserpuls containers per monster werden gebruikt om "vangen" ongeveer 10 000 morfologisch cellen van elk geval. Elke populatie werd geschat op > 95% "homogeen" zoals bepaald door microscopische visualisatie van de gevangen cellen. De doppen met gevangen cellen werden vervolgens gemonteerd op 0,5 ml microcentrifage buizen. Na microdissectie, kan het DNA, RNA of eiwit worden geëxtraheerd uit fracties van gemicrodissecteerd monsters.

methyleringsanalyse

Genomisch DNA verkregen uit de gemicrodissecteerde cellijnen, maagkanker weefsels en plasma (0,2 ml ) werd gezuiverd met behulp DNAzol (Invitrogen). Gezuiverd DNA werd behandeld met natrium bisulfiet (Sigma, Phoenix, USA) en vervolgens geanalyseerd met BSP of specifieke polymerasekettingreactie (MSP) zoals eerder beschreven [13,15]. Bisulfiet geamplificeerde PCR-producten werden gekloneerd in een TA-vector systeem (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. DNA sequentiebepaling werd uitgevoerd op drie afzonderlijke klonen (Sangong). De PCR producten werden bevestigd door agarose gelelektroforese en gevisualiseerd met behulp van ethidium bromide kleuring. De gebruikte primers zijn samengevat in tabel S1.

Electron microscopische waarneming

H. pylori
stammen NCTC11637 (zowel CagA- en VacApositive) werden verstrekt door professor Guo van de afdeling Medische Microbiologie en Parasitologie, Institutes of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H.
pylori stammen werden routinematig gekweekt gedurende 72 uur op Columbia agar (bioMérieux, Frankrijk) met 5% schapenbloed in menglucht met 10% CO _{2, 5% O2 en 85% N 2 bij 37 ° C. Dan, omgerekend we H. pylori
vloeibare medium dat brain hart infusie (BD, VS), 10% schapenbloed en dezelfde antibiotica als die welke in Columbia agar. Het vloeibare medium werd geschud op een shaker (Forma Scientific, VS) met een constante rotatiesnelheid van 120 rpm. H. pylori
werden geteld onder toepassing van een spectrofotometer (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) en gewassen met steriele PBS (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) vóór gebruik. GES-1-cellen (4 x 10 ^{5) werden gekweekt tot confluent op glazen dekglaasjes in platen met zes putjes, en vervolgens werden GES-1 cellen geïnfecteerd met H.
pylori bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100: 1. Na incubatie gedurende 24 uur werden de morfologische veranderingen van GES-1 cellen waargenomen op een H-800 transmissie elektronenmicroscoop.}}

Realtime qRT-PCR-analyse

Gezuiverd totale RNA werd verkregen de gemicrodissecteerde cellen werd totaal RNA geëxtraheerd met behulp van Trizol oplossing. Reverse transcriptie (RT) werd uitgevoerd in een 20-ul reactie volgens aanbevelingen van de fabrikant (Qiagen). Real-time qRT-PCR analyses werden uitgevoerd onder toepassing van primers in Tabel S1 opgesomd. Transcript expressieniveaus werden bepaald door het kwantificeren van de intensiteit van het PCR product genormaliseerd op glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) expressie. Kwantitatieve meting van mRNA niveaus werd uitgevoerd met de ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Deze gegevens werden geanalyseerd met behulp van de vergelijkende werkwijze Ct.

Western blotting

Totaal eiwit werd uit de cellen geëxtraheerd gemicrodissecteerde. Signaaleiwit extractiebuffer 1 systeem (430-7608-MSDS) van Bio-Rad Corporation werd gebruikt voor eiwitextractie in onze experimenten werd gemeten door de DC-eiwit assay methode van Bradford (Bio-Rad). Een totaal van 100 ug eiwit uit elk monster werden gescheiden door 10% SDS-PAGE gel en overgebracht op een geëquilibreerde polyvinylideendifluoridemembraan (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) werden de eiwitten gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) na incubatie met specifiek primair antilichaam VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), en IRX5 (1: 2000) bij 4 ° C geïncubeerd en daarna het secundaire antilichaam. Eiwitniveaus werden genormaliseerd aan totale GAPDH met een monoklonaal anti-GAPDH antilichaam (Sigma) zoals eerder beschreven [15].

Constructie van expressievector voor VEZT en TCF19

VEZT en TCF19 overexpressie vector pEGFP -n1-VEZT en pEGFP-N1-TCF19 werden geconstrueerd met behulp van de overlap PCR of PCR-werkwijze, respectievelijk de voor twee vectoren primers zijn samengevat in tabel S1. De PCR producten werden bevestigd door directe DNA-sequentiebepaling en gekloneerd in de zoogdier expressievector pEGFP-N1 zoals eerder beschreven [15]. MKN-45 en NCI-N87 maagkanker cellijnen werden gebruikt voor de overexpressie studies. We verkregen stabiel getransfecteerde klonen door G418 selectie (Promega). Een stabiele transfectant van de pEGFP-N1 lege vector werd gebruikt als controle. Voor transfectie complexen van Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) en één van de hierboven vermelde plasmiden werd bereid volgens de instructies van de fabrikant en deze complexen werden direct bij een dichtheid van 4 gemengd met cellen in 24-well celkweekplaten × 10 ^{4 cellen per putje. Het niveau van VEZT of TCF19 expressie na transfectie werd bepaald door real-time PCR.}

Invasion, migratie en endotheliale assays buisvorming

Cell invasie, migratie en endotheliale buisvorming assays werden uitgevoerd met behulp MKN -45 en NCI-N87 cellen. Celkweek werd uitgevoerd in transwell kamers (Corning, NY, USA). Voor de invasie assay werden de insert membranen bekleed met verdunde Matrigel (San Jose, CA, USA). Cellen (1 x 10 ^{5) werden aan de bovenste kamer toegevoegd en werden gedurende 48 uur. Voor de migratie test werden het inzetstuk membranen niet bekleed met Matrigel maar werden gekweekt onder dezelfde omstandigheden. Tenslotte werden de insert membranen gesneden en gekleurd met kristalviolet (0,04% in water, 100 ml), en de gemigreerde cellen werden geteld onder een geïnverteerde microscoop en gefotografeerd}

In vitro angiogenese werd bepaald met behulp van een. endotheliale vaatvorming testkit (San Diego, CA, USA). Kort samengevat, voorgekoeld elk putje van 96-putjes werd bekleed met een dunne laag gel ECM. HUVEC's werden geresuspendeerd in supernatanten verzameld van getransfecteerde cellen. HUVECs (2 x 10 ^{4 cellen /putje) werden toegevoegd aan de ECM gepolymeriseerde gel met 300 ml van de supernatanten. Na 18-uur incubatie werd de vaatvorming vermogen geëvalueerd door bepaling van de buisvormige nummer, de buisvormige lengte en het aantal buisvormige kruisende knooppunten in vijf willekeurige velden middels Image Pro Plus software (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) volgens methode Mirshahi's [19].}

Celgroei en zachte agar kolonievorming assay

Maagkanker cellen (2 x 10 ^{3 cellen) werden geïncubeerd met 100 pi kweekmedium 96 -multiwell platen gedurende één dag bij 37 ° C in 5% CO _{2. De cellen werden getransfecteerd met het plasmide van 24, 48, 72, 96 en 120 uur. Het aantal cellen werd gemeten met de celtelling kit-8 (CCK-8) (DOJINDO, Japan). Kort samengevat, CCK-8 (10 pl) werd aan elk putje toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij 37 °, absorptie bij 450 nm werd gemeten met de ARVO MX plaatlezer (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Het aantal cellen werd bepaald door de relatieve absorptie bij 450 nm.}}

Maagkanker cellen getrypsiniseerd om eencellige suspensies van 3 x 10 ^{3 cellen en vervolgens werden uitgeplaat in platen met zes putjes in compleet kweekmedium dat 0,3% agar gelaagd bovenop 0,6% agar. De platen werden geïncubeerd bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO _{2 gedurende 16 dagen. Kolonies bevattende ten minste 50 cellen werden gescoord. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking van vijf willekeurige velden scoorde.}}

tumorgroei in naakt muizen

Cellen (1 x 10 ^{6 cellen in 100 ml) van kankercellen lijnen getransfecteerd met lege vector of een VEZT expressievector werden verzameld en subcutaan geënt in de rechterflank regio's van 4 weken oude mannelijke BALB /c naakt muizen (Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China). Tumoren werden elke 4 dagen gemeten met remklauwen. Muizen werden opgeofferd na 1 maand. Tumor groeicurven en groeiremming werden berekend. Twee muizen werden gebruikt voor de experimentele en controlegroepen en drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [15,16].}

Global cDNA microarray analyse en verificatie doelwitgen

Gezuiverd totaal RNA was verkregen uit de gemicrodissecteerde cellen. Het gehele menselijke genoom oligo microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA) werd gebruikt. Na hybridisatie en wassen werden de microarray dia gescand met een Agilent DNA microarray scanner. De resulterende tekst bestanden uit Agilent Feature Extraction Software (versie 9.5.3) werden ingevoerd in de Agilent GeneSpring GX-software (versie 7.3) voor verdere analyse. Differentieel tot expressie van genen werden geïdentificeerd door middel van fold-change screening. Voor gen verificatie doel gebruikten we real-time PCR en chromatine immunoprecipitatie assay. De primers voor de doelgenen worden in tabel S1.

Flow cytometrische analyse van celcyclus

Eén dag voor transfectie, 1 x 10 ^{6 cellen van MKN-45 cellen werden gezaaid in 6-putjes zonder antibiotica. De cellen werden getransfecteerd met lege vector of TCF19 expressievector. Achtenveertig uur na transfectie werden de cellen geoogst en in 70% ethanol gefixeerd bij -20 ° C overnacht, en vervolgens gekleurd met 250 ug /ml propidiumjodide (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) en 5 mmol /L EDTA in PBS (pH 7,4) gedurende 30 min. De celcyclus-analyse werd uitgevoerd door FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS15.0 software (SPSS Inc., USA). Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking van ten minste drie afzonderlijke experimenten. De correlatie tussen VEZT meningsuiting in de tumoren en clinicopathologic variabelen werd berekend met de Kruskal-Wallis rank test en de Mann-Whitney U test. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met Student's t-test en Chi-kwadraat test. Een waarde van p
< 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

De relatie tussen VEZT expressie niveaus en clinicopathologische factoren bij patiënten met maagkanker

We hebben onderzocht de relatie tussen de VEZT expressie niveaus in 104 gepaarde maag kankerweefsel en clinicopathologische factoren bij patiënten met maagkanker. We vonden dat het expressieniveau van VEZT geassocieerd is met lymfatische metastase, invasie diepte van kanker en TNM (Tabel 1, P
< 0,05). Werden echter VEZT expressieniveaus niet geassocieerd met geslacht, leeftijd, tumorgrootte, celdifferentiatie, grove uiterlijk plaats van de tumor en metastasen.
Factoren
No. van de patiënten
Mean uitdrukking van VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor size < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site van tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth van kanker invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5.41 distale metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Verband tussen VEZT expressie in kanker weefsels en clinicopathologische factoren bij patiënten met maagkanker.
We analyseerden de relatie tussen VEZT expressie in kanker weefsels en clinicopathologische factoren bij maagkanker monsters versus aangrenzend normaal weefsel (n = 104). We vonden dat het expressieniveau van VEZT geassocieerd is met lymfatische metastase, invasie diepte van kanker en TNM (Tabel 1, P
< 0,05). Werden echter VEZT expressieniveaus niet geassocieerd met geslacht, leeftijd, tumorgrootte, celdifferentiatie, grove uiterlijk plaats van de tumor en metastasen #:. TNM, tumor-knoop-metastase; * p
< 0,05. CSV Download CSV

methylatie analyse van de normale maag weefsels, primaire maagkanker weefsels en perifere bloed van maagcarcinoom patiënten en gezonde controles

Op basis van een eerdere studie van ons lab, we gepostuleerd dat de methylering van VEZT promotor was anders in maagcarcinoom patiënten en gezonde controles; we gebruikten online bioinformatica software om het promotorgebied en methylatie status van de VEZT gen (Figuur 1A) geanalyseerd. Onderzochten we de methylatie niveau van de VEZT promotor in 30 weefselmonsters DNA van patiënten met primaire maagkanker weefsels corresponderende plasma DNA en het element met BSP methoden, die de gebieden van -171bp afgedekt -428bp (Figuur 1A). De gemiddelde niveaus van gemethyleerde VEZT in 30 primaire maagkanker weefsels en 30 normale gastrische weefsels waren 67,78 ± 25,90% en 42,42 ± 30,30%, respectievelijk (Figuur 1B). Primaire maagkanker weefsels werden hogere niveaus methylatie in de VEZT promotorgebied dan de gangbare gastrische weefsels (figuur S1 A, Figuur 1B, P < 0,05). Het gemiddelde niveau van gemethyleerde plasma DNA in primaire maagkanker patiënten en gezonde controle gevallen waren 69,00 ± 23,90% en 46,71 ± 26,31%, respectievelijk (figuur 1C). De gemethyleerde niveau van plasma DNA in primaire maagkanker patiënten vertoonden hogere methylatie niveaus in de VEZT promoter regio in vergelijking met gezonde controle case (figuur S1B, figuur 1C, P < 0,05). Aldus werd significant methylering waargenomen in de maagkanker vergeleken met gezonde controles. Het niveau van gemethyleerde VEZT in weefsels en plasma zou kunnen dienen als een moleculaire marker voor maagkanker.

H. pylori
infectie induceert de methylering en silencing van VEZT

Een aanzienlijk aantal studies gepubliceerd waaruit blijkt dat H. pylori
infectie is een onafhankelijke risicofactor voor methylatie [20,21,22]. Daarom nemen we aan dat H. pylori
veroorzaakt VEZT methylatie en vervolgens carcinogenese. Eerst onderzochten we de methylatie niveau van de VEZT promoter in het DNA van 23 weefselmonsters van patiënten met H. pylori
-positieve chronische gastritis en de controles met behulp van BSP en MSP methoden, die de regio's -171bp afgedekt om -428bp en -342 bp tot -513 bp, respectievelijk (figuur 1A). De gemiddelde methylatie niveaus van het VEZT promotor in H. pylori
-positieve en de controle waren 75,74 ± 28,16% en 31,20 ± 25,67%, respectievelijk. Aldus is een significant verschil in methylering waargenomen in de H. pylori
-positieve chronische gastritis groep vergeleken met de controlegroep ( P
< 0,01, Figuur 2A). Het promotorgebied van VEZT werd gemethyleerd algemeen bij patiënten met chronische gastritis volgens MSP analyse (Tabel S2); echter, vonden we vier gevallen van H. pylori
-positieve chronische gastritis die relatief niet-gemethyleerd waren. We zagen 19 gevallen van H. pylori
-positieve chronische gastritis die Hypermethylering weergegeven (tabel S2). Of H te bepalen. pylori
infectie induceert promoter methylering van de VEZT gen In vitro
, ontdekt dat we H.
pylori infectie geassocieerd met de expressie van IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 en IRX5 eiwit na H.
pylori infectie en gedurende 24 uur in GES-1-cellen met behulp van Western blotting. Onze resultaten toonden H. pylori
infectie bevorderde de expressie van IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 en IRX5 eiwit en H. pylori
infectie was succesvol in het GES-1-cellen (Figuur 2B, 2C). Om verder te bevestigen dat dat H. pylori
infectie is inderdaad verantwoordelijk voor de methylering of silencing van VEZT, analyseerden we de promotor methylatie status van VEZT in GES-1 cellen door MSP en BSP. Zoals getoond in figuur 2D en 2E, de promotor van VEZT werd hypermethylatie in H. pylori
geïnfecteerde GES-1-cellen, maar unmethylation werd waargenomen in cellen niet-geïnfecteerde met H.
pylori (figuur 2D en E). Het eiwit expressie niveau van VEZT was ook lager in de H. pylori
geïnfecteerde cellen dan in niet-geïnfecteerde cellen met H.
pylori (figuur 2C).

Functionele analyse na het herstellen VEZT expressie in vitro

De frequente silencing of downregulatie van VEZT bij maagkanker cellijnen suggereert dat het waarschijnlijk een tumor-suppressor gen in onze vorige studie. Om dit moment testen we gescreend VEZT expressie in verscheidene maagkanker cellijnen door real-time PCR en Western blot. VEZT verschillende expressieniveaus werden gevonden in zes cellijnen geanalyseerd (Figuur 3A). We construeerden een pEGFP-N1-VEZT expressievector en getransfecteerd pEGFP-N1 vector in de maagkanker cellijn MKN-45 en NCI-N87, die geen of lage niveau van VEZT expressie vertoonde. Na transfectie, onderzochten we de expressie van VEZT in deze cellijnen door real-time PCR, waaruit bleek dat het transcript expressieniveau van VEZT werd opgereguleerd 41,99-voudig (Figuur 3B, P < 0,01) in deze cellijnen vergeleken de controle getransfecteerde cellen. We onderzochten ook de capaciteit van maagkanker cellen overexpressie VEZT binnen te vallen en te migreren door de transwell invasie en migratie assays (figuur 3C). Het invasieve vermogen van MKN-45 cellen in de VEZT /N1 groep was significant verminderd in vergelijking met de controle getransfecteerde cellen (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45, P
< 0,001). Het aantal MKN-45 cellen in de VEZT getransfecteerde monster gemigreerde via transwell insert was significant verminderd in vergelijking met de controle getransfecteerde cellen (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42, P
< 0.001).

HUVEC's werden gesuspendeerd in supernatanten verzameld uit de controle en VEZT /N1. Na 18-uur incubatie, het supernatant geoogst VEZT /N1 cellen vertoonden een sterk remmend effect op de vorming van buisvormige structuren door HUVEC's met betrekking tot het aantal, de lengte en kruisende knooppunten vergelijking met de controlegroep (figuur 3C). Zoals getoond in figuur 3D, de celgroei van MKN-45 cellen werd significant onderdrukt bij het herstel van VEZT expressie ten opzichte van de controlegroep ( P
< 0,05). Om de reproduceerbaarheid van onze bevindingen onderzoeken, onderzochten we het vermogen van NCI-N87 maagkanker cellen binnendringen, migreren en vormen buisvormige structuren op VEZT overexpressie. Deze resultaten kwamen overeen met die in MKN-45 kankercellen beschreven die suggereren dat VEZT een belangrijke remmende rol in de invasie, migratie en buisvormige van kankercellen.

Effect van overexpressie VEZT op de tumorigeniciteit van kanker cellen in naakt muizen

Expressie van VEZT onderdrukte de groei van zowel MKN-45 en NCI-N87 door CCK-8 assay in vergelijking met de controlegroep (figuur 3D, P < 0,05). Deze bevinding werd bevestigd door kolonievorming assay, door het kweken van maagkanker cellen op zachte agar na transfectie met een vector VEZT-overexpressie. Kolonievorming tarieven van MNK-45-cellen waren 13,56 ± 0,53% in de VEZT /N1-groep en 1,2 ± 0,31% in de controlegroep ( P
< 0,001, figuur 4E). De kolonie vorming tarief van NCI-N87 cellen vertoonde een soortgelijke trend. Vervolgens hebben we het effect van overexpressie VEZT op tumorgroei onderzocht door het enten MKN-45 of NCI-N87 /N1 en VEZT /N1 cellen subcutaan in de rechterflank gebieden van naakt muizen. Tumorgeniciteit werd significant verminderd bij VEZT-getransfecteerde cellen. Snelle tumorgroei werd waargenomen in de controlegroep na 1 maand (Figuur 4F). De tumor onderdrukkende rol van VEZT expressie bleek in beide geteste kankercellijnen (Figuur 4G, P < 0,01), wat suggereert dat VEZT onderdrukt de tumorigeniciteit van kankercellen. Deze resultaten geven aan dat de expressie van VEZT remde de tumorigeniciteit van maagkanker zowel In vitro Kopen en In vivo
.

Identificatie van target genen na VEZT gentransfectie

Om het moleculaire mechanisme achter het remmende effect van VEZT op cellen invasie, groei, migratie en tumorigeniciteit van maagkanker helderen. We analyseerden de genoom-brede transcriptoom profiel van MKN-45 /N1 en VEZT /N1 cellen door Agilent oligo microarray. Volgens fold-change (> 3,0), screening tussen MKN-45 /N1 en VEZT /N1 cellen, vonden we 193 opgereguleerd genen en 135 gedownreguleerd genen (Tabel S3). We zochten genen die overlapt met kanker-geassocieerde en moleculaire functiegerelateerde gen sets in MSigDB (C4 en C5-gen sets; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp). Wij selecteerden 49-kanker-geassocieerde genen die 23 opgereguleerd genen en 26 gedownreguleerd genen voor cluster in kaart brengen op de MeV microarray-analyse platform (www.tm4.org/mev.html, Figuur 4A) omvatten. Real-time PCR werd uitgevoerd ter verificatie van deze genen (Tabel S4) en bevestigden onze microarray resultaten voor 8 gereguleerd genen en genen 10 downgereguleerd (figuur 4B). Het gen namen en functionele annotaties worden in Tabel S5. Om te bepalen of deze direct doelwit genen van VEZT, voerden we chromatine immunoprecipitatie assays met behulp van VEZT antilichaam en vervolgens de getrokken-down DNA geanalyseerd. We identificeerden drie genen neerwaarts gereguleerd, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) en GPR56 (NM_001145770) directe VEZT doelen (Figuur 4C).

De correlaties tussen VEZT en benedenstroomse targets, en hun associatie met de remming van maagkanker cellen invasie, groei, migratie en de tumorigeniciteit van maagkanker in vitro Kopen en in vivo
, werden weergegeven in figuur 5C. pylori
infectie.

• PLoS ONE: De identificatie en karakterisering van nieuwe N-glycan-gebaseerde Biomarkers bij maagkanker
• PLoS ONE: Een genetisch polymorfisme in TOX3 wordt geassocieerd met overleving van maagkanker in een Chinese bevolking