PLoS ONE: Activering van mesenchymale stamcellen door macrofagen aanwijzingen Human maagkanker Groei door NF-KB Pathway

Abstract

Accumulerende aanwijzingen geven aan dat macrofagen activeren mesenchymale stamcellen (MSC) om pro-inflammatoire fenotype te verwerven. De rol van MSCs geactiveerde macrofagen bij maagkanker grotendeels onbekend. In deze studie hebben we vastgesteld dat MSCs werden geactiveerd door macrofagen tot verhoogde niveaus van inflammatoire cytokinen. Cel kolonievorming en transwell migratie assays bleek dat supernatanten van de geactiveerde MSCs zowel maag epitheelcellen maag en proliferatie van kankercellen en migratie kunnen bevorderen. Daarnaast werd de expressie van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), angiogenese en stemness-gerelateerde genen verhoogd geactiveerde MSC's. De gefosforyleerde vormen van NF-KB, ERK en STAT3 in gastrische cellen verhoogd met actieve MSCs. Inhibitie van NF-KB-activering door PDTC blokkeerde het effect van geactiveerde MSCs op maagkanker cellen. Co-injectie van actieve MSCs met maagkanker cellen kunnen gastrische kanker groei te versnellen. Bovendien humane perifeer bloed monocyten afgeleide macrofagen ook geactiveerd MSCs maag- proliferatie en migratie van kankercellen te roepen. Samengevat, onze bevindingen suggereren dat MSCs geactiveerd door macrofaag verwerven pro-inflammatoir fenotype en snelle maag kankergroei in een NF-KB-afhankelijke manier, waarop nieuwe gegevens voorziet de modulatie van MSC's van de tumor micro-omgeving en verder inzicht in de rol van stromale cellen in de maag carcinogenese en de progressie van kanker

Visum:. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) Activering van mesenchymale stamcellen door macrofagen aanwijzingen Human maagkanker Groei door NF-KB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Ontvangen: 18 februari 2014; Aanvaard: 21 april 2014; Gepubliceerd: 13 mei 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Major Research Plan van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91129718), de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81302119, 81201660, 81071421), de provincie Jiangsu voor Outstanding Sci-tech Innovation Team in Hogescholen en universiteiten (Grant no. SJK2013-10), de provincie Jiangsu's Project van wetenschappelijke en technologische innovatie en prestaties Transformation (Grant no.BL2012055), de provincie Jiangsu's Outstanding Medical Academische Leider en Sci-tech Innovation Team Program (Grant no.LJ201117), het Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (Grant no.BK2012709, BK20130540), Doctoraal Programma Stichting van het ministerie Onderwijs State (Grant nr. 20113227110011), de provincie Jiangsu voor Natuurlijke Scicence Onderzoek in Hogescholen en Universiteiten (13KJB320001). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en blijft een belangrijke oorzaak van kankersterfte wereldwijd [1], [2]. ongeveer 360.000 in China, zijn er mensen sterven aan maagkanker per jaar [3]. Hoewel de incidentie is afgenomen in de afgelopen jaren in het Westen, de overlevingskans nog erger is [4]. In de afgelopen decennia is veel inspanning uitgeoefend om de pathogenese van maagkanker helderen. Echter, het complex mechanisme van maagkanker nog onbedekt. Accumulerende bewijs geven aan dat op lange termijn chronische ontsteking is een van de belangrijkste oorzaken van het ontstaan ​​van tumoren. Afgifte van pro-inflammatoire mediatoren en verhoogde lokale niveaus van zuurstof en stikstof soorten kunnen bijdragen tot carcinogenese [5]. De ontregelde productie van cytokinen bij inflammatoire micro stimuleert de expressie van genen geassocieerd met de ontwikkeling van kanker en wijzigt structurele kenmerken van micro kanker initiatie en progressie versnellen [6] -. [9]

tumor micro bestaat uit verschillende bindweefselcellen , met inbegrip van infiltrerende immuuncellen,-carcinoom geassocieerd fibroblasten (cafe's), mesenchymale stamcellen (MSC), en het bloed en lymfatische vasculaire netwerken. Deze cellen met elkaar en vormen inflammatoire micro en bijdragen aan het ontstaan ​​van tumoren [10], [11]. Onder de stromale cellen, macrofagen, zo belangrijk immuun regulerende cellen, spelen een dominante rol in het beheer van een ontsteking in de tumor micro-omgeving. Bijvoorbeeld, macrofagen geïsoleerd uit tumor micro borstkankerpatiënten geheim chemotactische cytokinen metastase van carcinoom cellen [12] vergroten. Macrofagen ook aangetoond ontstekingsreactie en tumorigenese bevorderen door invloed op de expressie van inflammatoire cytokinen en moleculaire oncogene programma veranderen binnen epitheelcellen [13].

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een belangrijke component van de tumor micro-omgeving en worden beschouwd als voorlopercellen van kankergeassocieerde mesenchymale cellen en endotheelcellen [14]. De eerdere studies hebben aangetoond dat MSCs geheim oplosbare factoren proliferatie en metastase [10] kankercel bevorderen. Per-ontsteking geassocieerd maagkanker model, kunnen MSC's worden geactiveerd richting CAF chronische ontsteking en kanker progressie [15] te verhogen. Bovendien zijn MSCs gemeld rekruteren monocyten /macrofagen tumorgroei bevorderen met CCR2-depedent wijze [16]. Interacties tussen macrofagen en MSC's produceren een geactiveerde, pro-inflammatoire fenotype met hoge CXCL10 en IL-6 secretie, die de inflammatoire micro [17] kunnen beïnvloeden.

Maagkanker is een klassiek model van chronische ontsteking van kanker. De rol van MSCs geactiveerd door macrofagen bij maagkanker en de onderliggende mechanismen zijn nog grotendeels onbekend. In deze studie hebben we vastgesteld dat MSCs sterk werden geactiveerd door macrofagen onder ontsteking, inflammatoire cytokinen en tumor-bevorderende factoren produceren, wat leidt tot de versterking van maag epitheelcellen en kanker celproliferatie en migratie door de activatie van NF-kB route. Onze resultaten geven aan dat macrofagen geactiveerd MSC's te bevorderen maag groei en progressie van kanker onder inflammatoire aandoening.

Materialen en methoden

Cell Culture

Human maagkanker cellijn HGC-27, menselijke maag epitheel cellijn GES-1, en de menselijke acute monocytische leukemie cellijn THP-1 werden aangekocht van het Instituut voor Biochemie en Celbiologie aan de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). GES-1 en THP-1-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) met 10% foetaal runderserum (FBS, Invitrogen) en HGC-27-cellen werden aangehouden in hoog-glucose DMEM (H -DMEM, Invitrogen) met 10% FBS. MSCs werden afgeleid uit de navelstreng en gekweekt in laag glucose DMEM (L-DMEM, Invitrogen) met 10% FBS. Alle cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C in bevochtigde celkweek incubator met 5% CO _{2. De verse navelstreng weefsels werden verzameld van gezonde puerperale moeders na schriftelijke toestemming werd verkregen. MSCs werden geïsoleerd en gekarakteriseerd zoals eerder beschreven [18]. Alle experiment protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Jiangsu University. MSC's bij passage 3 werden geselecteerd voor experimenten.}

Supernatant Bereiding

Voor de bereiding van geassocieerde macrofaag MSCs supernatant, MSC (3 x 10 ^{5) werden uitgezaaid te hechten. THP-1-cellen (verhouding 1:01) toegevoegd met vers medium in aanwezigheid of afwezigheid van LPS (1 ug /ml). Na co-kweek gedurende 48 uur werd het medium verwijderd en de cellen werden voorzichtig gewassen met PBS om THP-1 cellen te verwijderen. De supernatanten van geactiveerde MSCs werden 24 uur later verzameld, gefilterd door een 0,22 um-filter en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. Bij gebruik voor celfunctie analyses werden de supernatanten van geactiveerde MSC gemengd met een gelijk volume van 10% FBS-bevattend DMEM-H of RPMI-1640 medium. Voor signaleringsroute-analyses werden de cellen behandeld met de supernatanten van geactiveerde MSC 1 uur}

Luminex Assay

Human cytokine &.; chemokine magnetische bead paneelkit (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) werd ontworpen om granulocyt koloniestimulerende factor (G-CSF) te detecteren, van bloedplaatjes afkomstige groeifactor-BB (PDGF-BB), monocyt chemoattractant eiwit 1 (MCP-1), tumornecrosefactor-α (TNF-α), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 en IL-8 in het supernatant van geactiveerde MSC's. Alle procedures werden verwerkt volgens de instructies van de fabrikant. De signalen werden gedetecteerd en geanalyseerd door Luminex200 System (Millipore).

Transwell Migratie Assay

Na behandeling met de supernatanten van geactiveerde MSCs voor 48 uur, GES-1 en HGC-27 cellen ( 1 x 10 ^{5 /putje) in de bovenste kamer (8 urn) (Corning, NY, USA) in serumvrij medium werden gebracht. De complete medium werd geplaatst in de onderste kamer. Na incubatie gedurende 12 uur werden cellen die overblijven onder in het polycarbonaat membraan afgeveegd met wattenstaafjes. De cellen die migreren naar de onderzijde van het membraan werden vervolgens gefixeerd met methanol gedurende 30 min. De gemigreerde cellen werden met kristalviolet gekleurd voor 15 minuten en geteld in zes willekeurige velden onder de microscoop (100 x).}

Cell Kolonie Formatie Assay

De cellen werden verzameld na behandeling met de supernatanten van MSCs voor 48 uur en geënt in 6-putjes (1000 cellen /putje) en gedurende 10 dagen. Het medium werd elke drie dagen vervangen. Aan het einde van de groeiperiode werden de cellen gefixeerd met methanol gedurende 30 minuten en gekleurd met kristalviolet gedurende 15 min. De celkolonies werden gefotografeerd en het aantal kolonies werd geteld voor statistische analyse.

RNA-extractie en real-time PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant . Vijf microgram van RNA werd gebruikt voor de kwantitatieve real-time PCR-analyse. β-actine werd gebruikt als een interne controle. De sequenties van specifieke primers werden alle in tabel S1.

Western Blot

De cellen werden gelyseerd en gehomogeniseerd in RIPA buffer gesupplementeerd met volledige proteaseremmers. Evenveel eiwitten (200 ug) werd opgelost in 12% SDS-PAGE. De eiwitten werden daarna overgebracht op PVDF membranen na elektroforese. Na geblokkeerd in 5% (w /v) vetvrije melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur werden de membranen vervolgens geïncubeerd bij hun geschikte verdunningen van specifieke primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. De bronnen van primaire antilichamen waren: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentine en anti-fosfo-STAT3 (Signalway antilichaam, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, China), anti-E-cadherine, anti- ERK1 /2, anti- fosfo-ERK1 /2 en anti-N-cadherine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-KB, anti-fosfo-NF- KB, anti-CyclinD1, anti-VEGF anti-c-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-c-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, USA).

Animal model

Drie tot vijf weken oude BALB /c naakt muizen werden gekocht bij SLAC Laboratory Animal Center (Shanghai, China). De dieren werden gehouden in overeenstemming met de institutionele beleid, en alle studies werden uitgevoerd met toestemming van de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van de dieren van Jiangsu University. HGC-27 cellen (1 x 10 ^{6) en MSC's (5 x 10 5) werden getrypsiniseerd, gewassen en geresuspendeerd in 200 pl PBS, respectievelijk. Vervolgens werden de cellen gemengd en samen geïnjecteerd in de linkerflank van naakt muizen. Tumoren werden chirurgisch verwijderd 20 dagen na injectie, gefotografeerd en gewogen. De tumorgrootte werd bepaald door meting caliper en berekend op basis van de gewijzigde ellipsoïde formule (L x B x W /2), waarin L staat voor de lengte en breedte W.}

Immunohistochemie

formaline vaste paraffine ingebedde muis tumorweefsel secties werden voor het eerst ontdaan van paraffine in xyleen, gerehydrateerd door middel ingedeeld ethanol. De coupes werden gekookt gedurende 10 min in citraatbuffer (pH 6,0, 10 mM) voor antigen herstel. De endogene peroxidase activiteit werd geremd bij blootstelling aan 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten. Vervolgens werden de plakjes geblokkeerd met 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, China) en geïncubeerd met verdunde juiste PCNA of VEGF primaire antilichaam bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na wassen met PBS werden de secties geïncubeerd met verdund secundair antilichaam gedurende 20 min. Tenslotte werden secties zichtbaar gemaakt met 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en vervolgens tegengekleurd met hematoxyline voor onderzoek door lichtmicroscopie (200 ×).

primaire humane monocyten Isolatie

Human monocyten werden verkregen uit buffy coat van perifere bloedmonsters gedoneerd door gezonde donor met behulp van Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Vers RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS werden elke 2 dagen vervangen en niet-hechtende cellen werden verwijderd en gezuiverd. Monocyten werden gedurende 7 dagen en 50 ng /ml M-CSF werd toegevoegd aan macrofagen (M) te verkrijgen. Vervolgens 24 h supernatant afgescheiden door macrofagen werd verzameld en gefiltreerd. Hechtende MSCs werden behandeld met de macrofaag supernatant in afwezigheid of aanwezigheid van LPS (1 ug /ml) gedurende 48 uur en gewassen. De supernatanten van geactiveerde MSC's werden 24 uur later verzameld en gebruikt voor het volgen van studies.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS Statistics software 16.0. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD. Verschillen in de verschillende groepen werden geanalyseerd met ANOVA. Verschillen tussen PDTC behandelingen werden getest door t Electronics Test. Statistische P
waarde < 0,05 werd als significant beschouwd

Resultaten

Co-cultuur met macrofagen Onder inflammatoire aandoening Up-regelde de expressie van inflammatoire cytokines en stemness Genes in. MSCs

Om het effect van macrofagen op MSCs onder ontstekingsaandoening onderzoeken we samen gekweekte MSC's met THP-1 cellen in afwezigheid of aanwezigheid van LPS (1 ug /ml) gedurende 48 uur. THP-1 cellen werden verwijderd door PBS wassen en hechtende MSCs werden gekweekt in vers medium gedurende nog 24 uur (figuur S1). Luminex test werd uitgevoerd om de niveaus van verschillende ontstekingsfactoren in de supernatanten van MSC's bepalen. De resultaten toonden aan dat de productie van IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF en G-CSF was significant in de supernatant toe van MSCs samen gekweekt met THP-1-cellen in de aanwezigheid van LPS. Lage of niet detecteerbare niveaus van deze cytokines waargenomen in MSC's die niet samen gekweekt met THP-1 cellen (Figuur 1A) waren. De verhoogde expressie van deze inflammatoire cytokines bevestigen we voorgevormde real-time PCR om de mRNA niveaus van deze cytokines gedetecteerd. We vonden dat in overeenstemming met de Luminex test resultaten (Figuur 1B), co-kweek met THP-1-cellen opgereguleerd de mRNA niveaus van IL-6, IL-8 en TNF-α in MSC's. Te bepalen of co-kweek met THP-1 cellen beïnvloedt de stemness van MSC's gedetecteerd we de expressie van Oct4 en Sox2 in MSC via Western blot. De resultaten toonden dat zowel Oct4 en Sox2 eiwitniveaus in MSC's die samen gekweekt met THP-1 cellen (figuur 1C) waren verhoogd. Om dit fenomeen verder te bevestigen, onderzoeken we ook het mRNA niveaus van Oct4 en Sox2 in MSC's. De resultaten van real-time PCR toonde aan dat co-kweek met THP-1-cellen opgereguleerd expressie van het Oct4 en Sox2 genen in MSC's (figuur 1D). In het algemeen zijn deze resultaten suggereren dat MSCs werden geactiveerd significant hogere niveaus van inflammatoire cytokinen door co-gekweekte THP-1 cellen onder ontstekingsaandoening.

macrofagen geactiveerd MSC verbeterde de proliferatie en migratie van maagepitheelcellen

Macrofagen en MSC's zijn belangrijke onderdelen van de tumor micro-omgeving. Om de functionele rol van macrofagen geactiveerd MSCs demonstreren we de supernatanten van geactiveerde MSCs verzameld en geïncubeerd met maagepitheel cellijn GES-1 gedurende 48 uur. Vervolgens verricht cellen kolonievorming assay de proliferatie van GES-1-cellen te evalueren. Zoals getoond in Figuur 2A, de cellen geïncubeerd met supernatant van geactiveerde MSC's groeiden sneller en vormden steeds grotere kolonies dan die in andere groepen. Bovendien incubatie met het supernatant van geactiveerde MSCs verhoogde eveneens de eiwitniveaus van PCNA en VEGF in GES-1-cellen (Figuur 2B). De resultaten van Transwell migratie analyse bleek dat het aantal gemigreerde GES-1 cellen geactiveerd MSCs plus LPS groep meer dan in andere groepen (Figuur 2C). De resultaten van Western blot-analyses toonden aan dat geactiveerde macrofagen-MSC verhoogde de expressie van mesenchymale cellen merkers (N-cadherine en vimentine) en verminderde de expressie van epitheelcel merker (E-cadherine) in GES-1-cellen (Figuur 2D). We vervolgens bepaald de expressie van VEGF, MMP9 en TGF-β met real-time PCR. Zoals getoond in figuur 2E, incubatie met het supernatans van activate MSCs plus LPS groep tot gereguleerde expressie van VEGF, MMP9 en TGF-β in GES-1 cellen. Dus, MSC's geactiveerd door macrofagen in inflammatoire milieu aanzienlijk bevorderd maag-proliferatie en migratie epitheel cel.

macrofagen geactiveerd MSC Bevorderd de groei en migratie van maagkanker Cellen

Sinds-macrofagen geactiveerd MSC's invloed op de maag epithele celmigratie en proliferatie, we vervolgens bepaald het effect van geactiveerde macrofagen MSCs menselijke maagkanker HGC-27 cellen. De resultaten van cellen kolonievorming assay toonde dat HGC-27 cellen geïncubeerd met het supernatant van geactiveerde macrofagen-MSC's sneller groeide en vormde klonen groter dan de andere groepen (Figuur 3A). Western bout analyses bleek dat het eiwit niveaus van PCNA en VEGF in HGC-27-cellen significant up-gereguleerd door het supernatant van geactiveerde macrofagen-MSC's (Figuur 3B). Transwell migratie analyse bleek dat het aantal gemigreerde HGC-27-cellen opvallend werd verhoogd door het supernatant van geactiveerde macrofagen-MSC's (Figuur 3C). Western blot-analyses toonden aan dat geactiveerde macrofagen-MSC's induceerde de expressie van mesenchymale cellen merkers (N-cadherine en vimentine) en remde de expressie van epitheelcel merker (E-cadherine) in HGC-27-cellen (Figuur 3D). De mRNA-niveaus van VEGF, MMP9 en TGF-β werd opgetrokken in HGC-27 cellen na behandeling met het supernatant van geactiveerde macrofagen-MSC's (Figuur 3E). Gezien het feit dat kankercel stemness sterk gekoppeld aan hun migratie, ontdekt we de expressie van genen in stemness HGC-27 cellen. De expressie van Oct4 en Sox2 was met name up-gereguleerd door de bovenstaande vloeistof uit-macrofagen geactiveerd MSC's (figuur 3F). In overeenstemming met de real-time PCR resultaten, werden de eiwitniveaus van Oct4 en Sox2 ook in HGC-27 cellen vermeerderd met de supernatant van geactiveerde macrofagen-MSC's (Figuur 3G). Kortom, deze resultaten suggereren dat geactiveerde macrofagen MSCs ook bevorderd gastrische kanker celgroei, migratie door de inductie van EMT en cellen stemness onder ontstekingsaandoening.

-geactiveerde macrofagen MSC gesponsorde Gastric celproliferatie en migratie door NF- KB Weg

om het mechanisme verantwoordelijk is voor de bevordering rol van macrofagen geactiveerd MSC proliferatie en cel migratie onderzoeken, hebben we de expressie van een aantal belangrijke signalen transducers voor ontsteking en kanker, met inbegrip van STAT3, ERK en NF -κB, in maagepitheelcellen en maagkanker cellen. De resultaten van Western blot-analyses toonden aan dat de niveaus van p-STAT3, p-ERK en p-NF-KB significant hoger in GES-1 cellen behandeld met de supernatanten van geactiveerde MSC's dan in andere groepen. Het eiwit niveau van NF-KB had geen verandering, terwijl die van de ERK en STAT3 licht gedaald (Figuur 4A). De toename van p-STAT3, p-ERK en p-NF-KB eiwitniveaus werden ook waargenomen in HGC-27 cellen na behandeling met de supernatanten van de geactiveerde MSCs (Figuur 4B). We bevestigden de up-regulatie van p-STAT3, p-ERK en p-NF-KB eiwitniveaus de supernatanten van de geactiveerde MSC's in een andere maagkanker cellijn SGC7901 (Figuur S2). Om te bepalen of de downstream doelgenen werden ook geactiveerd HGC-27 cellen, onderzochten we de expressie van cycline D1, C-myc en c-Jun-eiwitten. Zoals getoond in Figuur 4C, werden de eiwitniveaus van Cycline D1 en C-Jun verhoogd na behandeling met de supernatanten van de geactiveerde MSCs.

Om toekomstige bepalen of NF-KB speelt een belangrijke rol in de functies van geactiveerde MSCs, HGC-27 cellen werden voorbehandeld met PDTC NF-KB-fosforylering te remmen en vervolgens geïncubeerd met supernatanten van de geactiveerde MSCs. We vonden dat de inductie van NF-KB fosforylatie door geactiveerde MSCs in HGC-27 cellen aanzienlijk werd geremd door PDTC (figuur 4D). De resultaten van celvorming kolonie en transwell migratie assays bleek dat de verhoogde proliferatie en migratie van HGC-27 cellen door het geactiveerde MSCs aanzienlijk werden verlaagd PDTC behandelde groepen (Figuren 4E en 4F). Verder PDTC behandeling remde ook de up-regulatie van VEGF, MMP9 en TGF-β door geactiveerde MSC in HGC-27-cellen (figuur 4G). Samengenomen geven deze resultaten aan dat de geactiveerde MSCs prompt maag epitheelcellen en gastrische kanker proliferatie en migratie van cellen door middel van NF-KB.

-geactiveerde macrofagen MSC gesponsorde Gastric kankergroei in vivo

Aangezien de bewijs dat-macrofagen geactiveerd MSC maag celproliferatie kon verbeteren in vitro
, vroegen we ons af of deze MSC uitgeoefend bevorderen rol in de maag de groei van kanker in vivo
. Zo hebben we co-geïnjecteerd HGC-27 cellen met de geactiveerde MSC's in naakt muizen. Twintig dagen later werden tumorweefsels verwijderd, gemeten en gewogen. Zoals getoond in figuren 5A en 5B, de xenograft tumoren in geactiveerde MSC co-geïnjecteerde groep was groter dan die in andere groepen. Immunohistochemische analyses werden uitgevoerd om de expressie van groeigerelateerde proteïnen en pro-angiogene factoren bepalen in tumorweefsels. De sterkere positieve kleuring van PCNA en VEGF werd waargenomen in geactiveerde MSC co-geïnjecteerde groep (Figuur 5C). Real-time PCR-analyses werden uitgevoerd om de expressie van VEGF, MMP9 en TGF-β detecteren in tumorweefsels. We vonden dat de expressie van deze genen in co-geïnjecteerde groepen waren hoger dan in HGC-27 cellen alleen groep (figuur 5D). De resultaten van real-time PCR-analyses toonden aan dat de mRNA niveaus van Oct4, Sox2 en Sall4 waren het hoogst in geactiveerde MSC co-geïnjecteerde groep (Figuur 5E). Kortom, deze gegevens aan dat-macrofagen geactiveerd MSC prompt maag kanker groei In vivo
.

primaire monocyten Activated MSC op Vragen maagkanker cel Proliferatie en migratie door NF-KB

om de activatie van macrofagen door MSCs bevestigen verder de maag proliferatie en migratie van kankercellen prompt, die we monocyten uit humaan perifeer bloed en de supernatant van monocyten gedifferentieerd macrofagen verzameld. Na incubatie met het supernatans van monocyten gedifferentieerde macrofagen, werden MSC's geoogst en het totale RNA werd geëxtraheerd real-time PCR-analyses. Zoals getoond in figuur 6B, behandeling met het supernatans van gedifferentieerde monocyten macrofagen opwaarts gereguleerd de mRNA niveaus van IL-6, IL-8, MCP-1 en VEGF in MSC's. Vervolgens geïncubeerd maagkanker cellen met supernatant van de geactiveerde MSCs. De resultaten van celvorming kolonie en transwell migratie assays toonden dat de supernatant van de geactiveerde MSC's bevorderen de proliferatie en migratie van HGC-27-cellen (figuren 6C en 6D). Verder hebben we aangetoond dat incubatie met supernatanten van de geactiveerde MSCs verhoogde de expressie van p-STAT3, p-ERK en p-NF-KB in HGC-27 cellen (figuur 6E). Samengenomen suggereren deze gegevens dat in overeenstemming met de THP-1-cellen, humane primaire macrofagen ook geactiveerd MSCs maag- proliferatie en migratie van kankercellen begeleidt bij NF-KB.

Discussie

Tijdens de afgelopen decennia is de koppeling van ontsteking kanker is veel aandacht getrokken [5], [6]. Langdurige blootstelling van epitheelcellen inflammatoire micro leidt tot kwaadaardige transformatie [9], [19]. De stromale cellen is aangetoond kritisch betrokken bij de progressie van ontsteking van kanker door het moduleren van de inflammatoire micro [7], [8]. Macrofagen en MSC's zijn twee belangrijke componenten van de tumor stroma en deelnemen aan het reguleren van de mate van ontstekingsreactie tijdens carcinogenese [16]. Echter, de wisselwerking tussen macrofagen en MSC's bij maagkanker is nog niet goed gekarakteriseerd.

Maagkanker is geëvolueerd van langdurige chronische gastritis en is een klassiek model van ontsteking gerelateerde kanker. We hebben eerder geïsoleerd inwoner MSC's uit menselijke maagkanker weefsels en aangetoond dat maagkanker weefsel afkomstig MSC uitgescheiden veel inflammatoire cytokines en bevorderd maagkanker progressie. Tijdens het proces van ontsteking, monocyten /macrofagen kunnen worden aangesteld MSCs met tumorbevorderend kenmerken [16] te voorzien. Daarnaast Helicobacter pylori
induceren chronische ontsteking in het maag epitheelcellen door het vrijkomen van LPS bestaande in de celwanden. In deze studie hebben we voorbehandeld MSC's met macrofagen in de aanwezigheid van LPS aan maagkanker micro bootsen en te bepalen of-geactiveerde macrofagen MSCs bijdragen aan maagkanker progressie. We aangetoond dat MSC's geïncubeerd met LPS macrofagen en afgescheiden hogere niveaus van inflammatoire cytokines. Een recente studie rapporteerde dat continue stimulatie met macrofagen geconditioneerd medium geïnduceerd MSCs een pro-inflammatoir fenotype [17] te verkrijgen. In overeenstemming met hun studie, vonden we dat korte tijd incubatie met macrofagen ook geactiveerd MSC's van een hoger niveau van inflammatoire cytokines te produceren.

-mesenchymale transitie (EMT) is een belangrijk proces in de loop van de uitzaaiing van kanker [20]. Door de jaren heen hebben herprogrammering eigenschappen die verband houden EMT toegeschreven aan cellulaire plasticiteit in kankercellen versterken. stam kankercel is ingevoerd en getoond bij te dragen aan het ontstaan ​​van tumoren en tumormetastase [21] - [24]. Recente studies suggereren dat een subpopulatie van steelachtige en mesenchymale-achtige cellen vertoonden een grotere tumorigeniciteit in maagepitheelcellen in vitro en in vivo
[25]. In deze studie hebben we vastgesteld dat geactiveerd MSCs, die samen gekweekt met macrofagen in de aanwezigheid van LPS waren opmerkelijk kan verbeteren de migratie van maagepitheelcellen en maagkanker cellen. Bovendien toonden we aan dat supernatanten van de geactiveerde MSC geïnduceerde EMT maagepitheel en maagkanker cellen. Om deze resultaten verder te verklaren, gedetecteerd we de expressie van genen in stemness maagkanker cellen. We vonden dat de expressie van Oct4 en Sox2, twee zware stemness gerelateerde genen was duidelijk verhoogd door de geactiveerde MSCs. Angiogenese is essentieel voor tumormetastase en de expressie van VEGF is nauw gerelateerd aan maagkanker prognose [26], [27]. We vonden dat VEGF-expressie was significant toegenomen na behandeling met de supernatanten van de geactiveerde MSCs bij maagkanker cellen zowel in vitro Kopen en In vivo
. Op basis van deze bevindingen hebben we voorgesteld dat-geactiveerde macrofagen MSC uitgescheiden meer inflammatoire cytokines en bevorderde de proliferatie en migratie van maagkanker cellen door de inductie van EMT en cellen stemness.

Verschillende studies hebben aangetoond dat MSC's bevorderen maagkanker groei via verschillende routes [28], [29] en een recente studie heeft aangetoond dat VEGF expressie nauw verwant aan NF-KB bij maagkanker [30]. Bovendien TGF-β speelt een belangrijke rol bij de controle celproliferatie, apoptose, differentiatie, migratie en extracellulaire matrix ontwikkeling [31], [32]. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat TGF-β activeert NF-KB en speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van synergistische activatie van verschillende pathways [33], [34]. TGF-β-gemedieerde inductie van matrix metalloproteïnase 9 (MMP9) gemeld worden gereguleerd door NF-KB en JNK pathways [35]. TNF gestimuleerde productie MMP9 activeert NF-KB en ERK signalerende routes [36]. Daarnaast is de progressie van maagepitheelcellen maagkanker cellen aangetoond worden geregeld door cytokine expressie en NF-kB signaling pathway [37]. Een ander rapport suggereert dat remming van zowel proliferatie en angiogenese met drugsinterventies bij maagkanker is gerelateerd aan de onderdrukking van NF-KB [38]. In deze studie hebben we aangetoond dat geactiveerde macrofagen-MSC opgereguleerd de fosforylering van NF-kB en de expressie van VEGF, TGF-β en MMP9 gastrische cellen. De gelijktijdige toename van STAT3 fosforylatie en ERK kunnen voortvloeien uit de activering van NF-KB, omdat NF-KB is eerder aangetoond dat STAT3 reguleren en ERK signalerende routes [39], [40].

Kortom, we aangetoond in deze studie dat MSCs geactiveerd macrofagen verkregen pro-inflammatoir fenotype en bevorderd maag epitheelcellen en kanker celproliferatie en migratie door NF-KB activering. Onze bevindingen nieuw bewijs voor de modulatie van maagepitheelcellen en kankercellen door MSCs onder inflammatoire milieu en verder inzicht in de rol van stromale cellen in de progressie van chronische ontsteking tot kanker.

Ondersteunende informatie
figuur S1.
Co-cultuur van MSC's met THP-1-cellen. Representatieve beelden van THP-1-cellen en MSCs in een directe co-kweeksysteem voor (links) en na (rechts) PBS wassen. Vergroting, × 100, schaal bar = 50 pm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0097569.s001
(TIF)
Figuur S2.
Macrofagen geactiveerd MCSs geïnduceerde activering van NF-KB in SGC-7901 cellen. SGC7901 cellen werden behandeld met de supernatanten van macrofagen geactiveerd MSC en de expressie van p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-KB en NF-KB-eiwitten in SGC-7901 cellen werden gedetecteerd door Western blot .
doi: 10.1371 /journal.pone.0097569.s002
(TIF)
Tabel S1. Nederlands Lijst van primersequenties
doi:. 10.1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC)

• PLoS ONE: normale fibroblasten Laten E-cadherine Verlies en verhoog lymfekliermetastasen in Gastric Cancer
• PLoS ONE: prognostische waarde van de lymfkliertest Ratio in Fase III MaagKanker patiënten die een radicale resectie