PLOS ONE: Activation des Cellules souches mésenchymateuses par Macrophages Invites gastrique de croissance humaine cancer par NF-kB Pathway

Résumé

Accumulation de preuves indiquent que les macrophages activent les cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour acquérir un phénotype pro-inflammatoire. Cependant, le rôle des cellules souches mésenchymateuses par les macrophages activés dans le cancer gastrique reste largement inconnue. Dans cette étude, nous avons constaté que les cellules souches mésenchymateuses ont été activés par les macrophages afin de produire des taux accrus de cytokines inflammatoires. Cellule formation de colonies et des tests de migration ont révélé que Transwell surnageants des cellules souches mésenchymateuses activées peuvent favoriser à la fois gastrique cellules épithéliales gastriques et la prolifération des cellules cancéreuses et la migration. En outre, l'expression de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), l'angiogenèse et les gènes liés stemness-a augmenté dans MSCs activés. Les formes phosphorylées de NF-kB, ERK et STAT3 dans les cellules gastriques ont été augmentées de cellules souches mésenchymateuses actifs. L'inhibition de l'activation de NF-kB par le PDTC bloque l'effet des cellules souches mésenchymateuses activés sur les cellules cancéreuses gastriques. Co-injection de cellules souches mésenchymateuses avec des cellules activées de cancer gastrique pourrait accélérer la croissance du cancer gastrique. En outre les macrophages, les monocytes du sang périphérique humain dérivées également activés pour inviter MSCs gastrique prolifération des cellules cancéreuses et la migration. Pris ensemble, nos résultats suggèrent que MSCs activés par macrophage acquièrent un phénotype pro-inflammatoire et la croissance rapide de cancer gastrique de manière NF-kB-dépendante, qui fournit de nouvelles preuves pour la modulation des cellules souches mésenchymateuses par microenvironnement de la tumeur et en outre un aperçu du rôle du stroma cellules dans la carcinogenèse gastrique et la progression du cancer

Citation: Yang. T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) L'activation de cellules souches mésenchymateuses par Macrophages Invites gastrique de croissance humaine du cancer par le biais de NF-kB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, Japon

Reçu le 18 Février 2014; Accepté le 21 Avril 2014; Publié: 13 mai 2014

Droit d'auteur: © 2014 Yang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par le plan de recherche majeur de la national Natural science Foundation de Chine (Grant n ° 91129718), la national Natural science Foundation de Chine (Grant no. 81302119, 81201660, 81071421), la province du Jiangsu pour l'excellence Sci-tech équipe de l'innovation en collèges et Universités (Grant. SJK2013-10 pas), le projet de la province du Jiangsu de la transformation scientifique et de l'innovation technologique et de réalisations (Grant no.BL2012055), de la province du Jiangsu leader académique exceptionnelle médicale et Sci-tech Programme de l'équipe innovation (Grant no.LJ201117), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), Fondation programme de doctorat d'Etat Ministère de l'Education (Grant no. 20113227110011), province du Jiangsu pour Natural Scicence recherche dans les collèges et universités (13KJB320001). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus fréquentes et maintient une cause majeure de mortalité par cancer dans le monde [1], [2]. En Chine, il y a environ 360.000 personnes meurent de cancer de l'estomac chaque année [3]. Bien que l'incidence a diminué au cours des dernières années dans l'Ouest, la survie est encore pire [4]. Au cours des dernières décennies, de grands efforts ont été déployés pour élucider la pathogenèse du cancer gastrique. Toutefois, la complexité du mécanisme de la carcinogenèse gastrique est toujours découvert. L'accumulation des données indiquent que l'inflammation chronique à long terme est l'une des principales causes de la tumorigenèse. La libération de médiateurs pro-inflammatoires et une augmentation des niveaux local d'espèces d'oxygène et d'azote peut contribuer à la cancérogenèse [5]. La production dérégulée de cytokines dans le microenvironnement inflammatoire stimule l'expression des gènes associés au développement du cancer et modifie les caractéristiques structurelles de microenvironnement pour accélérer l'initiation du cancer et à la progression [6] - [9].

tumeur microenvironnement se compose de différentes cellules stromales , y compris les cellules immunitaires infiltrant, des fibroblastes de carcinome associées (CEFA), des cellules souches mésenchymateuses (CSM), et le sang et les réseaux vasculaires lymphatiques. Ces cellules interagissent les uns avec les autres et constituent microenvironnement inflammatoire et contribue à la tumorigenèse [10], [11]. Parmi les cellules stromales, les macrophages, les cellules immunitaires régulatrices importantes, jouent un rôle prépondérant dans la gestion de l'inflammation dans le microenvironnement tumoral. Par exemple, les macrophages isolés à partir microenvironnement tumoral des patients atteints d'un cancer du sein secrète des cytokines chimiotactiques pour augmenter la métastase des cellules de carcinome [12]. Les macrophages ont également été montré pour favoriser une réponse inflammatoire et la tumorigenèse par un impact sur l'expression de cytokines inflammatoires et de modifier les programmes oncogènes moléculaires dans les cellules épithéliales [13].

Les cellules souches mésenchymateuses (MSC) sont un autre composant majeur de la tumeur, microenvironnement et sont considérés comme des précurseurs de cellules de cancer associé à des cellules mésenchymateuses et des cellules endothéliales [14]. Les études antérieures ont montré que des facteurs solubles secrets MSCs pour promouvoir la prolifération des cellules cancéreuses et les métastases [10]. Dans un modèle de cancer de l'estomac associé à une inflammation, les CSM peuvent être activés vers CAFs pour augmenter l'inflammation chronique et la progression du cancer [15]. En outre, les CSM ont été rapportés pour recruter des monocytes /macrophages pour favoriser la croissance tumorale d'une manière CCR2 depedent [16]. Les interactions entre les macrophages et les cellules souches mésenchymateuses produisent un actif, un phénotype pro-inflammatoire avec une grande CXCL10 et l'IL-6 sécrétion, ce qui peut influencer le microenvironnement inflammatoire [17].

Le cancer gastrique est un modèle classique de l'inflammation chronique au cancer. Cependant, le rôle des cellules souches mésenchymateuses activés par macrophage dans le cancer gastrique et le mécanisme sous-jacent sont encore largement méconnus. Dans cette étude, nous avons constaté que les MSC ont été fortement activées par les macrophages dans la condition inflammatoire, pour produire des cytokines pro-inflammatoires et de facteurs favorisant les tumeurs, conduisant à l'amélioration de l'estomac cellules épithéliales et de prolifération des cellules cancéreuses et la migration à travers l'activation de la voie NF-kB. Nos résultats indiquent que les macrophages activés-MSCs favorisent la croissance du cancer de l'estomac et de la progression dans la condition inflammatoire.

Matériel et méthodes

Culture
Cell

lignée cellulaire de cancer gastrique humain HGC-27, gastrique lignée humaine de cellules épithéliales GES-1, et la lignée cellulaire de leucémie monocytaire aiguë humaine THP-1 ont été achetés à l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire à l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). GES-1 et THP-1 cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS, Invitrogen), et les cellules HGC-27 ont été maintenues en haute-glucose DMEM (H -DMEM, Invitrogen) avec 10% de FBS. MSCs sont dérivées du cordon ombilical et mises en culture dans du DMEM à faible glucose (L DMEM, Invitrogen) avec 10% de FBS. Les cellules ont été incubées tout à 37 ° C en étuve humidifiée de culture cellulaire avec 5% de CO _{2. Les tissus du cordon ombilical frais ont été recueillies auprès des mères puerpérale sains après consentement éclairé a été obtenu. MSC ont été isolés et caractérisés comme décrit précédemment [18]. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Jiangsu. MSCs au passage 3 ont été sélectionnés pour les expériences.}

Surnageant Préparation

Pour la préparation de macrophage associée MSCs surnageant, MSCs (3 x 10 ^{5) ont été ensemencées à adhérer. Cellules THP-1 (rapport 01:01), on a ajouté du milieu frais en présence ou en absence de LPS (1 ug /ml). Après co-culture pendant 48 h, le milieu a été éliminé et les cellules ont été doucement lavées avec du PBS pour éliminer les cellules THP-1. Les surnageants provenant de cellules souches mésenchymateuses activées ont été recueillies 24 heures plus tard, on filtre avec un filtre de 0,22-um et stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation. Lorsqu'il est utilisé pour des analyses fonctionnement des cellules, les surnageants de cellules souches mésenchymateuses activées ont été mélangés avec un volume égal de 10% de FBS contenant H DMEM ou un milieu RPMI-1640. Pour la voie de signalisation des analyses, les cellules ont été traitées avec les surnageants de MSCs activés pendant 1 h}

Luminex Assay

cytokine humaine &. chimiokine bille magnétique kit de panneau (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) a été conçu pour détecter des facteurs croissance granulocytaires (G-CSF), plaquettaire croissance dérivé du facteur-BB (PDGF-BB), monocytes chimiotactique protéino 1 (MCP-1), facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 et IL-8 dans le surnageant activé MSCs. Toutes les procédures ont été traitées conformément aux instructions du fabricant. Les signaux ont été détectés et analysés à l'aide du système Luminex200 (Millipore).

Essai de migration Transwell

Après traitement avec les surnageants de cellules souches mésenchymateuses activées pendant 48 h, GES-1 et HGC-27 cellules ( 1 × 10 ^{5 /puits) ont été placés dans la chambre supérieure (8 pm) (Corning, NY, USA) dans un milieu sans sérum. Le milieu complet a été placé dans la chambre inférieure. Après incubation pendant 12 h, les cellules restantes au fond de la membrane en polycarbonate ont été essuyées avec des tampons de coton. Les cellules qui migrent vers la surface inférieure de la membrane ont ensuite été fixées avec du methanol pendant 30 min. Les cellules ayant migré ont été colorées avec du cristal violet pendant 15 minutes et comptées dans six champs au hasard sous microscope (100 x).}

Formation de colonies de cellules Assay

Les cellules ont été recueillies après le traitement avec les surnageants provenant de MSCs pendant 48 h et ensemencées dans des plaques 6 puits (1000 cellules /puits) et cultivées pendant 10 jours. Le milieu a été changé tous les trois jours. A la fin de la période de croissance, les cellules ont été fixées avec du methanol pendant 30 minutes et colorées avec du cristal violet pendant 15 minutes. Les colonies de cellules ont été photographiées et le nombre de colonies a été compté pour l'analyse statistique.

Extraction d'ARN et PCR en temps réel

ARN total a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant . Cinq microgrammes d'ARN a été utilisée pour l'analyse par PCR quantitative en temps réel. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. Les séquences d'amorces spécifiques ont tous été répertoriés dans le tableau S1.

Western Blot

Les cellules ont été lysées et homogénéisées dans du tampon RIPA additionné d'inhibiteurs de protéase complets. Equal quantité de protéines (200 ug) a été résolu dans 12% SDS-PAGE. Les protéines ont été ensuite transférées sur des membranes de PVDF après électrophorèse. Après avoir bloqué en 5% (p /v) de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante, les membranes ont été ensuite incubées à leurs dilutions appropriées respectives des anticorps primaires spécifiques pendant une nuit à 4 ° C. Les sources d'anticorps primaires étaient: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentine et anti-phospho-STAT3 (Signalway Antibody, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Chine), anti-E-cadhérine, anti- ERK1 /2, anti-phospho-ERK1 /2 et anti-N-cadhérine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kB, anti-phospho-NF- kB, anti-CyclinD1, anti-VEGF et anti-C-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-C-myc (ProteinTech Group, Chicago, IL, USA).

animal Modèle

Trois à cinq semaines d'âge /c des souris nues BALB ont été achetés chez Slac Laboratory animal Center (Shanghai, Chine). Les animaux ont été maintenus en conformité avec les politiques institutionnelles, et toutes les études ont été réalisées avec l'approbation du Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux de l'Université du Jiangsu. HGC-27 cellules (1 x 10 ^{6) et MSCs (5 × 10 5) ont été trypsinisées, lavées et remises en suspension dans 200 ul de PBS, respectivement. Ensuite, les cellules ont été mélangées et co-injectées dans le flanc gauche des souris nues. Les tumeurs ont été enlevés chirurgicalement 20 jours après l'injection, photographiées et pondérées. la taille de la tumeur a été évaluée par la mesure de l'étrier et calculé sur la base de la formule ellipsoïde modifiée (L × W × W /2), où L représente la longueur, et W représente la largeur.}

immunohistochimie

formaline des coupes de tissus tumoraux de souris fixes paraffine ont été déparaffinées dans du xylene premier, réhydraté par l'éthanol gradué. Les sections ont été portés à ébullition pendant 10 min dans un tampon citrate (pH 6,0, 10 mM) pour la récupération de l'antigène. L'activité peroxydase endogène a été inhibée par l'exposition à 3% de peroxyde d'hydrogène pendant 10 min. Ensuite, les sections ont été bloquées avec 5% de BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, Chine) et mises en incubation avec PCNA diluée appropriée ou d'un anticorps primaire du VEGF à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage avec du PBS, les coupes ont été ensuite mises en incubation avec un anticorps secondaire dilué pendant 20 min. Enfin, les sections ont été visualisées avec 3,3'-diaminobenzidine (DAB) et de contraste avec l'hématoxyline pour examen par microscopie optique (200 ×).

monocytes humains primaires Isolation

monocytes humains ont été obtenus à partir de la couche leucocytaire des échantillons de sang périphérique donnés par donneur sain en utilisant Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Frais RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS ont été changés tous les 2 jours, et les cellules non adhérentes ont été éliminées et purifié. Les monocytes ont été incubées pendant 7 jours et 50 ng /ml de M-CSF ont été ajoutés pour obtenir des macrophages (M). Puis 24 h surnageant sécrété par les macrophages a été recueilli et filtré. MSCs adhérentes ont été traités avec le surnageant de macrophages en l'absence ou en présence de LPS (1 ug /ml) pendant 48 h et on les lave. Les surnageants de MSCs activées ont été recueillies 24 heures plus tard et utilisées pour la suite des études.

Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel SPSS Statistics 16.0. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les différences dans les différents groupes ont été analysés à l'aide d'une analyse de variance. Les différences entre les traitements PDTC ont été testés par t
test. Statistique P
valeur < 0,05 a été considérée comme significative

Co-culture

Résultats avec Macrophages Under Inflammatory Condition Up-réglementé l'expression de cytokine inflammatoire et stemness gènes dans. MSCs

pour étudier l'effet des macrophages sur les cellules souches mésenchymateuses dans une condition inflammatoire, nous avons co-cultivées avec des MSCs cellules THP-1 en l'absence ou en présence de LPS (1 ug /ml) pendant 48 h. Cellules THP-1 ont été éliminés par lavage du PBS et les cellules souches mésenchymateuses adhérentes ont été cultivées dans du milieu frais pendant encore 24 h (figure S1). dosage Luminex a été réalisée pour déterminer les niveaux de plusieurs facteurs inflammatoires dans les surnageants à partir de cellules souches mésenchymateuses. Les résultats ont montré que la production d'IL-6, IL-8, le TNF-α, MCP-1, le VEGF et le G-CSF a été significativement augmentée dans le surnageant de cellules souches mésenchymateuses co-cultivées avec des cellules THP-1 en présence de LPS. des taux faibles ou indétectables de ces cytokines n'a été observé dans MSCs qui ne sont pas co-cultivées avec des cellules THP-1 (figure 1A). Pour confirmer l'expression accrue de ces cytokines inflammatoires, nous préformé PCR en temps réel pour détecter les niveaux d'ARNm de ces cytokines. Nous avons constaté qu'en accord avec les résultats du dosage Luminex (figure 1B), la co-culture avec des cellules THP-1 régulés à la hausse les taux d'ARNm de l'IL-6, IL-8 et TNF-α dans les cellules souches mésenchymateuses. Pour déterminer si la co-culture avec des cellules THP-1 affecte le caractère souche des cellules souches mésenchymateuses, on a détecté l'expression de Oct4 et Sox2 à l'aide de cellules souches mésenchymateuses Western Blot. Les résultats ont montré que les niveaux de protéine Sox2 Oct4 et ont été augmentés en cellules souches mésenchymateuses qui ont été co-cultivées avec des cellules THP-1 (figure 1c). Pour confirmer davantage ce phénomène, nous avons également examiné les taux d'ARNm de Oct4 et Sox2 dans MSCs. Les résultats de la PCR en temps réel a montré que la co-culture avec des cellules THP-1 régulée à la hausse l'expression des gènes dans Oct4 et Sox2 MSCs (figure 1D). En général, ces résultats suggèrent que les CSM ont été significativement activés pour produire des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires par co-culture cellules THP-1 dans des conditions inflammatoires.

Macrophages-activés MSCs amélioré la prolifération et la migration des cellules épithéliales gastriques

macrophages et MSCs sont des éléments importants de microenvironnement de la tumeur. Pour démontrer les rôles fonctionnels des macrophages activés-MSCs, nous avons recueilli les surnageants de MSCs activées et incubées avec la lignée cellulaire épithéliale gastrique GES-1 pendant 48 h. Nous avons ensuite procédé à dosage de formation de colonies de cellules pour évaluer la prolifération des cellules GES-1. Comme on le voit sur la figure 2A, les cellules incubées avec le surnageant de cellules souches mésenchymateuses activées ont augmenté plus rapidement et forment de plus en plus grandes colonies que celles des autres groupes. En outre, l'incubation avec le surnageant de cellules souches mésenchymateuses activées a également augmenté les niveaux de PCNA et de VEGF dans les protéines GES-1 des cellules (figure 2B). Les résultats de l'essai de migration transwell ont montré que le nombre de migrées Ges-1 dans les cellules activées, plus MSCs groupe LPS a été plus que dans les autres groupes (figure 2C). Les résultats de Western blot analyses ont montré que les macrophages activés par des MSC a augmenté l'expression de marqueurs de cellules mésenchymateuses (N-cadhérine et Vimentin) et une diminution de l'expression de l'épithélium marqueur cellulaire (E-cadhérine) dans GES-1 cellules (figure 2D). Nous avons ensuite déterminé l'expression de VEGF, MMP9 et TGF-β en utilisant PCR en temps réel. Comme on le voit sur la figure 2E, l'incubation avec le surnageant de cellules souches mésenchymateuses ainsi que activate groupe LPS régulés à la hausse l'expression de VEGF, MMP9 et de TGF-β dans les cellules GES-1. Ainsi, MSCs activés par les macrophages dans l'environnement inflammatoire promu significativement gastrique prolifération des cellules épithéliums et la migration.

Macrophages-activés MSCs favorisé la croissance et la migration des cellules cancéreuses gastriques

Depuis les macrophages activés-MSCs affectent gastrique prolifération des cellules épithéliales et de la migration, nous avons ensuite déterminé l'effet des macrophages activés-MSCS sur le cancer gastrique humaine HGC-27 cellules. Les résultats de test de formation de colonies de cellules ont montré que HGC-27 cellules incubées avec le surnageant de macrophages activés-MSCs ont augmenté plus rapidement et ont formé plus grands clones que les autres groupes (figure 3A). Les analyses des boulons occidentaux ont montré que les teneurs en protéines de PCNA et de VEGF dans des cellules HGC-27 étaient significativement régulée à la hausse par le surnageant provenant de macrophages activés par MSCs (figure 3B). détermination de la migration transwell a révélé que le nombre de HGC-27 migrées cellules a été remarquablement augmentée par le surnageant provenant de macrophages activés par MSCs (figure 3C). Les analyses par Western blot ont montré que les macrophages activés par MSCs induit l'expression de marqueurs de cellules mésenchymateuses (N-cadhérine et Vimentin) et inhibe l'expression du marqueur de cellules épithéliales (E-cadhérine) dans HGC-27 cellules (figure 3D). Les taux d'ARNm de VEGF, MMP9 et de TGF-β ont également augmenté dans les cellules HGC-27 après traitement avec le surnageant provenant de macrophages activés par MSCs (figure 3E). Considérant que stemness des cellules cancéreuses est fortement liée à leur migration, nous avons détecté l'expression des gènes stemness dans HGC-27 cellules. L'expression de Oct4 et Sox2 a notamment été régulée à la hausse par le surnageant de macrophages activés-MSCs (Figure 3F). Dans les résultats de la PCR en accord avec le temps réel, les niveaux de Oct4 et Sox2 protéines ont également été augmentés dans HGC-27 par les cellules du surnageant provenant de macrophages activés par MSCs (figure 3G). En bref, ces résultats suggèrent que les macrophages activés par MSCs ont également favorisé la croissance des cellules du cancer gastrique, la migration à travers l'induction de l'EMT et stemness cellulaire sous condition inflammatoire.

Macrophages-activés MSCs Promu de la prolifération cellulaire gastrique et migration Par NF- kB Pathway

afin d'explorer le mécanisme responsable du rôle de promotion des macrophages-activés MSCs dans la prolifération cellulaire et la migration, nous avons déterminé l'expression de plusieurs transducteurs de signalisation clés pour l'inflammation et le cancer, y compris STAT3, ERK et NF -κB, dans les cellules epitheliales gastriques et les cellules cancéreuses gastriques. Les résultats de Western blot analyses montrent que le taux de p-STAT3, le p-ERK et de p-NF-kB étaient significativement plus élevés dans les Ges-1 des cellules traitées avec les surnageants provenant de cellules souches mésenchymateuses activés que ceux des autres groupes. Le niveau de la protéine NF-kB avait pas de changement alors que celle de ERK et STAT3 a légèrement diminué (figure 4A). L'augmentation des niveaux de protéine p-NF-kB p-STAT3, le p-ERK et ont également été observées dans les cellules HGC-27 après traitement avec les surnageants provenant des cellules souches mésenchymateuses activées (figure 4B). Nous avons confirmé la régulation à la hausse des taux de protéine P-NF-kB p-STAT3, le p-ERK et les surnageants des cellules souches mésenchymateuses activés dans une autre lignée cellulaire de cancer gastrique SGC7901 (figure S2). Pour déterminer si les gènes cibles en aval ont également été activés dans les cellules HGC-27, nous avons examiné l'expression de la cycline D1, c-myc et les protéines C-Jun. Comme on le voit sur la figure 4C, les niveaux de cycline D1 et la protéine C-Jun ont été élevés après traitement par les surnageants des cellules souches mésenchymateuses activées.

Pour déterminer si l'avenir de NF-kB joue un rôle important dans les fonctions activées MSCs, HGC-27 cellules ont été pré-traitées avec PDTC pour inhiber NF-kB phosphorylation puis incubé avec les surnageants des MSCs activés. Nous avons découvert que l'induction de NF-kB par phosphorylation MSCs activés dans HGC-27 cellules a été fortement inhibée par le PDTC (figure 4D). Les résultats de la formation de colonies de cellules et des dosages de migration transwell ont montré que la prolifération et la migration accrue des HGC-27, des cellules activées par les cellules souches mésenchymateuses ont été réduits de manière significative dans les groupes traités par le PDTC (Figures 4E et 4F). En outre, le traitement PDTC inhibe également la régulation positive du VEGF, MMP9 et de TGF-β par les cellules souches mésenchymateuses activées dans HGC-27 des cellules (figure 4G). Pris ensemble, ces résultats indiquent que les MSCs activés rapidement des cellules épithéliales gastriques et gastrique prolifération des cellules cancéreuses et de migration par NF-kB

. Macrophages-activés MSCs Promu gastrique de croissance du cancer in vivo

Compte tenu de la la preuve que les macrophages activés-MSCs pourraient améliorer la prolifération des cellules gastriques in vitro
, nous nous sommes demandé si ces MSCs ont exercé la promotion de rôle dans la croissance du cancer gastrique in vivo
. Ainsi, nous avons co-injecté HGC-27 cellules avec les MSCs activés dans des souris nues. Vingt jours plus tard, les tissus tumoraux ont été enlevés, mesurés et pondérés. Comme cela est représenté sur les figures 5A et 5B, les tumeurs de xénogreffe dans le groupe MSCs co-injecté activés étaient plus grands que ceux des autres groupes. Des analyses immunohistochimiques ont été réalisées pour déterminer l'expression des protéines liées à la croissance et les facteurs pro-angiogéniques dans les tissus tumoraux. La coloration plus fort positif de PCNA et VEGF a été observée dans le groupe activé MSCs co-injecté (Figure 5C). Les analyses en temps réel par PCR ont été réalisées pour détecter l'expression du VEGF, MMP9 et de TGF-β dans les tissus tumoraux. Nous avons découvert que l'expression de tous ces gènes dans les groupes co-injectées étaient plus élevés que dans HGC-27 seul groupe de cellules (figure 5D). Les résultats de temps réel des analyses PCR ont montré que les taux d'ARNm de Oct4, Sox2 et Sall4 étaient les plus élevés dans le groupe activé MSCs co-injecté (Figure 5E). En résumé, ces données indiquent que la croissance des macrophages activés-MSCs invite le cancer gastrique in vivo
.

monocytes primaire MSCs Activé pour inciter le cancer gastrique prolifération cellulaire et la migration par NF-kB

pour confirmer davantage l'activation des macrophages par des cellules souches mésenchymateuses pour inciter gastrique prolifération des cellules cancéreuses et la migration, on isole des monocytes à partir de sang périphérique humain et recueilli le surnageant de monocytes macrophages différenciés. Après incubation avec le surnageant de monocytes macrophages différenciés, cellules souches mésenchymateuses ont été récoltées et l'ARN total a été extrait en temps réel des analyses par PCR. Comme on le voit sur la figure 6B, le traitement avec le surnageant de monocytes macrophages différenciés régulés à la hausse les taux d'ARNm de l'IL-6, IL-8, MCP-1 et VEGF dans les cellules souches mésenchymateuses. Nous avons ensuite mis à incuber les cellules de cancer de l'estomac avec le surnageant des cellules souches mésenchymateuses activées. Les résultats de la formation de colonies de cellules et des dosages de migration transwell ont montré que le surnageant des cellules souches mésenchymateuses activées augmentant la prolifération et la migration des cellules HGC-27 (figures 6C et 6D). Nous avons aussi démontré que l'incubation avec des surnageants des MSCs activés a augmenté l'expression de p-STAT3, p-ERK et p-NF-kB dans HGC-27 cellules (Figure 6E). Pris ensemble, ces données suggèrent que les cellules compatibles avec les cellules THP-1, des macrophages primaires humains également activés pour inviter MSCs gastrique prolifération des cellules cancéreuses et la migration par NF-kB.

Discussion

Pendant la dernières décennies, le lien de l'inflammation au cancer a attiré beaucoup d'attention [5], [6]. L'exposition à long terme des cellules épithéliales à microenvironnement inflammatoire conduit à une transformation maligne [9], [19]. Les cellules stromales se sont révélés être impliqués de manière critique dans la progression de l'inflammation du cancer par la modulation du microenvironnement inflammatoire [7], [8]. Macrophages et MSCs sont deux composantes majeures de stroma tumoral et participent à la régulation de l'ampleur de la réaction inflammatoire au cours de la cancérogenèse [16]. Cependant, l'interaction entre les macrophages et les cellules souches mésenchymateuses dans le cancer gastrique n'a pas été bien caractérisée.

Le cancer gastrique est évolué à partir de gastrite chronique à long terme et est un modèle classique de cancer lié à une inflammation. Nous avons précédemment isolé MSCs résidents à partir de tissus de cancer gastrique humain et démontré que les tissus dérivés de cellules souches mésenchymateuses cancer gastrique sécrété beaucoup de cytokines inflammatoires et de promouvoir la progression du cancer gastrique. Au cours du processus de l'inflammation, les monocytes /macrophages peuvent être recrutés pour doter les cellules souches mésenchymateuses avec des caractéristiques favorisant les tumeurs [16]. En outre, Helicobacter pylori
induisent une inflammation chronique dans les cellules épithéliales gastriques par la libération de LPS existants dans ses parois cellulaires. Dans cette étude, nous MSCs pré-traité avec des macrophages en présence de LPS pour mimer microenvironnement cancer gastrique et de déterminer si les macrophages activés-MSCs contribuent à la progression du cancer gastrique. Nous avons démontré que MSCs incubés avec les macrophages et les LPS sécrétées des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires. Une étude récente a révélé que la stimulation continue avec induite moyenne MSCs macrophage conditionnés à acquérir un phénotype pro-inflammatoire [17]. En accord avec leur étude, nous avons constaté que courte incubation de temps avec les macrophages également activé MSCs pour produire plus haut niveau de cytokines inflammatoires.

épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) est un processus important au cours de cancer métastatique [20]. Au fil des années, les propriétés liées à la reprogrammation EMT ont été attribués afin d'améliorer la plasticité cellulaire dans les cellules cancéreuses. les cellules souches du cancer a été introduit et montré à contribuer à la tumorigenèse et la métastase de la tumeur [21] - [24]. Des études récentes suggèrent qu'une sous-population de cellules souches mésenchymateuses et comme comme affiché une plus grande tumorigénicité dans les cellules épithéliales gastriques in vitro et in vivo
[25]. Dans cette étude, nous avons constaté que MSCs activés, qui ont été co-cultivés avec des macrophages en présence de LPS, peuvent améliorer notablement la migration des cellules épithéliales gastriques, ainsi que les cellules cancéreuses gastriques. De plus, nous avons démontré que les cellules souches mésenchymateuses à partir de surnageants activés induite EMT dans l'épithélium gastrique et les cellules cancéreuses gastriques. Pour expliquer davantage ces résultats, nous avons détecté l'expression des gènes dans les cellules stemness de cancer gastrique. Nous avons constaté que l'expression de Oct4 et Sox2, deux gènes majeurs liés stemness, était évidemment augmentée par les MSCs activés. Angiogenèse est essentielle pour les métastases tumorales et l'expression du VEGF est étroitement lié au pronostic du cancer gastrique [26], [27]. Nous avons découvert que l'expression de VEGF a été significativement augmentée après le traitement avec les surnageants provenant des cellules souches mésenchymateuses activés dans les cellules de cancer gastrique à la fois in vitro et

in vivo. Sur la base de ces résultats, nous avons proposé que les macrophages activés par MSCs sécrétées cytokines plus inflammatoires et ont favorisé la prolifération et la migration des cellules de cancer gastrique par l'induction de l'EMT et stemness cellulaire.

Plusieurs études ont indiqué que les CSM favorisent le cancer gastrique la croissance par différentes voies [28], [29] et une étude récente a démontré que l'expression de VEGF est étroitement liée à NF-kB dans le cancer gastrique [30]. En outre, le TGF-β joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération cellulaire, l'apoptose, la différenciation, la migration et le développement de la matrice extracellulaire [31], [32]. Des recherches récentes ont révélé que le TGF-β active NF-kB et joue un rôle important dans la progression de l'activation synergique de diverses voies [33], [34]. induction de TGF-β-médiée de la matrice métalloprotéinase 9 (MMP9) a été signalé à être réglementé par NF-kB et des voies JNK [35]. la production de MMP9 TNF stimulée active également le NF-kB et les voies de signalisation ERK [36]. En outre, la progression des cellules épithéliales gastriques à des cellules de cancer gastrique a été démontré être régulée par l'expression des cytokines et NF-kB voie de signalisation [37]. Un autre rapport suggère que l'inhibition de l'angiogenèse à la fois la prolifération et l'intervention de la drogue dans le cancer gastrique est lié à la suppression de la NF-kB [38]. Dans cette étude, nous avons montré que les macrophages activés-MSCs régulés à la hausse de la phosphorylation de NF-kB et l'expression de VEGF, TGF-β, et MMP9 dans les cellules gastriques. Les augmentations simultanées dans STAT3 et la phosphorylation de ERK peuvent résulter de l'activation de NF-kB, car NF-kB a été précédemment montré pour réguler STAT3 et de signalisation ERK voies [39], [40].

En conclusion, nous ont démontré dans cette étude que les CSM activés par les macrophages acquis phénotype pro-inflammatoire et la promotion gastrique des cellules épithéliales et prolifération des cellules cancéreuses et la migration à travers l'activation de NF-kB. Nos résultats fournissent des preuves nouvelles pour la modulation des cellules épithéliales gastriques et les cellules cancéreuses en MSCs sous environnement inflammatoire et un meilleur aperçu des rôles des cellules stromales dans la progression de l'inflammation chronique au cancer.

Informations complémentaires
Figure S1.
Co-culture de cellules souches mésenchymateuses avec cellules THP-1. Des images représentatives de cellules THP-1 et MSCs dans un système de co-culture directe avant (à gauche) et après (à droite) PBS laver. Grossissement, x 100, barre d'échelle = 50 pm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0097569.s001
(TIF)
Figure S2.
Macrophages activés PMM induit l'activation de NF-kB dans les cellules SGC-7901. SGC7901 cellules ont été traitées avec les surnageants provenant de macrophages activés par des MSC et l'expression de la p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB et NF-kB protéines dans les cellules CGT-7901 ont été détectées par Western blot .
doi: 10.1371 /journal.pone.0097569.s002
(TIF)
Tableau S1.
Liste des séquences d'amorces
doi:. 10.1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC)

• PLOS ONE: Normale Fibroblastes induire une perte E-cadhérine et l'augmentation des ganglions lymphatiques métastatiques gastrique Cancer
• PLOS ONE: Valeur pronostique du ratio des ganglions lymphatiques au stade III gastrique Cancer Patients Subissant Radical Resection