Plos ONE: Aktivacija mezenhimskih matičnih celic, ki jih Makrofagi Prompts Human Rak želodca rast skozi NF-κB Pathway

Povzetek

Kopičijo dokazi kažejo, da makrofagi aktivirati mezenhimske matične celice (MSC), da pridobijo vnetno fenotip. Vendar pa je vloga MSC aktivira makrofagov pri bolnikih z rakom želodca je še vedno v veliki meri neznan. V tej študiji smo ugotovili, da so jem aktivirani makrofagi pri izdelovanju povišane ravni vnetnih citokinov. Nastanek kolonije celic in transwell migracije testi so pokazali, da bi lahko supernatante iz aktiviranih MSC spodbujanje tako v želodcu epitelijskih celic in proliferacijo želodčnim rakom celic in migracije. Poleg tega je izraz epitelnega-mezenhimskih prehodu (EMT), angiogenezo in povezanih stemness genov v aktiviranih MSC povečala. Fosforilirano oblike NF-κB, ERK in stat3 v želodčnih celic, so se povečali za aktivne MSC. Inhibicijo aktivacije NF-κB ga PDTC blokiran učinek aktiviranih MSC na želodcu rakavih celic. Sočasno injiciranje aktiviranih MSC pri želodčnih rakavih celic lahko pospeši rast raka na želodcu. Poleg tega, humane periferne krvi monociti izpeljani makrofagi aktivira tudi MSC spodbudilo širjenje želodčni rak celic in migracije. Skupaj, naše ugotovitve kažejo, da jem aktivira makrofaga pridobiti vnetna fenotip in hitro želodca rast raka na NF-κB-odvisen način, ki zagotavlja nove dokaze za modulacijo MSC jih tumorja mikrookolja in nadaljnji vpogled v vlogo stromalnih celice iz želodca karcinogenezi in napredovanja raka

Navedba:. Yang T Zhang X Wang M Zhang J Huang F, Cai J, et al. (2014) Aktiviranje mezenhimskih matičnih celic makrofagov Prompts Human Rak želodca rast preko NF-κB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska

Prejeto: 18. februar 2014; Sprejeto: 21. april 2014; Objavljeno: 13. maj 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl raziskovalni načrt Major državnega Natural Science Foundation Kitajske (Grant No. 91129718), National Natural Science Foundation of China (Grant, št. 81302119, 81201660, 81071421), Jiangsu Province za Izjemna Sci-tech inovacije ekipe v šole in univerze (o dodelitvi sredstev št. SJK2013-10), Projekt provinci Jiangsu na znanstvenih in tehnoloških inovacij in dosežki preoblikovanju (Grant no.BL2012055), Jiangsu province je Izjemna Medical Academic Leader in Sci-tech Innovation Program Team (Grant no.LJ201117), Natural Science Foundation province Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), doktorski program Ustanovitev državnega ministrstva za šolstvo (Grant št. 20113227110011), provinca Jiangsu for Natural Scicence raziskave v šole in univerze (13KJB320001). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden najpogosteje pojavljajo malignostmi in ohranja glavni vzrok smrtnosti zaradi raka po vsem svetu [1], [2]. Na Kitajskem, obstaja približno 360.000 posameznikov umre zaradi raka želodca vsako leto [3]. Čeprav se je pojavnost v zadnjih letih na Zahodu zmanjšala, Preživetje je še huje [4]. V zadnjih desetletjih je bilo veliko napora za pojasnitev patogenezo raka želodca. Vendar pa je kompleksen mehanizem želodca karcinogenezo še nepokrit. Kopičijo dokazi kažejo, da je dolgoročna kronično vnetje eden od glavnih vzrokov tumorigeneze. Sproščanje vnetnih mediatorjev in povečane lokalni ravni kisika in dušika vrst, lahko prispevajo k rakotvornost [5]. Dysregulated proizvodnja citokinov v vnetnega mikrookolja spodbuja izražanje genov, povezanih z razvojem raka in spreminja strukturne značilnosti od mikrookolja, da pospeši nastanek in napredovanje raka [6] - [9].

Tumor mikrookolje je sestavljen iz različnih stromalnih celic vključno razraščati imunskih celic,-karcinomom povezan fibroblastov (KGZS), mezenhimskih matičnih celic (MSC), in krvi in ​​limfnih žil omrežij. Te celice med seboj in so vnetni mikrookolje in prispevajo k tumorigeneze [10], [11]. Med stromalnih celic, makrofagov, kot pomembne imunskih regulatornih celic, igrajo dominantno vlogo pri upravljanju vnetja tumorja mikrookolja. Na primer, makrofagov izolirana iz tumorskega mikrookolja bolnic z rakom dojk tajnih kemotaktične citokini za bogatenje metastaze karcinoma celic [12]. Makrofagi so tudi pokazale, da spodbujanje vnetni odziv in tumorigeneze prek vpliva na izražanje vnetnih citokinov in spreminja molekularnih onkogeni programov v epitelnih celic [13].

mezenhimske matične celice (MSC) so še en pomemben del tumorja mikrookolje in se štejejo kot predhodnikov celice raka povezana mezenhimskih celicah in endotelijskih celic [14]. Prejšnje študije so pokazale, da je MSC skrivnost topnih dejavnikov, ki spodbujajo raka proliferacije celic in metastaz [10]. Pri modelu z-vnetja povezana z rakom na želodcu, lahko jem aktivira proti KGZS povečati kronično vnetje in napredovanje raka [15]. Poleg tega so poročali jem zaposliti monocitov /makrofagov za spodbujanje rasti tumorjev pri CCR2-depedent način [16]. Interakcije med makrofagov in MSC proizvajajo aktivirane, vnetno fenotip z visoko CXCL10 in IL-6, izločanje, ki lahko vplivajo na vnetno mikrookolje [17].

Rak želodca je klasičen model kronično vnetje z rakom. Vendar pa je vloga MSC jih makrofaga aktiviranih z rakom želodca in osnovnega mehanizma so še vedno v veliki meri neznan. V tej študiji smo ugotovili, da so jem močno aktivira makrofagov pod vnetnega stanja, za izdelavo vnetnih citokinov in-tumorske spodbujanje dejavnikov, ki vodijo k izboljšanju želodčne celic in raka proliferacijo epitelijskega in migracije preko aktivacije NF-κB poti. Naši rezultati kažejo, da makrofagov-aktivirani MSC spodbujanje želodca rast nastanek in napredovanje raka vnetja.

Materiali in metode

Cell Culture

rak celična linija Human želodca HGC-27, človeška želodca epitelnih celic linija GES-1, in človek akutno monocitno levkemijo celične linije THP-1 so bile kupljene z inštituta za biokemijo in biologijo celice na kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). GES-1 in celice THP-1 smo kultivirali v RPMI-1640 medij (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) s 10% fetalnega govejega seruma (FBS, Invitrogen) in HGC 27-celice smo vzdrževali v visoko glukozni DMEM (H -DMEM, Invitrogen) z 10% FBS. Jem so bile pridobljene iz popkovnične krvi in ​​gojimo v nizko-glukoze DMEM (L-DMEM, Invitrogen) z 10% FBS. Celice so bile vse inkubira pri 37 ° C v navlaženem inkubatorju celične kulture s 5% CO _{2. Sveže popkovnične tkiva so bili zbrani iz zdravih puerperijumu posle dajatve mater po tem, ko je bilo pridobljeno pisno privolitev. MSC smo izolirali in označen kot je opisano predhodno [18]. Vse eksperiment protokoli so bili potrjeni Odbor za etiko Univerze Jiangsu. Jem na prehodu 3 so bili izbrani za poskuse.}

Supernatant Priprava

Za pripravo makrofagne povezana MSC supernatanta, MSC (3 x 10 ^{5) zasejemo spoštovati. Celice THP-1 (razmerje 01:01) dodamo svežo mediju v prisotnosti ali odsotnosti LPS (1 ug /ml). Po sočasni kulturo 48 ur smo medij zavrgli in celice previdno sprali s PBS, da odstranimo celice THP-1. Supernatante iz aktiviranih MSC zberemo 24 ur kasneje, filtriramo z 0,22-um filter ter shranili pri -80 ° C do uporabe. Kadar se uporablja za analizo delovanja celic, smo supernatante iz aktiviranih MSC zmešamo z enakim volumnom 10% FBS, ki vsebuje H-DMEM ali RPMI-1640 medij. Za signalne poti analiz, so bile celice zdravijo z supernatantih iz aktiviranih MSC 1 uro}

Luminex Vsebnost

Human citokin &.; kemokin magnetna kroglica plošča Komplet (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, ZDA) je bil zasnovan za odkrivanje granulocitne kolonije stimulirajoči faktor (G-CSF), trombocitni rastni faktor-BB (PDGF-BB), monocit chemoattractant proteine 1 (MCP-1), tumorskega nekroznega faktorja-α (TNF-α), vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 in IL-8 v supernatantu iz aktiviran jem. Vsi postopki so bili obdelani v skladu z navodili proizvajalca. Signali so odkrili in analizirali s pomočjo Luminex200 sistem (Millipore).

Transwell migracije Vsebnost

Po zdravljenju z supernatantih iz aktiviranih MSC 48 ur, ges-1 in HGC 27 celic ( 1 x 10 ^{5 /jamico) smo postavili v zgornjo komoro (8 pm) (Corning, NY, ZDA) v mediju brez seruma. Popoln medij damo v spodnjo komoro. Po inkubaciji 12 ur, smo celice ostanejo na dnu polikarbonata membrane obrisati z bombažnimi blazinicami. Celice se selijo na spodnjo površino membrane smo nato fiksirajo z metanolom 30 minut. So preselili celice smo obarvali s kristal vijoličnim 15 minut in šteje v šestih naključnih polj pod mikroskopom (100 ×).}

Cell Colony Ustanovitveni Vsebnost

Celice smo zbrali po zdravljenju z ekstraktu MSC za 48 ur in zasejali v 6 vdolbinami (1000 celic /jamico) in kultiviramo 10 dni. Gojišče smo spremenili na vsake tri dni. Na koncu tega obdobja rasti smo celice fiksirajo z metanolom 30 minut in obarvamo s kristal vijoličnim 15 minut. Kolonije celic so fotografirali in število kolonij je štela za statistično analizo.

RNA Pridobivanje in Real-time PCR

Total RNA je bila vzeta s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen), v skladu z navodili proizvajalca . Pet mikrogramov RNA je bila uporabljena za kvantitativno realnem času analize PCR. β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. Sekvence posebnih primerji so bili vsi navedeni v tabeli S1.

Western Blot

Celice smo lizirali in homogenizirali v RIPA pufra dopolniti s popolno zaviralci proteaz. Enaka količina beljakovin (200 mikrogramov) je bila odpravljena v 12% SDS-PAGE. Proteine ​​smo nato prenesli na PVDF membrano naslednjih elektroforezo. Po blokiran v 5% (w /v) nemastnega mleka za 1 uro pri sobni temperaturi, smo membrane nato inkubiramo pri njihovih ustreznih razredčitev specifičnih protiteles primarnih preko noči pri 4 ° C. Viri primarnih protiteles so bili: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentina in anti-fosfo-stat3 (Signalway protiteles, ZDA), anti-GAPDH (Kangcheng, Šanghaj, Kitajska), anti-E-kadherina, anti- ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 in anti-N-kadherina (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, ZDA), anti-PCNA, anti-stat3, anti-NF-κB, anti-fosfo-NF-KB κB, anti-CyclinD1, anti-VEGF in anti-C-Jun (Bioworld Technology Louis Park, MN, USA), anti-C-myc (ProteinTech skupina, Chicago, IL, ZDA).

Animal Model

Tri do pet tednov stare BALB /c golih miši so bile kupljene od SLAC laboratorijske Center živali (Shanghai, Kitajska). Živali so se vzdržujejo v skladu z institucionalnimi politike, in vse študije so bile izvedene z odobritvijo Univerzitetnega odbora za uporabo in vzdrževanje živali Univerze Jiangsu. HGC-27 celice (1 x 10 ^{6) in MSC (5 x 10 5) tripsiniziramo, sprali in ponovno suspendirali v 200 ul PBS oz. Nato smo celice pomešamo in sočasno injicira v levi bok golih miši. Tumorji so kirurško odstranili 20 dni po injiciranju, fotografirali in vrednotena. velikost tumorja je bila ocenjena z merjenjem čeljusti in se izračuna na podlagi spremenjene elipsoida formulo (L x W x W /2), kjer L predstavlja dolžino, in W predstavlja širino.}

Imunohistokemija

Formalin- odseki tkiva miška tumor fiksne-parafin vgrajeni so prvič deparaffinized v ksilen, hidracijo s stopenjsko etanola. Sekcije smo kuhamo 10 minut v citratnem pufru (pH 6,0, 10 mM) za pridobivanje antigena. Endogeni peroksidaze aktivnost je bila inhibirana z izpostavljenostjo 3% vodikovega peroksida 10 minut. Nato so bili odseki blokirali s 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, Kitajska) in inkubiramo z ustrezno razredčeno PCNA ali VEGF primarnega protitelesa pri 37 ° C 1 uro. Po sprali s PBS, so odseki nato inkubiramo z razredčenim sekundarnih protiteles 20 min. Na koncu so sekcije vizualizirali z 3,3'-diaminobenzidine (DAB), nato pa jih nasprotno s hematoksilinom za pregled s svetlobnim mikroskopom (200 ×).

Osnovna Human Monociti Izolacija

Dobimo Človeški monociti iz buffy coat perifernih krvnih vzorcih, ki jih zdravem darovalcu uporabo Ficoll (histopaque-1077) (Sigma, ZDA) podarjenih. Svežega RPMI 1640, dopolnjenem z 10% FBS smo spremenili vsake 2 dni, in ne-adherentne celice so bile odstranjene in očistimo. Monocite smo inkubirali 7 dni in 50 ng /ml, M-CSF dodamo, da dobimo makrofagov (M). Potem smo jo 24 ur supernatant makrofagi izločajo zberemo in filtriramo. Priraslo MSC smo obdelali z makrofag supernatanta v odsotnosti ali prisotnosti LPS (1 ug /ml), 48 ur in izperemo. Supernatante iz aktiviranih MSC smo zbrali 24 ur kasneje in se uporablja za naslednje študij.

Statistična analiza

Statistična analiza je bila narejena s SPSS Statistics opreme 16.0. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. Razlike v različnih skupinah smo analizirali z enosmerno ANOVA. Razlike med PDTC zdravljenja so bili testirani z t
test. Statistični P
vrednost < 0,05 štela za pomembne

Rezultati

Co-kultura z Makrofagi Pod vnetja Up-urejena izražanje vnetni citokin in Stemness genov v. MSC

Da bi raziskali vpliv makrofagov na MSC pod vnetja, smo sodelovali kultivirani jem s celicami THP-1, v odsotnosti ali prisotnosti LPS (1 mg /ml) za 48 ur. Celice THP-1 smo odstranili s PBS pralnih in sprijete jem smo kultivirali v svežem mediju dodatnih 24 ur (slika S1). Luminex test smo izvedli za določitev ravni več vnetnih dejavnikov v ekstraktu MSC. Rezultati so pokazali, da je proizvodnja IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF in G-CSF je bil znatno supernatantu povečal s jem sočasno kultiviramo s celicami THP-1 v prisotnosti LPS. V MSC, ki niso bile co-gojili z THP-1 celic (slika 1A) so opazili nizke ali nezaznavno raven teh citokinov. Za potrditev povečano ekspresijo teh vnetnih citokinov, smo predoblikovan PCR v realnem času za odkrivanje ravni mRNA teh citokinov. Ugotovili smo, da je v skladu z rezultati Luminex testnimi (slika 1B), co-kulturi s celicami THP-1 navzgor reguliranih koncentracijo mRNA IL-6, IL-8 in TNF-a v MSC. Da bi ugotovili, ali so-kulture s celic THP-1 vpliva na stemness za MSC, smo zaznali izražanje Oct4 in Sox2 v MSC z Western blot. Rezultati so pokazali, da sta bila Oct4 in ravni Sox2 beljakovin v MSC, ki so bili sočasno gojili z THP-1 celic (slika 1C) povečala. Da bi še dodatno potrjujejo ta pojav, smo pregledali tudi raven mRNA Oct4 in Sox2 v MSC. Rezultati PCR v realnem času so pokazali, da sodeluje kulture s celicami THP-1 navzgor regulirano ekspresijo Oct4 in Sox2 genov v MSC (Slika 1D). Na splošno ti rezultati kažejo, da so bili jem bistveno aktivira za proizvodnjo višje ravni vnetnih citokinov, ki jih sočasno gojenih celic THP-1 pod vnetja.

Makrofagi-aktivirani jem Izboljšane za neširjenje orožja in migracije iz želodca epitelnih celic

Makrofagi in jem sta pomembna sestavna dela tumorja mikrookolja. Za prikaz funkcionalne vloge makrofagov-aktivirani MSC, smo zbrali supernatantov iz aktiviranih MSC in inkubirali s želodca epitelijskih celic linije GES-1 za 48 ur. Nato smo izvedli nastanek celične kolonije testa za oceno proliferacijo celic GES-1. Kot je prikazano na sliki 2A, celice inkubirana z supernatanta iz aktiviranih MSC rasla hitreje in tvori več in večje kolonije od tistih v drugih skupinah. Poleg tega inkubacija s supernatantom iz aktiviranih MSC povečala tudi raven proteinskih PCNA in VEGF v GES-1 celic (slika 2b). Rezultati transwell migracijskega testa so pokazali, da je število migrirali ges-1 celic v aktiviranih MSC plus skupine LPS več kot v drugih skupinah (slika 2C). Rezultati Western blot analize so pokazale, da makrofagov-aktivirani jem povečala ekspresijo mezenhimskih označevalcev celic (N-kadherina in vimentina) in zmanjšano ekspresijo epitelijskega markerja (E-kadherina) v GES-1 celic (slika 2D). Naslednjič določimo ekspresijo VEGF, MMP9 in TGF-P z uporabo PCR v realnem času. Kot je prikazano na sliki 2E, inkubacijo s supernatantom iz aktivirati MSC plus skupino LPS navzgor regulirano ekspresijo VEGF, MMP9 in TGF-P v celicah GES-1. Tako MSC aktivirani makrofagi v vnetno okolju bistveno spodbujati širjenje želodca epitelij celic in migracije.

Makrofagi-aktivirani jem spodbujati rast in migracije želodčnega raka celic

Ker makrofagov-aktivirani jem vpliva želodca epitelnih proliferacijo celic in migracije naslednjič določen vpliv makrofagih-aktivirani MSC za rakom človek želodca HGC-27 celic. Rezultati celične kolonije oblikovanja testa so pokazali, da HGC-27 celic inkubiranih s supernatantom iz makrofagih-aktivirane MSC rasla hitreje in tvori večje klone kot druge skupine (slika 3A). Zahodni analize vijakov je pokazala, da so bile vsebnosti beljakovin v PCNA in VEGF v HGC-27 celic občutno navzgor ureja supernatanta iz makrofagih-aktivirani MSC (slika 3B). Transwell migracije testa so pokazali, da je število preseljenih HGC-27 celic presenetljivo povečala za supernatanta iz makrofagih-aktivirani MSC (slika 3c). Western blot analize so pokazale, da makrofagov-aktivirani jem inducirane ekspresije mezenhimskih celic označevalcev (N-kadherina in vimentina) in inhibira ekspresijo epitelijskega markerja (E-kadherina) v HGC-27 celice (slika 3D). Ravni mRNA za VEGF, MMP9 in TGF-ß so v HGC-27 celic poveča tudi po zdravljenju z supernatanta iz makrofagih-aktivirani MSC (Slika 3E). Glede na to, da je rakava celica stemness močno povezana z njihovo migracijo, smo zaznali izražanje stemness genov v HGC-27 celic. Izraz Oct4 in Sox2 je predvsem z supernatanta iz makrofagih-aktivirani MSC (Slika 3F) reguliran. V skladna z realnem času rezultatov PCR, so v HGC-27 celic povečala tudi količina beljakovin v Oct4 in Sox2 jih supernatanta iz makrofagih-aktivirani MSC (Slika 3G). Na kratko, ti rezultati kažejo, da makrofagov-aktivirani jem spodbuja tudi rast želodčni rak celic, migracije z indukcijo EMT in celične stemness pod vnetja.

makrofagov-aktivirani jem predstavljenih želodca Cell orožja in migracije skozi NF-KB κB Pathway

da bi raziskali mehanizma, odgovornega za spodbujanje vloge makrofagih-aktivirani MSC v celično proliferacijo in migracijo, smo ugotovili izražanje nekaterih ključnih signalnih pretvornike za vnetja in raka, vključno z stat3, ERK in NS -κB, v želodčnih epitelijskih celic in želodčnih rakavih celic. Rezultati Western blot analiz so pokazali, da so bile ravni p-stat3, p-ERK in p-NF-κB bistveno višja v celicah ges-1, zdravljenih z supernatantih iz aktiviranih MSC od tistih v drugih skupinah. Raven beljakovin NF-κB ni imela sprememb, medtem ko so za ERK in stat3 nekoliko zmanjšala (slika 4A). so opazili tudi povečanje p-stat3, p-ERK in ravni p-NF-κB beljakovin v HGC-27 celic po obdelavi z supernatantih iz aktiviranih MSC (slika 4B). Smo potrdili up-regulacijo p-stat3, p-ERK in ravni p-NF-κB beljakovin s supernatantih iz aktiviranih MSC v drugem želodčni rak celične linije SGC7901 (Slika S2). Če želite ugotoviti, ali so bili nižji stopnji ciljne geni so aktivirali tudi v HGC-27 celice, smo pregledali izražanje ciklin D1, C-myc in C-Jun proteinov. Kot je prikazano na sliki 4C, so bile vsebnosti beljakovin v ciklin D1 in C-Jun povišana po zdravljenju z supernatantih iz aktiviranih MSC.

V prihodnosti se ugotovi, ali NF-κB igra pomembno vlogo pri funkcijah aktivirana MSC, HGC-27 celice so predhodno obdelani z PDTC da inhibira NF-κB fosforilacije in nato inkubiramo z supernatantih iz aktiviranih MSC. Ugotovili smo, da je bila indukcija NF-κB fosforilacije z aktiviranimi MSC v HGC-27 celic močno zavira PDTC (slika 4D). Rezultati nastajanja celične kolonije in transwell migracijskih testi so pokazali, da je bilo okrepljeno širjenje in migracije HGC-27 celic, ki jih aktivirajo MSC bistveno zmanjša v PDTC zdravljenih skupinah (sliki 4E in 4f). Poleg tega PDTC zdravljenje zaviral tudi regulacijo navzgor VEGF, MMP9 in TGF-P, ki jih aktivirajo MSC v HGC-27 celice (slika 4G). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da so aktivirani jem hitro želodca epitelnih celic in orožja želodca rakava celica in migracije skozi NF-κB.

makrofagov-aktivirani jem predstavljenih želodca Rak Rast vivo

Glede na dokaza, da bi makrofagov-aktivirani jem povečati širjenje želodca celic in vitro
, smo vprašali, ali so te jem deluje spodbujanje vlogo pri rasti raka želodca in vivo
. Tako smo sodelovali vbrizga HGC-27 celic z aktiviranih MSC v golih miših. Dvajset dni kasneje, so bile odstranjene, merjeno in prilagojenih tumorskih tkiv. Kot je prikazano na slikah 5A in 5B, so ksenograftov tumorji na aktivirano jem co-vbrizganega skupine, večje od tistih v drugih skupinah. Imunohistokemične bil analiziran za določitev izražanje proteinov povezanih rasti in pro-angiogenskih faktorjev v tumorskih tkivih. Močnejši pozitivni obarvanje PCNA in VEGF opazili v aktivirani jem co-vbrizgano skupine (slika 5C). Realnem času analize PCR smo izvedli za odkrivanje ekspresije VEGF, MMP9 in TGF-P v tumorskih tkivih. Ugotovili smo, da je bilo izražanje vseh teh genov v sodelujočih vbrizga skupinah višja kot v HGC-27 celice same filter (Slika 5D). Rezultati v realnem času analize PCR je pokazala, da so bile ravni mRNA iz Oct4, Sox2 in Sall4 najvišja v aktivnem jem co-vbrizganega skupine (slika 5E). Skratka, ti podatki kažejo, da makrofagov-aktivirani jem hitro želodca rast raka in vivo
.

Osnovna monocitov Aktivirani jem, da zahteva Rak želodca celično proliferacijo in migracije skozi NF-κB

da bi še dodatno potrditev aktivacije MSC s makrofagov spodbudilo širjenje želodčni rak celic in migracij, smo izolirali monocite iz človeške periferne krvi in ​​zbrani supernatant iz monocitov diferencirana makrofagov. Po inkubaciji s supernatantom iz monocitov diferencirane makrofage smo jem poberemo in skupno RNA smo ekstrahirali v realnem času analize PCR. Kot je prikazano na sliki 6B, zdravljenje s supernatantom iz monocitov razlikuje makrofagov navzgor regulirano koncentracijo mRNA IL-6, IL-8, MCP-1 in VEGF v MSC. Nato smo inkubirali želodčne rakave celice s supernatantom iz aktiviranih MSC. Rezultati tvorbo celične kolonije in transwell migracij testi pokazali, da je supernatant iz aktiviranih MSC povečati proliferacije in migracije HGC-27 celice (sliki 6C in 6D). nadalje smo pokazali, da inkubacija z supernatantih iz aktiviranih MSC povečala ekspresijo p-stat3, p-ERK in p-NF-κB v HGC-27 celice (slika 6e). Če povzamemo, ti podatki kažejo, da je v skladu z celicah THP-1, človekove primarne makrofagov aktivira tudi MSC spodbudilo širjenje želodčni rak celic in migracije skozi NF-κB.

Pogovor

Med zadnjih desetletjih, je povezava vnetja raka pritegnila veliko pozornosti [5], [6]. Dolgotrajna izpostavljenost epitelijskih celic vnetnega mikrookolja vodi v maligno transformacijo [9], [19]. V stromalnih celic so pokazale, da se kritično sodeluje pri napredovanju vnetja raka z moduliranjem vnetno mikrookolje [7], [8]. Makrofagi in MSC dve glavni komponenti tumorja strome in sodelujejo pri urejanju obsega vnetno reakcijo med rakotvornost [16]. Vendar pa je prepletanje makrofagov in MSC pri raku želodca ni bila dobro označena.

Rak želodca je razvila iz dolgoročnega kronični gastritis in je klasičen model raka, povezanih z vnetjem. prej smo izolirali prebivališčem MSC iz človeških želodčnega tkiva raka in dokazala, da je rak želodca jem tkiva izhaja izloča veliko vnetnih citokinov in spodbuja želodčne napredovanje raka. Med procesom vnetja, monociti /makrofagi se lahko zaposlijo za financiranje MSC z tumor spodbujanje funkcij [16]. Poleg tega Helicobacter pylori
inducira kronično vnetje želodca epitelijskih celic s sprostitvijo LPS obstoječih v svojih celične stene. V tej študiji smo predhodno obdelani MSC z makrofagov v prisotnosti LPS, da posnemajo želodčnega raka mikrookolje in da ugotovi, ali makrofagov-aktivirane jem prispevajo k želodčne napredovanje raka. Pokazali smo, da MSC inkubirana z makrofagov in LPS izločajo višje stopnje vnetnih citokinov. Nedavna študija je poročala, da neprekinjena stimulacija z makrofagov pogojena srednje povzročene MSC pridobiti vnetno fenotip [17]. V skladu s svojo raziskavo, smo ugotovili, da je kratek čas inkubacije z makrofagov aktivira tudi MSC za proizvodnjo višjo raven vnetnih citokinov.

epitelijskih-mezenhimskih-prehod (EMT), je pomemben proces med metastaz raka [20]. V preteklih letih je bilo reprogramiranje lastnosti, povezane z EMT pripisati povečanje celične plastičnosti v rakavih celicah. Rak matičnih celic je bil uveden in dokazano, da prispevajo k tumorigeneze in tumorja metastaz [21] - [24]. Nedavne raziskave kažejo, da subpopulacija stebla podobnih in mezenhimskih podobnih celicah pokazali večjo tumorogenosti v želodčnih epitelnih celic in vitro in in vivo
[25]. V tej študiji smo ugotovili, da lahko aktivirane jem, ki so bile sočasno kultiviramo s makrofagov v prisotnosti LPS, izredno povečati migracijo epitelijskih celic želodca kakor tudi želodčne rakave celice. Poleg tega smo dokazali, da supernatanti s aktiviranih MSC inducirano EMT želodčnega epitelnih in želodčnih rakavih celic. Da bi še dodatno pojasnjujejo te rezultate, smo zaznali izražanje stemness genov v želodcu rakavih celic. Ugotovili smo, da je izražanje Oct4 in Sox2, dveh večjih povezanih stemness genov, je očitno povečala za aktiviranih MSC. Angiogenezo je ključnega pomena za tumorske metastaze in izražanje VEGF je tesno povezana z želodčno prognozo raka [26], [27]. Ugotovili smo, da je VEGF izraz bistveno povečala po zdravljenju z supernatantih iz aktiviranih MSC v želodcu rakavih celic, tako in vitro
in in vivo
. Na podlagi teh ugotovitev smo predlagali, da makrofagov-aktivirani jem izloča več vnetnih citokinov in spodbujati širjenje in prenos želodčnih rakavih celic z indukcijo EMT in celic stemness.

Številne študije so pokazale, da jem spodbujajo raka želodca rast po različnih poteh [28], [29] in nedavna študija je pokazala, da je VEGF izraz tesno povezana z NF-κB z rakom želodca [30]. Poleg tega, TGF-β igra pomembno vlogo pri nadzoru proliferacije celic, apoptozo, diferenciacije, migracije in razvoj zunajcelični matriks [31], [32]. Nedavne raziskave so pokazale, da TGF-β aktivira NF-κB in igra pomembno vlogo pri napredku sinergističnega aktivacije različnih poteh [33], [34]. TGF-β-posredovano indukcija MMP 9 (MMP9) so poročali, da je treba urediti s NF-κB in JNK poti [35]. -TNF spodbudila proizvodnja MMP9 aktivira tudi NF-κB in ERK signalnih poti [36]. Poleg tega je napredovanje želodčnih epitelnih celic želodčne rakavih celic pokazala, da ureja izražanje citokinov in NF-κB signalne poti [37]. Drugo poročilo kaže, da je za zaviranje tako proliferacijo in angiogenezo z intervencijo drog v rakom želodca, povezanih s preprečevanjem NF-κB [38]. V tej študiji smo pokazali, da makrofagov-aktivirani jem navzgor regulirano fosforilacijo NF-κB in ekspresijo VEGF, TGF-P in MMP9 v želodčnih celicah. Zaradi sočasnega povečanja stat3 in ERK fosforilacije lahko posledica aktivacije NF-κB, ker je bil NF-κB že dokazano, da urejanje stat3 in ERK signalne poti [39], [40].

Na koncu smo dokazano v tej študiji, ki jem aktivirani makrofagi pridobil vnetno fenotip in spodbujati želodcu epitelijskih celic in raka proliferacijo in migracijo s pomočjo aktivacije NF-κB. Naše ugotovitve zagotoviti nove dokaze za modulacijo želodca epitelnih celic in rakave celice, ki jih MSC pod vnetno okolje in nadaljnji vpogled v vlogi stromalnih celic v prehod iz kroničnega vnetja z rakom.

dodatne informacije
Slika S1.
Co-kultura MSC s celic THP-1. Reprezentativni slike celic THP-1 in MSC v enosmernem sistemu skupnega kulture pred (levo) in po (desno) PBS pranje. Povečava, x 100, obseg bar = 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0097569.s001
(IOD)
Slika S2.
Makrofagi aktivira MCSS povzroča aktivacije NF-κB v SGC-7901 celic. SGC7901 celice so bili zdravljeni z ekstraktu makrofagih-aktivirane MSC in izražanje p-stat3, stat3, p-ERK, ERK, je bilo odkritih p-NF-κB in NF-κB beljakovine v SGC-7901 celic z Western blot .
doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s002
(IOD)
Tabela S1.
Seznam primerskega sekvenc
doi:. 10,1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC)

• Plos ONE: Normalno fibroblastov izzivati ​​E-kadherina izgube in povečanje limfnih vozlov metastaz v želodca Cancer
• Plos ONE: prognostični Vrednost razmerja bezgavkah na stopnjo III Rak želodca bolnikih, ki so radikalne resekciji