PLoS One: VEZT, a Novel feltételezett tumor szupresszor, meggátolja a növekedési és tumorgenézisre Gyomorsav Cancer

absztrakt katalógusa

Vezatin (VEZT), egy adherens csomópontok transzmembrán fehérje, azonosították a feltételezett tumor szupresszor a korábbi tanulmány. Azonban a szerepe a tumorok VEZT megfoghatatlan marad. Célul tűztük ki, hogy tisztázza a epigenetikai szabályozása és biológiai funkciója gyomorrákban. Ebben a tanulmányban azt mutatják, hogy az expressziós szintet VEZT van részt limfatikus metasztázis, mélysége a rák terjedését és TNM-beosztása 104 gyomor rákos betegeknél. Hidrogén-szulfát szekvenálás polimeráz láncreakció (BSP) módszerekkel kimutatták, hogy VEZT hipermetilációját szövetekben és a megfelelő vér a gyomor rákos betegek, valamint egészséges. Helicobacter pylori katalógusa ( H. Pylori katalógusa) fertőzés indukál a metiláció és elhallgattatása VEZT a GES-1 sejtekben. Visszaállítása VEZT expresszió MKN-45 és az NCI-N87 gyomorrák gátolt sejtek növekedése, inváziója és a tumorgenezis in vitro és in vivo katalógusa. Globális microarray analízist alkalmaztunk, hogy elemezze a molekuláris alapját a biológiai funkcióit VEZT után VEZT transzfekció kombinálva valós idejű PCR-rel és a kromatin immunprecipitációs vizsgálattal. G-fehérjéhez kapcsolt receptor 56 (GPR56), a sejtek növekedését, a sejtosztódás ciklus 42 (CDC42), a migráció /invázió és transzkripciós faktor 19 (TCF19), a sejtciklus progressziójában, azonosítottak közvetlen VEZT célgének. TCF19, új cél VEZT volt funkcionálisan érvényesített. Túlexpressziója TCF19 az MKN-45 sejtek fokozott sejtciklus fejlődés és a növekedés képességét. Ez a tanulmány olyan új betekintést a szabályozás a VEZT gén, ami jelenthet potenciális célpontja terápiás rákellenes stratégiák. Katalógusa

Citation: Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, a Novel feltételezett tumor szupresszor, meggátolja a növekedési és tumorgenézisre a gyomorrák. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409 katalógusa

Szerkesztő: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japán katalógusa

Beérkezett: április 1, 2013; Elfogadva: augusztus 1, 2013; Megjelent: szeptember 17, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Miao et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka részben támogatta a támogatást a Nemzeti Fiatalos Science Foundation of China (81101858), a Természettudományi Alapítvány Shandong tartomány Kína (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), fő kutatási projekt a Shandong Tudományos és Technológiai Bizottság (2011GGB14158, 2007H2071) a fiatalos Science Foundation Shandong tartomány Kína (BS2010YY060). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a második vezető oka a férfi rák okozta halál és a harmadik vezető oka a női rák okozta halál világszerte [1]. Ez egy jelentős közegészségügyi probléma az egész világon [2]. Kínában vannak 400.000 új esetet a gyomorrák és 300000 ember halálát okozza évente. Sok esetben, akik szenvedtek gyomorrák elvesztette gyógyító esélye rendkívül rossz prognózist jelent [3]. Ezért fejlődő új és hatékony terápiás eljárások alapvető fontosságú, hogy csökkentse gyomorrák halálozás. Már ismert, hogy a patogenezisében gastricus karcinómák multifaktoriális, amely magában foglalja a genetikai hajlam és a környezeti tényezők. Számos genetikai váltakozás beleértve a tumor szuppresszor gének, onkogének, sejt adhéziós molekulák és növekedési faktorok [4].

Bár a molekuláris mechanizmusok a gyomor karcinogenezis továbbra is tisztázatlanok, epigenetikus csendesítése tumorral kapcsolatos gének promóter hipermetiláció nemrégiben alakult ki, mint egy fontos mechanizmus a tumorigenezis. A promoter hipermetiláció profil eltér az egyes daganatok és az egyes gén, amely a tumor típus és gén-specifikus hipermetiláltsági profilok járhatnak, a megfelelő molekuláris mechanizmusa tumorogenezisben. Az egy újonnan azonosított gén által megcélzott promoter hipermetilációt nyújthat betekintést mechanizmusok inaktiválása tumor-elnyomó utak és az azonosításhoz szükséges tumormarkerek gyomorrákban [5,6]. Katalógusa

A közelmúltban , már azonosították, egy adherens csomópontok transzmembrán fehérje, VEZT jelöltként tumor-szuppresszor gén. Célunk az volt, hogy tisztázza a epigenetikai szabályozása és biológiai funkciója VEZT gyomorrákban. VEZT, a mindenütt jelenlévő szerves fehérjét tartalmaz, közvetve kapcsolódó E-cadherin-catenin komplex és az aktin citoszkeleton [7,8]. Feladatai elsősorban arra feltárt hámsejtek. Elvesztése VEZT fokozatmentesen káros embrionális fejlődés [9,10], és VEZT kritikus integritásának megőrzése a sejtkapcsoiattai a hosszú távú mechanikai igénybevételnek előforduló szintjén belső fül szőrsejtek hang hatására. Továbbá, a belső fül-specifikus VEZT feltételes érvénytelenítés vezet progresszív süketség [7]. VEZT erősen expresszálódik az agyban [8,11]. VEZT dúsított dendrittüskéket egér hippokampusz neuronok. Használata VEZT knock-down és feltételes knockout előtt (D6cre) vagy után (CamKIIαcre) születés, VEZT szabályozza gerinc morfológiáját. A morfológiai elváltozások nem társulnak károsodott szinaptikus kapcsolatok, de a posztszinaptikus VEZT kritikus szerepet játszik a morfológiai és funkcionális érését serkentő posztszinaptikus elemek [12]. Katalógusa

inaktiválása a VEZT gént azonosítottak gyomorrák, és a metilezése CpG-szigetek belül a promoter régió a VEZT gén hozzájárulhat annak inaktivációja által meghatározott egy korábbi tanulmány szerint mi labor [13]. A mechanizmus a metiláció és a pontos szerepe VEZT a gyomorrák kialakulásával jelenleg ismeretlen. A megcélzott gének, valamint a kapcsolódó utak VEZT még nem azonosították. Ebben a vizsgálatban szisztematikusan elemeztük a mechanizmus a metiláció és metilációs állapotát a promoter a VEZT gént. Azt is elemezték annak funkcionális feloldása után VEZT kifejezés in vitro és in vivo katalógusa.

Anyagok és módszerek katalógusa

sejtvonalak és szövetminták katalógusa

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, a halhatatlanná tett humán gyomornyálkahártya-sejtvonal GES-1 (amelyet az intézet emésztési műtét Ruijin kórházi kapcsolt Shanghai Jiao Tong Egyetem) [13,14,15,16,17] és humán köldökzsinór véna endotél sejtek (HUVEC) tartósított intézetünkben. A gyomor rákos sejtvonalak SNU-1 és az NCI-N87 sejteket az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Röviden, a sejteket RPMI1640, kiegészítve 10% magzati borjú szérumot és 2 mM L-glutamin. A sejteket 37 ° C-on jelenlétében, 5% CO _2.

Elsődleges gyomor tumor és a normális a gyomor nyálkahártya szöveteket gyűjtöttünk vagy rutin terápiás műtét vagy gastrointestinalis endoszkópia tanszékünkön. A maradék volt H. pylori katalógusa fertőzési állapot alapján meghatározzuk a gyors ureáz teszt leírtak szerint [18]. katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

írásos beleegyező nyilatkozatot a vizsgálat kapott minden résztvevő számára. 4-hetes hím BALB /c csupasz egereket szereztünk a kísérleti állat Központ Kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína), és tartani az Animal Laboratory Center a tartományi kórház csatlakozott a Shandong Egyetem (Jinan, Kína) a 12/12 óra világos /sötét ciklusokban (a világítást le 19: 00), a táplálék és víz rendelkezésre adlibitum. Az állatkísérletek jóváhagyta az Institutional Animál Care and Use bizottság a tartományi kórház csatlakozott a Shandong Egyetem (engedély száma: SHANS87492). A vizsgálati protokollt jóváhagyta az etikai bizottság a tartományi kórház csatlakozott a Shandong Egyetemen. Katalógusa

feldolgozása lézermikrodisszekciós a szövetek és sejtek katalógusa

A szöveteket eltávolítjuk a lehető leghamarabb a műtét után, és rögzíteni formalin, paraffinba ágyaztuk, és vágjuk 8-um vastag metszeteket a hematoxilin-eozin (H &E) festéssel. Minden szövetet szövettani vizsgálatot, és tapasztalt patológusok megerősítette a diagnózist. Egy része egyes minták ágyazva Tissue-Tek ^{® optimális vágási Hőmérséklet ™ (TOT) vegyület közepes (VWR Scientific Products, San Diego, CA, USA) egy kriosztát, és bekattan lefagyasztjuk mikrodisszekció.}

Cells és fagyasztott metszet metszeteket festettük előtt lézeres leválasztás mikrodisszekcióban (LCM) jégen. Röviden, a metszeteket lézer mikrodisszektált egy LM200 rendszer (Olympus, Japán /Arcturus Engineering Inc, USA). Témák választottak ki mikroszkopikus útmutatást, és a fedett etilén-vinil lágyuló (EVA) film szerelt optikailag átlátszó kupakkal. Az infravörös lézer által aktivált gombnyomásra, ami megolvasztja a film felett közvetlenül a megcélzott sejtek. Ez olvadék okozott kötési alkotnak a sejtek között, és az átviteli film erősebb volt, mint a kötődést az sejtek és a tárgylemezeket. A használt paraméterek LCM tartalmazza a lézer átmérője 7,5 um, lézer teljesítmény 50-60 mW. Ötezer lézer impulzus kibocsátás egyedenként használtak "capture" mintegy 10 000 morfológiailag sejtek minden esetben. Mindegyik populáció becsülték > 95% "homogén" által meghatározott mikroszkopikus megjelenítés a rögzített sejteket. A kupak elfogott sejteket ezután ráillesztjük 0,5 ml microcentrifage csövek. Miután mikrodisszekció, a DNS-t, RNS-t vagy fehérjét lehet kivonni aliquot mikrodisszektált mintákban.

A metilezési analízist

genomiális DNS-t nyert mikrodisszektált sejtvonalak, gyomorrák szövetek és a plazma (0,2 ml ) tisztítottunk DNAzol (Invitrogen). A tisztított DNS-t kezelünk nátrium-biszulfittal (Sigma, Phoenix, USA), majd elemezzük a BSP vagy specifikus polimeráz láncreakció (MSP) a korábban leírtak [13,15]. Az amplifikált biszulfit PCR-termékeket szubklónoztuk egy TA vektor rendszer (Promega) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. DNS-szekvenálást végeztünk három egyedi klónok (Sangong). A PCR-termékeket megerősítette agaróz gél elektroforézissel és láthatóvá, etidium-bromid festéssel tettük láthatóvá. Az alkalmazott primerek táblázat foglalja össze S1. Katalógusa

Az elektronmikroszkópos megfigyelés katalógusa

H. pylori törzsek katalógusa NCTC11637 (mind CagA- és VacApositive) biztosította professzor Guo Tanszék Orvosi Mikrobiológiai és parazitológiai, Institutes of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine. H. pylori
törzseket tenyésztettük rutinszerűen 72 órán Columbia agar bázis (bioMérieux, Franciaország), 5% -os birka vér kevert levegő, amely 10% CO _{2, 5% O2, 85% N 2 at 37 ° C-on. Aztán, mi alakítjuk H. pylori
folyékony közegben, amely agy-szív infúziós (bd, U.S.), 10% juh vér, és ugyanaz a antibiotikumok, mint amelyeket a Columbia agar bázis. A folyékony közeget rázzuk rázógépen (Forma Scientific, USA) egy állandó forgási sebessége 120 rpm-en. H. pylori
megszámoltuk egy spektrofotométer segítségével (BioSpec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japán), és kimostuk steril PBS-sel (pH = 7,4, 5000 rpm, 10 perc) a használat előtt. GES-1 sejteket (4 × 10 ^{5) növesztettük, amíg egybefolyó üveg fedőlemezeket hat lyukú lemezeken, majd GES-1-sejteket fertőztünk H. pylori
egy multiplicity of infection (MOI) 100: 1. Az inkubálás után 24 órán, a morfológiai változásait GES-1 sejtek észleltek a H-800 transzmissziós elektronmikroszkóp.}}

Valós idejű QRT-PCR analízis

A tisztított teljes RNS-t kaptunk a mikrodisszektált sejtek teljes RNS-t extraháltunk Trizol megoldás. Reverz transzkripció (RT) végeztünk egy 20 nl-es reakció szerint a gyártó ajánlásai (Qiagen). Real-time QRT-PCR analízist primerek alkalmazásával táblázatban felsorolt ​​S1. Transcript expressziós szinteket határoztuk meg mennyiségileg az intenzitás a PCR-termék normalizáltuk gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) expressziót. Kvantitatív mérése mRNS szintek végeztünk ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Ezeket az adatokat elemeztük használatával az összehasonlító Ct módszer.

Western blot

Összes fehérje kivontuk a mikrodisszektált sejteket. Signal Protein Extraction 1 puffer rendszer (430-7608-MSDS) Bio-Rad Corporation alkalmaztunk Protein Extraction Kísérleteink és mértük az egyenáramú fehérje-assay Bradford módszerével (Bio-Rad). Összesen 100 ug fehérje minden mintából elválasztottuk 10% SDS-PAGE gélen és átvisszük egy ekvilibrált polivinilidén-difluorid-membránra (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Egyesült Királyság) A proteineket detektáltuk fokozott kemilumineszcencia (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) való inkubálás után specifikus elsődleges antitesttel VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), Akt (1: 1000), Cag a (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), és IRX5 (1: 2000), 4 ° C-on egy éjszakán át, majd a szekunder antitesttel. Fehérje szintje normalizáltuk teljes GAPDH egy monoklonális anti-GAPDH ellenanyag (Sigma) a korábban leírtak [15].

Építőipari expressziós vektor VEZT és TCF19

VEZT és TCF19 overexpressziója pEGFP vektorba -N1-VEZT és pEGFP-N1-TCF19 épültek segítségével az átfedés PCR vagy PCR módszerrel, illetve és a használt primereket két vektor táblázat foglalja össze az S1. A PCR-termékeket igazoltuk közvetlen DNS-szekvenálással és klónoztuk emlős expressziós vektorba pEGFP-N1 a korábban leírtak [15]. MKN-45 és az NCI-N87 gyomorrák sejtvonalakat használtuk a overexpressziója vizsgálatokban. Kaptunk stabilan transzfektált klónok G418 (Promega). A stabil transzfektáns a pEGFP-N1 üres vektort használtuk kontrollként. A transzfekcióhoz, komplexei Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, Carisbad, USA), és az egyik a plazmidok fent említett szerint állítottuk elő a gyártó utasításai, és ezek a komplexek közvetlenül összekeverjük sejteket 24-lyukú sejttenyésztő lemezekre sűrűséggel 4 × 10 ^{4 sejt per lyuk. A szint VEZT vagy TCF19 kifejezés transzfekció után mértük real-time PCR. Katalógusa}

Invasion, a migráció és az endothel csőképződésre esszék katalógusa

Cell invázió, a migráció és az endothel csőképződésre vizsgálatokat végeztünk MKN -45 és NCI-N87 sejteket. Sejtkultúra végeztünk Transwell kamrák (Corning, NY, USA). Az inváziós vizsgálati eljárás, a betét membránokat vontunk be hígított Matrigel (San Jose, CA, USA). A sejteket (1 × 10 ^{5) adtunk a felső kamrába, és tenyésztettük 48 órán át. A migrációs assay, a betét membránokat nem bevonva Matrigel de tenyésztettük azonos körülmények között. Végül a betétet membránokat vágtunk, és megfestettük kristályibolyával (0,04% -os vizes; 100 ml), és az átállított sejteket megszámláltuk egy invertált mikroszkóp alatt, és lefényképeztük.}

In vitro angiogenezis értékelték alkalmazásával endoteliális csőképződést assay kit (San Diego, CA, USA). Röviden, minden egyes lyukába előhűtött 96 lyukú tenyésztő lemezek bevonunk egy vékony réteg ECM gél. HUVEC-ben újraszuszpendáltuk felülúszókat gyűjtöttünk transzfektált sejtekben. HUVEC (2 × 10 ^{4 sejt /lyuk) adunk a polimerizált ECM gél 300 ml a felülúszókat. Miután 18-órás inkubálás után a csövet kialakítási képességét úgy értékeljük ki, meghatározzuk a cső alakú szám, a cső alakú hosszát és számát csőszerű metsző csomópontok öt random területeken az Image Pro Plus szoftvert (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) szerint hogy Mirshahi módszerével [19].}

sejtnövekedést és lágy-agar telepképző assay

Gyomorrák sejtek (2 × 10 ^{3 sejt) inkubáltunk 100 pl táptalajban 96 -multiwell lemezeket egy napon át 37 ° C-on, 5% CO _{2. A sejteket transzfektáltunk a plazmid 24, 48, 72, 96, és 120 óra. Cell szám alkalmazásával értékeltük a sejt számlálás kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japán). Röviden, a CCK-8 (10 jil) adunk az egyes lyukakhoz. 1 óra múlva az inkubálást 37 ° C, az abszorbancia 450 nm-en mértük az ARVO MX lemezleolvasó (Perkin-Elmer, Massachusetts, USA). A sejtek számát határoztuk meg a relatív abszorbancia 450 nm-en.}}

Gyomorrák sejteket tripszinizáltuk, hogy egysejtű szuszpenziókat 3 x 10 ^{3 sejteken, majd vittük hat lyukú lemezekre komplett táptalajhoz 0,3% agart tartalmazó tetejére rétegezzük 0,6% agart tartalmaz. A lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on jelenlétében, 5% CO _{2 16 napig. A telepeket, amelyek legalább 50 sejtet pontoztuk. Az adatokat átlag ± standard deviáció, öt, véletlenszerűen lőtt mezőket.}}

tumor növekedését csupasz egerekben

sejteket (1 × 10 ^{6 sejt 100 ml) a rákos sejtek vonalak transzfektált üres vektor vagy VEZT expressziós vektort összegyűjtjük és szubkután oltottuk be a jobb szélről régiói 4-hetes hím BALB /c csupasz egerek (kínai Tudományos Akadémia, Shanghai, Kína). Tumorcsomók mértük minden 4. napon tolómércével. Az egereket leöltük, 1 hónap elteltével. A tumornövekedést görbék és növekedés gátlás aránya számoltunk. Két egereket használtunk a kísérleti és a kontroll csoport, és három független kísérletet végeztünk a korábban leírtak [15,16].}

Globális cDNS microarray elemzés és a megcélzott gén hitelesítési

Tisztított teljes RNS volt nyert mikrodisszektált sejteket. Az egész emberi genom oligonukleotid microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA) használtunk. Hibridizáció és mosás, a microarray metszeteket szkennelt Agilent DNS chip szkennert. A kapott szöveges fájlokat kivont Agilent Feature Extraction Software (version 9.5.3) hozták be az Agilent GeneSpring GX software (version 7.3) további elemzésre. Differenciáltan expresszálódó géneket azonosítottak kinyitható változás szűrés. A megcélzott gén ellenőrzés használtuk real-time PCR és a kromatin immunprecipitációs vizsgálattal. A primereket a megcélzott gének táblázatban felsorolt ​​S1.

áramlási citometriás elemzését sejtciklus

Egy nap a transzfekció előtt, 1 × 10 ^{6 sejt a MKN-45 sejteket oltottunk a 6-lyukú tenyésztő lemezeken antibiotikumok nélkül. A sejteket transzfektáltuk üres vektorral, vagy egy TCF19 expressziós vektor. Negyvennyolc órával a transzfekció után a sejteket összegyűjtöttük és a rögzített 70% -os etanollal -20 ° C-on egy éjszakán át, majd megfestettük 250 ng /ml propidium-jodidot (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNáz A-t (Sigma-Aldrich) és 5 mmol /l EDTA-t tartalmazó PBS-ben (pH = 7,4) 30 percig. A sejtciklus elemzést végeztük FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).}

Statisztikai analízis

Statisztikai analízist SPSS15.0 szoftver (SPSS Inc., USA). Az adatokat átlag ± szórás legalább három külön kísérletben. A korreláció VEZT kifejezést a daganatok klinikopatológiai változókat számoltuk a Kruskal-Wallis rank teszt és Mann-Whitney U teszt. Csoportok közötti különbségeket elemeztük Student-féle t-teszt és a Chi-négyzet próba. Ha az érték p katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

viszony VEZT expressziós szintek és a klinikopatológiai faktorok gyomorrákos betegeknél katalógusa

Megvizsgáltuk a kapcsolatát VEZT expressziós szintek 104 páros gyomor- rák szövetek és klinikopatológiai faktorok gyomorrákos betegeknél. Azt találtuk, hogy az expresszió szintjét VEZT társult jelentősen limfatikus metasztázis, mélysége a rák terjedését és TNM-beosztása (1. táblázat, P
< 0,05). Azonban VEZT expressziós szintek nem mutattak összefüggést a nemmel, az életkor, a tumor mérete, a sejt differenciálódás, bruttó megjelenése, helyén tumor, illetve távoli áttét. Katalógusa tényezők katalógusa No. A betegek átlagos katalógusa kifejezése VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year)<654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor méret < 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site a tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth rák invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 disztális metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. közötti kapcsolat VEZT expressziós szinteket rákos szövetekben klinikopatológiai tényezők gyomorrákos betegeknél. katalógusa elemeztük közötti VEZT expressziós szinteket rákos szövetek és klinikopatológiai faktorok gyomorrákban mintákban versus szomszédos normál szövetben (n = 104). Azt találtuk, hogy az expresszió szintjét VEZT szignifikáns összefüggést limfatikus metasztázis, mélysége a rák terjedését és TNM-beosztása (1. táblázat, P
< 0,05). Azonban VEZT expressziós szintek nem mutattak összefüggést a nemmel, az életkor, a tumor mérete, a sejt differenciálódás, bruttó megjelenése, helyén tumor, illetve távoli áttét. #: TNM, tumor-node-metasztázis; * p katalógusa < 0.05. CSV letöltése CSV

Metiláció elemzése normális gyomor- szövetek primer gyomorrák szövetek és perifériás vért a gyomor karcinóma betegek és egészséges kontrollok

alapján a korábbi tanulmány a mi Lab, azt feltételezték, hogy a metilezést a VEZT promoter más volt gyomorrák betegek és egészséges kontroll; használtuk az online bioinformatikai szoftver elemzi a promoter régió és metilációs állapotát VEZT gén (1A). Megvizsgáltuk a metilációs szintje VEZT promoter 30 szövetminta DNS-betegek primer gyomorrák szövetek megfelelő plazma-DNS és a vezérlés BSP módszereket, amelyek között a régiók -171bp hogy -428bp (1A). Az átlagos metilezett szintje VEZT 30 primer gyomorrák szövetek és 30 normál gyomor szövetek voltak 67,78 ± 25,90% és 42,42 ± 30,30% volt (1B). Elsődleges gyomorrák szövetekben magasabb volt a metilációs szintek a VEZT promoter régió, összehasonlítva a normál gyomor szövetekben (S1A, ábra az 1B, a P < 0,05). Az átlagos denaturált a vérplazma DNS primer gyomorrákos betegek és egészséges kontroll esetek 69,00 ± 23,90% és 46,71 ± 26,31% -kal (1C). A metilezett szintje a plazma-DNS primer gyomor rákos betegeknél magasabb volt a metilációs szintek a VEZT promoter régió, összehasonlítva az egészséges kontroll esetében (ábra S1B, ábra 1C, a P < 0,05). Így jelentős metiláció volt megfigyelhető a gyomorrák csoport egészséges kontrollokhoz képest. A szint denaturált VEZT a szövetekben és a plazmában szolgálhat a molekuláris marker gyomorrák. Katalógusa

H. pylori fertőzés katalógusa indukálja metiláció és elhallgattatása VEZT katalógusa

A jelentős számú tanulmányt tettek közzé annak bemutatását, hogy H. pylori fertőzés katalógusa független kockázati tényezője metilációs [20,21,22]. Ezért azt feltételezzük, hogy H. pylori katalógusa okoz VEZT metiláció és később kialakulásában. Az első, megvizsgáltuk a metiiációs szintjét az VEZT promoter a DNS-ben a 23 szövetminta betegek H. pylori-pozitív katalógusa krónikus gyomorhurut és a kontrollok BSP és MSP módszerek, amelyek között a régiók -171bp hogy -428bp és -342 bp -513 bp volt (1A ábra). Az átlagos metilációs szintje az VEZT promoter H. pylori
-pozitív, és a vezérlő voltak 75,74 ± 28,16% és 31,20 ± 25,67% volt. Így egy jelentős különbség a metiláció figyeltünk meg a H. pylori-pozitív katalógusa krónikus gyomorhurut csoportban, mint a kontroll csoportban ( P katalógusa < 0,01, 2A ábra). A promoter régió VEZT általában metilezzük krónikus gyomorhurut szerinti MSP elemzés (táblázat S2); ugyanakkor azt mutatta, négy esetben a H. pylori-pozitív
krónikus gyomorhurut, amelyek viszonylag metilálatlanok. Megfigyeltük 19 esetben H. pylori-pozitív katalógusa krónikus gyomorhurut, hogy megjelenik hipermetiláltsági (táblázat S2). Annak megállapítására, hogy H. pylori fertőzés katalógusa indukál promoter metiláció a VEZT gén in vitro katalógusa, észrevettük, hogy H. pylori
fertőzés kapcsolatban voltak az IL-6, Akt, a TNF-а, IL-8, ATF3 és IRX5 fehérje után H. pylori
fertőzés és 24 órán át inkubáltuk a GES-1-sejtekben használva Western-blottal. Eredményeink azt mutatták, H. pylori
fertőzés elősegítette az IL-6, Akt, a TNF-а, IL-8, ATF3 és IRX5 fehérje és H. pylori
fertőzés sikeres volt GES-1 sejtekben (2B, 2C). Ahhoz, hogy tovább erősítse meg, hogy, hogy a H. pylori fertőzés katalógusa valóban felelős a metiláció vagy elhallgattatása VEZT, elemeztük a promóter metilációs állapotát VEZT a GES-1 sejtek MSP és BSP. Ábrán látható módon a 2D és 2E, a promotere VEZT volt hipermetiláció H. pylori katalógusa-fertőzött GES-1 sejtek, de unmethylation volt megfigyelhető a sejteket nem fertőzött a H. pylori
(2D, ábra, és E). A fehérje expressziós szintje VEZT szintén alacsonyabb volt H. pylori
-fertőzött sejtekben, mint a sejtek nem fertőzött a H. pylori katalógusa (2C ábra). katalógusa

A funkcionális elemzés visszaállítása után VEZT kifejezés in vitro katalógusa

A gyakori hangtompító vagy downregulációját VEZT gyomorrákban sejtvonalak arra utal, hogy valószínűleg egy tumor szuppresszor gén a korábbi tanulmány. Annak érdekében, hogy teszteljék ezen a ponton, árnyékolt VEZT expresszió több gyomor rákos sejtvonalakban valós idejű PCR és Western-blottal. Különböző VEZT expressziós szinteket találtak a hat sejtvonalat analizáltuk (3A ábra). Megkonstruáltuk pEGFP-N1-VEZT expressziós vektor és transzfektált pEGFP-N1 vektorba a gyomorrák sejtvonal MKN-45 és az NCI-N87, ami nem mutatott vagy alacsony szintje VEZT kifejezés. A transzfekciót követően megvizsgáltuk expresszióját VEZT e sejtvonalakban real-time PCR, ami azt mutatta, hogy a transzkriptum expressziós szintje VEZT volt, akár szabályozott 41.99-szeres (3B, ábra, a P < 0,01) ezekben a sejtvonalakban összehasonlítva az ellenőrző-transzfektált sejtekben. Megvizsgáltuk a képességét gyomorrák sejtek fokozottan expresszáló VEZT betörni vándorolnak a transzwell invázió és migrációs assay (3C, ábra). Az invazív képességét MKN-45 sejtek VEZT /N1 csoport szignifikánsan csökkent, összehasonlítva a kontroll transzfektált sejtek (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45, P katalógusa < 0,001). Száma MKN-45 sejtek VEZT transzfektált minta vándorolt ​​át a transzwell betét is jelentősen csökkent, összehasonlítva a kontroll transzfektált sejtek (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42, P katalógusa < 0,001). katalógusa

HUVEC ben felfüggesztették a felülúszót összegyűjtöttük a kontroll és a VEZT /N1. Miután 18-H inkubálás után a felülúszót betakarított VEZT /N1 sejtek mutattak erős gátló hatást a kialakulását Csőszerkezetek által HUVEC tekintetében a száma, hossza és metsző csomópontok, ha összehasonlítjuk a kontroll csoportban (3C, ábra). Ábrán látható a 3D, a sejt növekedése MKN-45 sejtek jelentős mértékben elnyomja a helyreállítása a VEZT kifejezés viszonyítva a kontroll csoporthoz ( p
< 0,05). Annak vizsgálata reprodukálhatósága Eredményeink azt értékelte a képessége, NCI-N87 gyomorrák sejtek megtámadják, vándorolnak és alkotnak csőszerű struktúrák alapján VEZT túltermelése. Ezek az eredmények hasonlóak voltak a leírt MKN-45 rákos sejtek, amelyek azt sugallják, hogy VEZT fontos gátló szerepet az invázió, migráció és cső alakú képződését a rákos sejteket.

hatása VEZT overexpressziója a tumorképző rák sejtek csupasz egerekbe

expressziója VEZT elnyomta a növekedés mind MKN-45 és az NCI-N87 által CCK-8 esszé, amikor összehasonlítjuk a kontroll csoportban (ábra 3D, a P < 0,05). Ezt a felismerést alátámasztottuk továbbá a telepképző assay, a növekvő gyomorrák sejtek lágy-agarban való transzfekció után egy VEZT overexpresszáló vektor. Colony képződés aránya MNK-45 sejteket 13,56 ± 0,53% volt a VEZT /N1-csoport és 1,2 ± 0,31%, a kontroll csoportban ( P
< 0,001, ábra 4E). A kolónia képződésének sebessége NCI-N87 sejtek hasonló tendenciát mutattak. Ezután megvizsgáltuk a hatását VEZT túltermelése a tumor növekedését beoltása MKN-45 vagy NCI-N87 /N1 és VEZT /N1 sejtek szubkután a jobb szárnyon régiók nude egerekben. Tumorképző szignifikánsan csökkent VEZT-transzfektált sejtekben. Rapid tumornövekedés volt megfigyelhető a kontroll csoportokban 1 hónap után (4F). A tumor szuppresszív szerepe VEZT expresszió volt megfigyelhető mindkét vizsgált rákos sejtvonalak (ábra 4G, a P < 0,01), ami arra utal, hogy VEZT elnyomja a tumorképző a rákos sejtek. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a kifejezés VEZT gátolta a tumorképző gyomorrák mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

azonosítása target gének után VEZT géntranszfekciós katalógusa

megvilágítását molekuláris mechanizmus alapját képező gátló hatását VEZT sejtekre invázió, a növekedés, a migráció és a tumorképző gyomorrák. Elemeztük a genomot transzkriptom profilja MKN-45 /N1 és VEZT /N1 sejtek Agilent microarray oligo. Szerint szétnyitható változás (> 3,0), a szűrés között MKN-45 /N1 és VEZT /N1 sejtek, azt találtuk, 193 túlszabályozott gének és 135 játszó gének (táblázat S3). Átkutattuk gének átfedést a rákhoz kapcsolódó és molekuláris funkcióval összefüggő gén beállta MSigDB (C4 és C5 gén készletek; http://www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp). Kiválasztottunk 49 rákkal kapcsolatos gének közé tartozik 23 serkentett gének és 26 játszó gének számára klaszterfeltérképező a MeV microarray platform (www.tm4.org/mev.html, 4A). Real-time PCR-hitelesítési ezen gének (táblázat S4), és megerősítette a microarray eredmények 8 túlszabályozott gének és 10 játszó gének (4B ábra). A gén nevek és funkcionális jelölések táblázatban vannak felsorolva, S5. Annak megállapításához, hogy ezek közvetlen célgénjeit VEZT végeztünk kromatin immunprecipitációs esszék VEZT antitest, majd elemezzük a lehúzott DNS-t. Összesen három játszó gének, TCF19 (NM_001077511), CDC42 (NM_001039802) és GPR56 (NM_001145770) közvetlen VEZT célok (4C). Katalógusa

A összefüggéseit VEZT és downstream célpontok, valamint azok kapcsolata gátlása gyomorrák sejtek invázióját, a növekedés, a migráció és a tumorképző gyomorrák in vitro katalógusa és in vivo katalógusa voltak ábrán látható 5C.

• PLoS One: A azonosítása és jellemzése Novel N¹glikán alapú biomarkerek gyomorrákban
• PLoS One: A genetikai polimorfizmusa TOX3 társul Survival gyomorrák egy kínai népesség