PLoS ONE: aktyvavimas mezenchiminių kamieninių ląstelių makrofagų paragina Žmogaus skrandžio vėžio augimo per NF-κB būdas

Abstract

Daugėja įrodymų rodo, kad makrofagai aktyvuoti mezenchiminių kamienines ląsteles (MSC), įsigyti PRO-uždegiminių fenotipą. Tačiau MSC vaidmuo aktyvuota makrofagų skrandžio vėžiu tebėra beveik nežinomas. Šiame tyrime mes nustatėme, kad MSC buvo aktyvuota makrofagų gaminti didesnių uždegiminių citokinų. Mobilusis kolonija formavimas ir transwell migracijos tyrimai parodė, kad supernatantai iš aktyviojo MSC gali skatinti tiek skrandžio epitelio ląstelių ir skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją. Be to, epitelinės-mezenchiminių perėjimo (EMT), angiogenezės, ir stemness susijusių genų išraiška buvo padidintas aktyvintuose MSC. Į fosforilinamos formos NF-κB, ERK ir STAT3 skrandžio ląstelės buvo padidintas aktyvių MSC. Slopinimas NF-κB aktyvavimo PDTC blokavo aktyvintos MSC poveikį skrandžio vėžio ląsteles. Bendras injekcija aktyvintos MSC su skrandžio vėžio ląsteles galėtų pagreitinti skrandžio vėžio augimą. Be to, žmogaus periferinio kraujo monocitai, gautos makrofagai taip pat aktyvuota MSC, kad tai paskatins skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją. Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad MSC aktyvinama makrofagų įsigyti PRO-uždegiminis fenotipas ir greitas skrandžio vėžio augimas yra NF-κB priklausomu būdu, kuris suteikia naujų įrodymų dėl MSC moduliavimo pagal naviko mikroaplinkos ir toliau įžvalgos į stromos vaidmenį ląstelių skrandžio kancerogenezėje ir vėžio progresavimą

nurodomoji dalis:. Jonas T Zhang X Wang, M, Zhang J Huang F Cai J et al., (2014) aktyvavimas mezenchiminių Kamieninių ląstelių makrofagų paragina Žmogaus skrandžio vėžio augimą NF-κB keliu. PLoS ONE 9 (5): e97569. Doi: 10,1371 /journal.pone.0097569

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: Vasario 18, 2014; Priėmė: Balandžio 21, 2014 m Paskelbta: Gegužės 13, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Yang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė pagrindinių mokslinių tyrimų plano Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacijos Nr 91.129.718), Nacionalinis gamtos mokslų fondas Kinijoje (dotacijos Nr. 81.302.119, 81.201.660, 81.071.421), Jiangsu Province, už išskirtinius Fantastika technologijų inovacijų komanda koledžai ir universitetai (Grant SJK2013-10 Nr.), Jiangsu Province projektas mokslinių ir technologinių inovacijų ir pasiekimus transformacijos (dotacijos no.BL2012055), Jiangsu Province, gerų medicinos akademinis vadovas ir "Sci-tech inovacijų komanda programa (dotacijos no.LJ201117) Gamtos mokslai fondas Jiangsu provincijos (dotacijos no.BK2012709, BK20130540), doktorantūros programą fondas Valstybinė švietimo ministerijos (dotacijos Nr. 20113227110011), Jiangsu Province, Gamtos Scicence tyrimų kolegijose ir universitetuose (13KJB320001). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra vienas iš dažniausiai pasitaikančių piktybinių navikų ir išlaiko vieną pagrindinių mirtingumo nuo vėžio visame pasaulyje [1], [2]. Kinijoje yra apie 360,000 asmenys miršta nuo skrandžio vėžio kiekvienais metais [3]. Nors sergamumas sumažėjo pastaraisiais metais Vakaruose, išgyvenimo yra dar blogiau [4]. Per pastaruosius dešimtmečius, daug pastangų buvo daromas išsiaiškinti skrandžio vėžio patogenezės. Tačiau sudėtingą pranešimų mechanizmą, skrandžio kancerogenezėje dar atidengta. Daugėja įrodymų rodo, kad ilgalaikis chroniškas uždegimas yra viena iš pagrindinių priežasčių, Tumorigenesis. Išleidimo PRO-uždegiminių mediatorių ir padidėjo vietinių lygių deguonies ir azoto rūšių gali prisidėti prie Kancerogeninis [5]. Dysregulated gamyba citokinų uždegiminės mikroaplinkos stimuliuoja genų, susijusių su vėžio išsivystymo išraiška ir keičia struktūrinius bruožus mikroaplinkos paspartinti vėžio inicijavimui ir progresavimą [6] - [9].

Naviko mikroaplinka susideda iš įvairių stromos ląstelėse , įskaitant infiltrating imuninių ląstelių karcinomos susijęs fibroblastų (CAFS) mezenchiminių kamieninių ląstelių (MSC), kraujo ir limfos kraujagyslių tinkluose. Šios ląstelės sąveikauja vienas su kitu ir sudaro uždegimo mikroaplinka ir prisidėti prie Tumorigenesis [10], [11]. Tarp stromos ląstelėse, makrofagai, kaip svarbūs imuninės reguliavimo ląsteles, vaidina dominuojantį vaidmenį valdant uždegimą naviko mikroaplinka. Pavyzdžiui, makrofagai izoliuotas nuo naviko mikroaplinkos krūties vėžiu sergančioms pacientėms slaptų chemotaksinio citokinų plėsti metastazes karcinoma ląstelių [12]. Makrofagai taip pat buvo įrodyta, kad skatinti uždegiminį atsaką ir tumorigenezei per įtakoja ant išraiškos uždegiminių citokinų ir pakeisti molekulinius onkogeninių programas per epitelio ląstelių [13].

mezenchiminių kamieninės ląstelės (MSC) yra dar vienas svarbus komponentas naviko mikroaplinka ir yra laikomi pirminių ląstelių vėžio susijęs mezenchiminių ląstelių ir endotelio ląstelių [14]. Ankstesni tyrimai parodė, kad MSC slapti tirpūs veiksniai skatinti vėžinių ląstelių proliferaciją ir metastazes [10]. Be uždegimas susijęs skrandžio vėžio modelis, MSC gali būti aktyvuota į CAFS padidinti lėtinis uždegimas ir vėžio progresavimą [15]. Be to, MSC buvo pranešta įdarbinti monocitai /makrofagai skatinti auglio augimo CCR2-depedent būdu [16]. Sąveika tarp makrofagų ir MSC gaminti aktyvuotą Pro-uždegiminių fenotipą su dideliu CXCL10 ir IL-6 sekreciją, kuri gali turėti įtakos uždegiminių mikroaplinka [17].

Skrandžio vėžys yra klasikinis modelis lėtinis uždegimas vėžį. Tačiau MSC aktyvuoja makrofagų skrandžio vėžio ir pagrindinės mechanizmo vaidmuo vis dar yra plačiai žinomas. Šiame tyrime mes nustatėme, kad MSC buvo stipriai aktyvuota makrofagų pagal uždegiminės būklės, gaminti uždegiminius citokinus bei augimą skatinantį veiksnius, todėl skrandžio epitelio ląstelių ir vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją stiprinimas per NF-κB keliu aktyvacijos. Mūsų rezultatai rodo, kad makrofagai aktyvuota MSC skatinti skrandžio vėžio augimą ir progresavimą pagal uždegiminės būklės.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija HGC-27, žmogaus skrandžio epitelio ląstelių linija GES-1 ir žmogaus ūmaus monocitinę leukemija ląstelių linija THP-1 buvo įsigyti iš biochemijos ir ląstelės biologijos instituto Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija). GES-1 ir THP-1 ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, Invitrogen), ir HGC-27 ląstelių ir buvo išlaikytos aukštos-gliukozės DMEM (H -DMEM, Invitrogen) su 10% FBS. MSC buvo kilęs iš virkštelės ir kultivuojamos mažai gliukozės DMEM (L-DMEM, Invitrogen) su 10% FBS. Ląstelės visi buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje drėgnoje ląstelių kultūros inkubatoriuje su 5% CO _{2. Šviežių virkštelės audiniai buvo renkami iš sveikų Gimdymo motinoms po buvo gautas raštiškas sutikimas. MSC buvo išskirti ir apibūdinti kaip buvo aprašyta anksčiau [18]. Visi eksperimentas protokolai buvo patvirtintas etikos komiteto Dziangsi universitete. MSC ne ištrauka 3 buvo atrinkti eksperimentų.}

skystyje virš nuosėdų paruošimas

Dėl makrofagų susijęs MSC virš nuosėdų preparato, MSC (3 × 10 ^{5) buvo pasėjamos laikytis. THP-1 ląstelių (01:01 santykis) buvo pridėta su šviežia terpe esant arba nesant LPS (1 g /ml). Po to, kai bendro kultūra 48 h, vidutinės buvo išmesti ir ląstelės buvo švelniai nuplauti su PBS, kad pašalinti THP-1 ląstelių. Supernatantq iš aktyvuotų MSC buvo surinkti po 24 valandų, filtruojamas su 0,22-ŪM filtro ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol naudojimo. Kai jie yra naudojami ląstelių funkciją analizės metu, supernatantų iš aktyvuotų MSC buvo sumaišyti su vienodo tūrio 10% FBS-, kurių sudėtyje yra H-DMEM arba RPMI-1640 terpėje. Signalizavimo kelią analizes, ląstelės buvo gydomi nuopile iš aktyvuotų MSC 1 val}

Luminex Analizės

Žmogaus citokinų &.; chemokino magnetinis karoliukas skydelis komplektas (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, JAV) buvo sukurtas aptikti granulocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (G-KSF), trombocitų kilmės augimo faktorius BB (PDGF BB), monocitų chemoattractant protein- 1 (MCP-1), auglio nekrozės faktoriaus-α (TNF-α), kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 ir IL-8 supernatanto iš aktyvuota MSC. Visos procedūros buvo perdirbtas pagal gamintojo nurodymus. Signalai buvo aptikta ir analizuojami naudojant Luminex200 sistema (Millipore).

Transwell Migracijos Analizės

Po gydymo nuopile nuo aktyvuotų MSC 48 h, GES-1 ir HGC-27 ląstelių ( 1 × 10 ^{5 /gerai), buvo įdėti į aukštutinį kambarį (8 mikronų) (Corning, Niujorkas, JAV) terpėje serumo nemokamai. Pilnas vidutinės buvo dedamas į apatinę kamerą. Po inkubacijos 12 valandų, likusias polikarbonato membranos apačioje ląstelės buvo nuvalyti medvilnės tamponai. Po to ląstelės migruoja į apatinio paviršiaus membranos buvo fiksuojami metanoliu 30 min. Išsiskyrusio ląstelės buvo tamsintas su violetinei 15 min ir skaičiuojamas šešių atsitiktinių laukų mikroskopu (100 ×).}

Mobilusis kolonija formavimas Analizės

Ląstelės buvo surinkta po gydymo nuopile iš MSC 48 h ir pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse (1000 ląstelių /duobutėje) ir kultivuojamos 10 dienų. Vidutinės buvo keičiama kas tris dienas. Tuo Augimo laikotarpio pabaigoje, ląstelės buvo fiksuojami metanoliu 30 min ir nudažomi su violetinei 15 min. Mobilieji kolonijos buvo fotografuotas ir buvo skaičiuojami statistinei analizei kolonijų skaičius.

RNR gavyba ir Realaus laiko PGR

Viso RNR išskirta naudojant Trizol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas , Penki mikrogramų RNR buvo naudojama kiekybinė realaus laiko PGR analizei. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Specifinių pradmenų sekas viskas buvo išvardytos S1 lentelėje.

Vakarų dėmė

Ląstelės buvo lizuoti ir homogenizuoti Ripa buferis papildyti su pilna proteazės inhibitoriais. Vienodo dydžio baltymų (200 mikrogramų) buvo išspręstas 12% SDS-PAGE. Tuomet baltymai buvo perkeliamas ant PVDF membranos šių elektroforezės. Po to, kai užblokuotas 5% (w /v) ne-riebus pienas 1 val kambario temperatūros, Membranos buvo inkubuojami jų atitinkamas atitinkamų tirpalų konkretaus pirminio antikūnų per naktį 4 ° C temperatūroje. Pirminės antikūnų šaltiniai buvo: Anti-Oct4 anti-Sox2 anti-Vimentin ir anti-PHOSPHO-STAT3 (Signalway antikūnų, JAV), anti-GAPDH (KangCheng, Šanchajus, Kinija), Anti-E-cad, anti ERK1 /2, anti PHOSPHO-ERK1 /2 ir anti-N-cad (Santa Krusas biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija, JAV), anti-PCNA anti-STAT3 anti-NF-κB anti-PHOSPHO-NF- κB anti-CyclinD1 anti-VEGF ir anti-C-Birželio (Bioworld technologijos Louis Park, MN, JAV), anti-C-MYC (ProteinTech grupė, Čikaga, IL, JAV).

gyvūnų Modelis

trijų iki penkių savaičių senumo BALB /c nude pelėms buvo įsigytas iš SLAC laboratorinių gyvūnų centras (Šanchajus, Kinija). Buvo laikomi gyvūnai, laikantis institucinės politikos, ir visi tyrimai buvo atliekami su tvirtinti Universiteto komiteto naudojimo ir priežiūros Gyvūnai Dziangsi universiteto. HGC-27 ląstelių (1 × 10 ^{6) ir MSC (5 × 10 5) buvo tripsinizuojamos, plaunamos ir resuspenduojamos 200 pL PBS, atitinkamai. Po to ląstelės buvo sumaišyti ir bendro-įpurškiamas į kairės šono nuogas pelių. Navikai buvo chirurgiškai pašalintos 20 dienų po injekcijos, fotografavo ir įvertintas. Naviko dydis buvo įvertintas CALIPER matavimo ir apskaičiuojamas remiantis modifikuotu elipsoido formulę (L × W × W /2), kur L žymi ilgį, ir W reiškia plotį.}

imunohistocheminis

Formalin- fiksuoto parafino įterptųjų pelės naviko audinio skyriai buvo pirmą kartą deparaffinized į ksileno, rehidrataciją per rūšiavo etanolio. Skyriai buvo virti 10 min citrato buferio (pH 6,0, 10 mm), antigeno išimti. Endogeninis peroksidazės aktyvumo buvo slopinamas sąlyčio su 3% vandenilio peroksido 10 min. Tada skyriai buvo blokuotos 5% BSA (Boster Bioinžinerijos, Uhanas, Kinija) ir inkubuojama su tinkamai praskiesto PCNA arba VEGF pirminės antikūno 37 ° C temperatūroje 1 val. Po to, kai plaunami PBS, sekcijos buvo inkubuojamos su atskiestu antrinio antikūno 20 min. Galiausiai, skyriai buvo ryškinamos su 3,3'-diaminobenzidinu (DAB) ir tada counterstained hematoksilinu nagrinėti šviesos mikroskopijos (200 ×).

Pirminis Žmogaus Monocitai Izoliacija

buvo gautos žmogaus monocitų nuo leukocitų sluoksnis periferinio kraujo mėginiuose dovanoti sveiko donoro naudojant Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, JAV). Švieži RPMI 1640 papildytas 10% FBS buvo keičiama kas 2 dienas, ir neadhezinę ląstelės buvo pašalintas ir išgrynintas. Monocitai buvo inkubuojami 7 dienų laikotarpiu ir 50 ng /ml M-CSF buvo įtraukta į gauti makrofagų (M). Tada 24 val supernatantas sekretuoja makrofagų buvo surinkti ir filtruojamas. Prisitvirtinę MSC buvo gydomi makrofagų supernatantą nedalyvaujant arba dalyvaujant LPS (1 g /ml) už 48 h ir plaunamas. Supernatantq iš aktyvuotų MSC buvo surinkta 24 val vėliau ir naudojama po studijų.

Statistinė analizė

Statistinė analizė buvo atlikta su SPSS statistikos programinė įranga 16,0. Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD. Skirtumai skirtingose ​​grupėse buvo analizuojami naudojant ANOVA. Skirtumai tarp PDTC gydymo buvo išbandytas T pervežimas testą. Statistiniai P
vertė < 0,05 buvo laikoma reikšminga

Rezultatai

Bendras kultūra su Makrofagai Pagal uždegiminė būklė Iki reguliuojama uždegiminių citokinų ir Stemness genų ekspresija. MSC

Jei ištirti makrofagų poveikį MSC pagal uždegiminės būklės, mes kartu išauginti MSC su THP-1 ląstelių nebuvimas ar buvimas LPS (1 g /ml) 48 val. THP-1 ląstelės buvo pašalintas PBS plovimo ir prisitvirtinę MSC buvo auginamos šviežią terpę papildomų 24 h (S1 pav). Luminex tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti kelių uždegiminių veiksnių lygius nuopile iš MSC. Rezultatai parodė, kad IL-6 gamybą, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF ir G-CSF kiekis buvo daug didesnis supernatanto iš MSC bendrai kultivuojamos su THP-1 ląstelių LPS buvimą. buvo pastebėtas MSC kad nebuvo bendro kultūringas su THP-1 ląstelių (1a pav) žemos arba neišmatuojamo lygio šių citokinų. Patvirtinti s padidinta šių uždegiminių citokinų, mes iš anksto suformuoti atliekant realaus laiko PGR į aptikti iRNR lygiui šių citokinų. Mes nustatėme, kad atitiktų Luminex tyrimo rezultatus (1b paveiksle), kuriai bendrai kultūra su THP-1 ląstelių iki reguliuojamų mRNR lygius IL-6, IL-8, ir TNF-alfa į MSC. Norėdami nustatyti, ar bendrai kultūra su THP-1 ląstelių įtakos MSC stemness, mes nustatėme, kad Oct4 ir Sox2 išraišką MSC naudojant Vakarų dėmė. Tyrimo rezultatai parodė, kad tiek Oct4 ir Sox2 baltymų koncentracija padidėjo MSC kad buvo bendrai kultūringas su THP-1 ląstelių (1c pav.) Siekiant dar labiau patvirtina šį reiškinį, mes taip pat išnagrinėjo iRNR lygius Oct4 ir Sox2 į MSC. Iš realaus laiko PGR rezultatai parodė, kad bendrai kultūra su THP-1 ląstelių iki-sureguliavo Oct4 ir Sox2 genų raišką MSC (1d pav). Apskritai, šie rezultatai rodo, kad MSC buvo žymiai aktyvuota gaminti aukštesnio lygio uždegiminių citokinų, bendrai išaugintų THP-1 ląstelių pagal uždegiminės būklės.

Makrofagai aktyvuota MSC Patobulintos proliferaciją ir migracija Skrandžio epitelio ląstelių

makrofagų MSC yra svarbūs komponentai naviko mikroaplinka. Norėdami parodyti funkcinius vaidmenis makrofagų aktyvuota MSC, mes surinkome supernatantus iš aktyvuotų MSC ir inkubuojami su skrandžio epitelio ląstelių linijos GES-1 48 val. Tada atliekamas ląstelių kolonija formavimo tyrimą įvertinti GES-1 ląstelių proliferaciją. Kaip parodyta 2A pav, ląstelės inkubuojamos su supernatanto iš aktyvuotų MSC augo greičiau ir suformuota daugiau ir didesnių kolonijas nei kitose grupėse. Be to, inkubacijos su virš nuosėdų nuo aktyvuotų MSC taip pat padidėjo baltymų lygius PCNA ir VEGF GES-1 ląstelių (2b pav.) Į transwell migracijos tyrimo rezultatai parodė, kad migravo Ges-1 ląstelių aktyvintos MSC plius LPS grupės buvo daugiau nei kitose grupėse (2c pav.) Vakarų dėmė analizių rezultatai parodė, kad makrofagų aktyvuota MSC padidino mezenchiminių ląstelių žymenų (N-cad ir Vimentin) išraišką ir sumažino epitelio ląstelių persekiotoją (E-cad) išraišką GES-1 ląstelių (2d pav). Mes šalia lėmė VEGF, MMP9 ir TGF-beta išraišką naudojant realaus laiko PGR. Kaip parodyta 2e pav inkubacijos su virš nuosėdų nuo aktyvuoti MSC plius LPS grupės iki reguliuojama iš VEGF, MMP9 ir TGF-beta išraiška GES-1 ląstelių. Taigi, MSC aktyvinama makrofagų uždegiminės aplinkoje gerokai paaukštintas skrandžio epitelyje ląstelių proliferaciją ir migraciją.

Makrofagai aktyvuota MSC skatino augimo ir Migracijos skrandžio vėžio ląstelių

Nuo makrofagų aktyvuota MSC įtakos skrandžio epitelio ląstelių proliferacija ir migracija, mes šalia lėmė makrofagų aktyvuota MSC apie žmogaus skrandžio vėžio HGC-27 ląstelių poveikį. Ląstelių kolonijų formavimosi tyrimo rezultatai parodė, kad HGC-27 ląstelių inkubuojami su nuopilo nuo makrofaguose aktyvuota MSC augo sparčiau ir suformavo didesnį klonai nei kitų grupių (3A pav.) Vakarų varžtams analizė parodė, kad baltymų lygiai PCNA ir VEGF HGC-27 ląstelių buvo gerokai iki-reguliuoja virš nuosėdų nuo makrofaguose aktyvuota MSC (3b pav.) Transwell migracijos tyrimas atskleidė, kad migravo HGC-27 ląstelių skaičius buvo stulbinamai padidėjo virš nuosėdų nuo makrofaguose aktyvuota MSC (3c pav.) Vakarų dėmė analizė parodė, kad makrofagų aktyvuota MSC sukeltas į mezenchiminių ląstelių žymenų (N-cad ir Vimentin) išraišką ir slopino epitelio ląstelių persekiotoją (E-cad) išraišką HGC-27 ląstelių (3D pav.) MRNR lygiai VEGF, MMP9 ir TGF-beta taip pat buvo padidintas HGC-27 ląstelių po gydymo virš nuosėdų nuo makrofaguose aktyvuota MSC (3e pav). Atsižvelgiant į tai, kad vėžio ląstelės stemness yra glaudžiai susijęs su jų migracijos, mes nustatėme, kad stemness genų raišką HGC-27 ląstelių. Iš Oct4 ir Sox2 išraiška buvo ypač iki-reguliuoja virš nuosėdų nuo makrofaguose aktyvuota MSC (3f pav). Be derančių su realiojo laiko PGR rezultatus, baltymų lygiai Oct4 ir Sox2 taip pat buvo padidintas HGC-27 ląstelių virš nuosėdų nuo makrofaguose aktyvuota MSC (3G pav). Trumpai tariant, šie rezultatai rodo, kad makrofagų aktyvuota MSC taip pat skatinama skrandžio vėžio ląstelių augimą, migracija per EMT indukcijos ir ląstelių stemness pagal uždegiminės būklės.

makrofagų aktyvuota MSC Paaukštintas Skrandžio ląstelių proliferaciją ir migraciją NF- κB Kelias

siekiant ištirti mechanizmą, atsakingą už skatinant vaidmenį makrofagų aktyvuota MSC ląstelių proliferaciją ir migraciją, mes lėmė kelių pagrindinių signalų keitiklių uždegimas ir vėžio, įskaitant stat3, ERK ir NF išraiška -κB, skrandžio epitelinių ląstelių ir skrandžio vėžio ląsteles. Vakarų dėmė analizių rezultatai parodė, kad p-STAT3, p-ERK ir p-NF-κB lygis buvo gerokai didesnis Ges-1 ląstelių gydomiems nuopile iš aktyvuotų MSC nei kitose grupėse. Baltymų lygis NF-κB neturėjo pokyčius, o kad ERK ir STAT3 šiek tiek sumažėjo (4a paveikslas). Į p-STAT3, p-ERK ir p-NF-κB baltymų koncentracijos padidėjimas, taip pat pastebėtas HGC-27 ląstelių po gydymo nuopile iš aktyviojo MSC (4b pav.) Mes patvirtino UP-reguliavimą p-STAT3, p-ERK ir p-NF-κB baltymų lygius nuopile iš aktyviojo MSC kitoje skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901 (S2 pav). Norėdami nustatyti, ar tolesnis tikslinės genai taip pat buvo aktyvuota HGC-27 ląstelių, mes išnagrinėjo cikloniniai D1, C-myc ir C-Birželio baltymų ekspresiją. Kaip parodyta 4C paveiksle, baltymų lygiai cikloniniai D1 ir C-Jun buvo padidėjusi po gydymo nuopile iš aktyviojo MSC.

Jei ateityje nustatyti, ar NF-κB vaidina svarbų vaidmenį aktyvuotas funkcijas MSC, HGC-27 ląstelių buvo iš anksto apdorotas PDTC slopina NF-κB fosforilinimas ir inkubuojami su nuopile iš aktyviojo MSC. Mes nustatėme, kad NF-κB fosforilinimo indukcija aktyvuotų MSC į HGC-27 ląstelių buvo žymiai slopinamas PDTC (4d pav.) Ląstelių kolonijų formavimo ir transwell migracijos tyrimų rezultatai parodė, kad tvirtesniu proliferacija ir migracija HGC-27 ląstelių aktyviojo MSC buvo žymiai sumažintas PDTC gydytų grupių (Skaičiai 4e ir 4f). Be to, PDTC gydymas taip pat slopino UP-reguliavimą VEGF, MMP9 ir TGF-beta aktyvuotų MSC į HGC-27 ląstelių (4G pav). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad aktyvuota MSC greitai skrandžio epitelio ląstelių ir skrandžio vėžio ląstelių proliferacija ir migracija per NF-κB.

makrofagų aktyvuota MSC Paaukštintas skrandžio vėžio augimo in vivo

Kadangi įrodymų, kad makrofagų aktyvuota MSC galėtų sustiprinti skrandžio ląstelių proliferaciją in vitro
, mes stebėjomės, ar šie MSC darė skatinti vaidmenį skrandžio vėžio augimo vivo
. Taigi, mes bendrai švirkščiamas HGC-27 ląstelių su aktyvuota MSC į nuogas pelių. Dvidešimt dienų navikų audiniuose buvo pašalintas, matuojamas ir įvertintas. , Kaip parodyta Fig 5A ir 5B, svetimo transplantanto navikai aktyvintomis MSC bendrai injekuotų grupėje buvo didesnis negu kitose grupių. buvo atliktas imunohistocheminius analizė, siekiant nustatyti, ar augimo susijusių baltymų ir Pro-angiogeninių faktorių ekspresiją navikų audiniuose. Kuo stipresnė teigiamas dažymo PCNA ir VEGF buvo pastebėtas aktyvuota MSC bendrai liejamo grupės (5c pav.) Realaus laiko PGR analizė buvo atlikta aptikti VEGF, MMP9 ir TGF-beta išraišką navikų audiniuose. Mes nustatėme, kad visų šių genų daliniai įpurškimo grupių išraiška buvo didesnis nei, kad HGC-27 ląstelių vien grupė (5D pav). Realiuoju laiku rezultatai PGR analizė parodė, kad iRNR lygiai Oct4, Sox2 ir Sall4 buvo didžiausia aktyvuota MSC bendrai liejamo grupės (5E pav.) Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad makrofagų aktyvuota MSC greitai skrandžio vėžio augimas vivo
.

Pirminis monocitų Aktyvuotos MSC į eilutę skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją Per NF-κB

Jei dar patvirtinti MSC aktyvacija makrofagų, kad tai paskatins skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją, mes izoliuoti monocitų iš žmogaus periferinio kraujo ir surinkti skystį iš monocitų diferencijuotą makrofagai. Po inkubacijos su virš nuosėdų iš monocitų diferencijuotų makrofagai, MSC buvo surinktos ir bendras RNR išskirta realaus laiko PGR analizuoja. Kaip parodyta 6B pav, gydymas su supernatanto iš monocitų diferencijuoti makrofagus iki-reguliuojami iRNR lygiui IL-6, IL-8, MCP-1 ir VEGF MSC. Mes tada inkubuojami skrandžio vėžio ląsteles virš nuosėdų iš aktyvuotų MSC. Ląstelių kolonijų formavimo ir transwell migracijos tyrimų rezultatai parodė, kad paviršinis iš aktyvuotų MSC padidinti platinimu ir migracijos HGC-27 ląstelių (Skaičiai 6c ir 6d). Mes taip pat parodė, kad inkubacinis su nuopile iš aktyviojo MSC padidino p-STAT3, p-ERK ir p-NF-κB išraišką HGC-27 ląstelių (6e pav). Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad atitiktų THP-1 ląstelių, žmogaus pirminės makrofagai taip pat aktyvuota MSC, kad tai paskatins skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją per NF-κB.

Diskusijos

Per pastaruosius dešimtmečius, uždegimo nurodo į vėžio sulaukė daug dėmesio [5], [6]. Ilgalaikis poveikis epitelinių ląstelių uždegiminės mikroaplinkos sukelia piktybinę transformaciją [9], [19]. buvo įrodyta, stromos ląstelių būti ypatingai svarbios ligos progresavimo nuo uždegimo vėžį, moduliuojant uždegiminės mikroaplinkose [7], [8]. Makrofagų ir MSC yra du pagrindiniai komponentai naviko stromos ir dalyvauti reguliuojant uždegiminė reakcija kiek per kancerogenezės [16]. Tačiau tarp makrofagų ir MSC sąveika skrandžio vėžio nebuvo gerai charakterizuojamas.

Skrandžio vėžys yra išsivystė iš ilgalaikio lėtiniu gastritu ir yra klasikinis modelis uždegimas susijusių vėžio. Mes jau anksčiau izoliuoti MSC gyvenantys iš žmogaus skrandžio vėžio audiniuose ir parodė, kad skrandžio vėžio audinio kilęs MSC išsiskiria daug uždegiminių citokinų ir skatinama skrandžio vėžio progresavimą. uždegimo metu, monocitai /makrofagai gali būti įdarbinti aprūpinti MSC su naviko skatinimo funkcijas [16]. Be to, Helicobacter pylori
sukelti lėtinis uždegimas skrandžio epitelinių ląstelių per esamų savo ląstelių sienelių LPS spaudai. Šiame tyrime mes paruošiamojo apdorojimo MSC su makrofagų LPS akivaizdoje imituoti skrandžio vėžys mikroaplinka ir nustatyti, ar makrofagų aktyvuota MSC prisidėti prie skrandžio vėžio progresavimą. Mes parodė, kad MSC inkubuojami su makrofagų ir LPS išsiskiria aukštesnio lygio uždegiminių citokinų. Neseniai atliktas tyrimas pranešė, kad nuolatinis stimuliavimas su makrofagų kondicionieriai vidutinio sukeltas MSC įsigyti PRO-uždegiminių fenotipą [17]. Be atitinka jų tyrimo, mes nustatėme, kad trumpas laikas inkubacijos su makrofagų taip pat aktyvuota MSC gaminti aukštesnio lygio uždegiminių citokinų.

epitelio-mezenchiminių-perėjimas (EMT) yra reikšmingas procesas, kurio metu vėžio metastazių [20]. Bėgant metams, perprogramavimas savybės, susiję su EMT buvo priskirtos padidinti ląstelių plastiškumą į vėžines ląsteles. Vėžys kamieninių ląstelių buvo įvesta ir parodė, prisidėti prie Tumorigenesis ir naviko metastazių [21] - [24]. Naujausi tyrimai rodo, kad iš kamieninių kaip ir mezenchiminių-kaip ląstelių subpopuliacija rodomas didesnį tumorogeniš- skrandžio epitelio ląstelės in vitro ir in vivo,
[25]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad aktyvuotų MSC, kuri buvo bendrai kultūringas su makrofagų LPS buvimą, gali nepaprastai pagerinti skrandžio epitelio ląstelių migracijai, taip pat skrandžio vėžio ląsteles. Be to, mes parodė, kad supernatantai iš aktyviojo MSC sukeltas EMT skrandžio epitelio ir skrandžio vėžio ląsteles. Norėdami išsamiau paaiškinti šiuos rezultatus, nustatėme, kad stemness genų skrandžio vėžio ląstelių išraiška. Mes nustatėme, kad Oct4 ir Sox2, dviejų pagrindinių stemness susijusių genų išraiška, buvo akivaizdžiai padidėjo aktyviojo MSC. Angiogenezę yra labai svarbus naviko metastazių ir VEGF išraiška yra glaudžiai susijęs su skrandžio vėžio prognozei [26], [27]. Mes nustatėme, kad VEGF išraiška buvo žymiai padidėjęs po gydymo nuopile iš aktyviojo MSC skrandžio vėžio ląsteles ir in vitro parsisiųsti ir vivo
. Remdamasi šiomis išvadomis, mes pasiūlėme, kad makrofagų aktyvuota MSC išsiskiria daugiau uždegiminius citokinus ir skatino platinimu ir migracijos skrandžio vėžio ląsteles nuo EMT ir ląstelių stemness indukcija.

Keletas tyrimų parodė, kad MSC skatinti skrandžio vėžiu augimas per skirtingus būdus [28], [29] ir neseniai atliktas tyrimas parodė, kad VEGF išraiška yra glaudžiai susijęs su NF-κB skrandžio vėžio [30]. Be to, TGF-β vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant ląstelių proliferaciją, apoptozę, diferenciacija, migracija, ir tarpląsteliniame plėtros [31], [32]. Naujausi tyrimai parodė, kad TGF-β aktyvuoja NF-κB ir vaidina svarbų vaidmenį į sinergetinį aktyvavimo įvairių būdų [33], [34] pažangą. TGF-β-tarpininkaujant indukcija matricos metaloproteinazės 9 (MMP9) buvo pranešta reglamentuoja NF-κB ir JNK takais [35]. TNF-skatino MMP9 gamyba taip pat aktyvuoja NF-κB ir ERK signaliniai keliai [36]. Be to, iš skrandžio epitelinių ląstelių skrandžio vėžio ląstelių progresavimo buvo įrodyta, kad būti reguliuojama pagal citokinų išraiškos ir NF-κB signalinio kelio [37]. Kitas ataskaita rodo, kad slopina tiek platinimu ir angiogenezę su narkotikais intervencijos skrandžio vėžys yra susijęs su NF-κB [38] slopinimas. Šiame tyrime, mes parodė, kad makrofagų aktyvuota MSC iki reguliuojama NF-κB fosforilinimą ir VEGF išraiška, TGF-beta, ir MMP9 skrandžio ląstelių. Tuo pačiu metu didėja stat3 ir ERK fosforilinimo gali atsirasti nuo NF-κB aktyvavimo, nes NF-κB anksčiau buvo įrodyta, kad reguliuoti stat3 ir ERK signalines kelius [39], [40].

Taigi, mes parodė šio tyrimo, kad MSC aktyvuotos makrofagų įsigijo PRO-uždegiminių fenotipą ir skatinama skrandžio epitelio ląstelių ir vėžio ląstelių proliferaciją ir migraciją per NF-κB aktyvacijos. Mūsų išvados teikti naujoviškas įrodymus skrandžio epitelinių ląstelių ir vėžinių ląstelių moduliacijos pagal MSC pagal uždegiminės aplinkos ir toliau Įžvalgos iš stromos ląstelėse vaidmenis progresavimo nuo lėtinis uždegimas su vėžiu.

Pagalbinė informacija
pav S1.
Bendras kultūra MSC su THP-1 ląstelių. Reprezentacinės vaizdai THP-1 ląstelių ir MSC tiesiosios bendro kultūros sistemą prieš (kairėje) ir po (dešinėje) PBS plovimo. Didinimas, x 100, masto baras = 50 mkm
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0097569.s001
(TIF)
S2 pav.
Makrofagai aktyvuota MCSS paskatino NF-κB aktyvinimo SGC-7901 ląstelių. SGC7901 ląstelės buvo gydomi nuopile iš makrofaguose aktyvuota MSC ir p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, buvo aptikta P-NF-κB, ir NF-κB baltymų SGC-7901 ląstelių išraiškos naudojant Vakarų dėmė .
Doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s002
(TIF)
S1 lentelėje.
sąrašas pradmenų sekas
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC)

• PLoS ONE: Normalus Fibroblastai Skatinti El cad praradimas ir padidinti limfmazgių metastazių skrandžio Cancer
• PLoS ONE: prognostinė vertė iš limfmazgių santykis III etapas skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama Radical Resection