PLoS One: Aktivointi mesenkymaalisten kantasolujen makrofagit Kehotteet Human mahasyövän Kasvua NF-KB Pathway

tiivistelmä

Kertyvät tulokset viittaavat makrofagit aktivoivat mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) hankkimaan tulehdusta edistävä fenotyyppi. Kuitenkin rooli MSC: aktivoida makrofagien mahasyövässä edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MSC: t aktivoitiin makrofageja tuottamaan kohonneeseen tulehduksellisten sytokiinien. Cell pesäkkeenmuodostus ja siirtokuoppaan muuttoliike määritykset paljastivat, että supernatantit aktivoidusta MSC: t voivat edistää sekä mahalaukun epiteelisolujen ja mahasyövän solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Lisäksi, ekspression epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), angiogeneesi, ja stemness liittyvien geenien lisääntynyt aktivoitu MSC-. Fosforyloitu muodot NF-KB, ERK ja STST3 mahalaukun solut lisääntyivät aktiivinen MSC:. NF-KB: n aktivoitumisen PDTC estetty vaikutuksesta aktivoitua MSC: n vaikutusta mahalaukun syövän soluissa. Co-injektion aktivoitua MSC: mahalaukun syövän solut voitaisiin nopeuttaa mahalaukun syövän kasvua. Lisäksi ihmisen ääreisveren monosyytit johdettujen makrofaagien aktivoituu myös MSC: kysymään mahasyövän solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Yhdessä meidän havainnot viittaavat, että MSC: t aktivoituvat makrofagien hankkia proinflammatoristen fenotyyppi ja nopea mahasyövän kasvun NF-KB-riippuvaisella tavalla, joka tarjoaa uusia todisteita modulaatioon MSC: kasvaimen mikroympäris- ja tarkempi käsitys rooliin strooman solut mahasyövän ja syövän etenemistä.

Citation: Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) aktivointi mesenkymaalisten kantasolujen makrofagit Kehotteet Human mahasyövän Kasvua NF-KB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 18 helmikuu 2014; Hyväksytty: 21 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 13, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Major Tutkimussuunnitelma National Natural Science Foundation of China (Grant nro 91129718), National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81302119, 81201660, 81071421), Jiangsu erinomaisesta Sci-tech Innovation Team yliopistot (Grant no. SJK2013-10), Jiangsu n projekti tieteellisen ja teknologisen innovaation ja saavutukset Transformation (Grant no.BL2012055), Jiangsun maakunnassa erinomaisena Medical Academic Leader ja Sci-tech Innovation Team Program (Grant no.LJ201117), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (Grant no.BK2012709, BK20130540), tohtorikoulutuskeskukselle Foundation valtion Opetusministeriö (Grant no. 20113227110011), Jiangsun maakunnassa Natural Scicence tutkimus yliopistot (13KJB320001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi useimmin esiintyvien pahanlaatuisten kasvainten ja pitää merkittävä syy syöpään kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1], [2]. Kiinassa on noin 360000 yksilöitä kuolee mahasyövän vuosittain [3]. Vaikka ilmaantuvuus on vähentynyt viime vuosina länsimaissa, selviytyminen on vielä pahempi [4]. Viimeisten vuosikymmenten suuria ponnistuksia on kohdistama valaista patogeneesiin mahasyövän. Kuitenkin monimutkainen mekanismi mahasyövän edelleen paljaana. Kertyvät todisteet osoittavat, että pitkäaikainen krooninen tulehdus on yksi johtavista syistä kasvaimen. Release proinflammatoristen välittäjien ja lisääntynyt paikallisella tasolla hapen ja typen lajit voivat edistää syövän synnyn [5]. Säädeltyyn sytokiinien tulehduksellisessa mikroympäristön stimuloi geenien ilmentymistä, jotka liittyvät syövän kehittymisen ja muutetaan rakenteelliset piirteet mikroympäristön nopeuttaa syövän taudin alkamisen ja etenemisen [6] - [9].

Tumor microenvironment koostuu erilaisista stroomasoluissa , kuten soluttautuminen immuunisolujen, karsinooma liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin), mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t), ja veren ja imusuonten verisuoniverkostoja. Nämä solut ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa ja muodostavat tulehduksellinen mikroympäristön ja edistää kasvaimen kehittymisen [10], [11]. Niistä strooman, makrofagit, yhtä tärkeä immunosäätelyvaikutuksia soluja, hallitseva asema hallinnassa tulehduksen kasvaimen mikroympäristössä. Esimerkiksi makrofagien eristetty kasvaimen mikroympäris- rintasyöpäpotilaiden salainen kemotaktisia sytokiineja laajentaa etäpesäkkeiden karsinoomasolut [12]. Makrofagien on myös osoitettu edistävän tulehduksellinen vaste ja kasvaimen kehittymisen kautta vaikuttavia ilmentymisen tulehduksellisten sytokiinien ja muuttamalla molekyyli onkogeeninen ohjelmat epiteelisolujen [13].

Mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ovat toinen tärkeä osa kasvaimen mikroympäristö ja pidetään prekursorisolujen liittyvän syövän mesenkymaalisten solujen ja endoteelisolujen [14]. Edelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että MSC: salainen liukeneva tekijöitä edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden [10]. In tulehdukseen liittyvästä mahasyövän malli, MSC: t voidaan aktivoida kohti valuuttalisiin lisätä kroonisen tulehduksen ja syövän etenemistä [15]. Lisäksi MSC: t on raportoitu rekrytoida monosyyttien /makrofagien edistää tuumorin kasvua CCR2-depedent tavalla [16]. Vuorovaikutukset makrofageja ja MSC tuottaa aktivoitu, proinflammatoristen ilmiasuun korkea CXCL10 ja IL-6 eritystä, mikä voi vaikuttaa tulehduksellinen microenvironment [17].

Mahalaukun syöpä on klassinen malli kroonisen tulehduksen syöpään. Kuitenkin rooli MSC: aktivoida makrofagi mahasyövän ja taustalla mekanismi ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MSC: t olivat vahvasti aktivoitiin makrofagit alle tulehdustila, tuottaa tulehdusta edistävien sytokiinien ja kasvaimen edistävät tekijät, jotka johtavat parantamiseksi mahalaukun epiteelisolujen ja syövän solujen lisääntymistä ja maahanmuuton NF-KB-reitin. Tuloksemme osoittavat, että makrofagit aktivoituvan MSC: t edistävät mahalaukun syövän kasvua ja etenemistä alle tulehdustila.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen mahalaukun syövän solulinja HGC-27, ihmisen mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1, ja ihmisen akuutti monosyyttileukemiasolulinja THP-1 hankittiin Institute Biokemian ja solubiologian at Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). GES-1 ja THP-1-soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen), ja HGC-27-soluja ylläpidettiin korkean glukoosin DMEM (H -DMEM, Invitrogen), jossa oli 10% FBS: ää. MSC: t olivat peräisin napanuoran ja viljeltiin vähän glukoosia DMEM (L-DMEM, Invitrogen), jossa oli 10% FBS: ää. Soluja kaikki inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa soluviljelmässä inkubaattorissa 5% CO _{2. Tuoretta napanuorakudoksessa kerättiin terveiltä puerperal äidit jälkeen kirjallinen suostumus saatiin. MSC: t eristettiin ja karakterisoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kaikki koe protokollat ​​hyväksyttiin eettisen komitean Jiangsu University. MSC: t on passage 3 valittiin kokeissa.}

Supernatantti valmistelu

valmistamiseksi makrofagien liittyvän MSC: supernatantti, MSC: t (3 x 10 ^{5) ympättiin kiinni. THP-1-soluja (1:01 suhde), lisättiin tuoretta väliainetta läsnä ollessa tai ilman LPS: ää (1 ug /ml). Sen jälkeen kun yhdessä viljelemisen 48 tuntia, väliaine poistettiin ja solut pestiin varovaisesti PBS poistamiseksi THP-1-soluja. Supernatantit aktivoitu MSC: t kerättiin 24 tuntia myöhemmin, suodatetaan 0,22 um suodattimen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kun käytetään solujen toimintaa analyysejä, supernatantit aktivoitu MSC: t sekoitettiin yhtä suuri tilavuus 10% FBS: ää sisältävää H-DMEM tai RPMI-1640-väliaine. Sillä signalointireitin analyysit, soluja käsiteltiin supernatantit aktivoitu MSC: ssa 1 tunti.}

Luminex Assay

Human sytokiini & kemokiini magneettihelmi paneeli kit (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Bedford, MA, USA) on suunniteltu havaitsemaan granulosyyttikasvutekijä (G-CSF), verihiutaleperäinen kasvutekijä-BB (PDGF-BB), monosyyttien kemoattraktantti proteiini- 1 (MCP-1), tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 ja IL-8: supernatantti aktivoidaan MSC: t. Kaikki menettelyt prosessoitiin valmistajan ohjeiden. Signaalit havaittiin ja analysoitiin käyttämällä Luminex200 System (Millipore).

Transwell Migration Pitoisuus

käsittelyn jälkeen supernatantit aktivoitu MSC: ssa 48 tuntia, GES-1 ja HGC-27-soluja ( 1 x 10 ^{5 /kuoppa) pantiin saliin (8 um) (Corning, NY, USA) seerumittomassa väliaineessa. Täydellinen väliaine pantiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 12 tuntia, solut jäljellä alareunassa polykarbonaattimembraanille pyyhittiin pois vanutupoilla. Solut vaeltavat alapintaan kalvon kiinnitettiin sitten metanolin kanssa 30 min. Siirrettyjä solut värjättiin Crystal violetti 15 minuuttia ja laskettiin kuusi sattumanvaraisesti aloilla mikroskoopilla (100 x).}

Cell pesäkemuodostusta

Solut kerättiin käsittelyn jälkeen supernatantit MSC: t 48 tuntia ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1000 solua /kuoppa) ja viljeltiin 10 päivää. Väliaine vaihdettiin joka kolmas päivä. Lopussa kasvun aikana, solut kiinnitettiin metanolilla 30 minuutin ajan ja värjättiin kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Solun pesäkkeet valokuvattiin ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin tilastollista analyysiä.

RNA uuttaminen ja Real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden . Viisi mikrogrammaa RNA: ta käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR-analyysillä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Sekvenssit aluketta kaikki taulukossa S1.

Western Blot

Solut hajotettiin ja homogenoitiin RIPA puskuri täydennetty täydellinen proteaasinestäjät. Sama määrä proteiineja (200 gg) erotettiin 12% SDS-PAGE. Sitten proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille elektroforeesin jälkeen. Sen jälkeen estetty 5% (w /v) rasvatonta maitoa 1 h huoneen lämpötilassa, kalvot inkuboitiin sitten niiden sopivia laimennoksia spesifisten primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Lähteinä ensisijainen vasta-aineet olivat: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentiinistä ja anti-fosfo-STAT3 (Signalway Antibody, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Kiina), anti-E-kadheriinin, anti- ERK1 /2, anti- fosfo-ERK1 /2 ja anti-N-kadheriinin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-KB: n, anti-fosfo-NF KB: n, anti-CyclinD1, anti-VEGF ja anti-C-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-C-myc (ProteinTech Group, Chicago, IL, USA).

Animal Malli

Kolmesta viiteen viikon ikäisten BALB /c-nude-hiiriä ostettiin SLAC Laboratory Animal Center (Shanghai, Kiina). Eläimet pidettiin mukaisesti antamia ohjeita, ja kaikki tutkimukset suoritettiin hyväksynnällä yliopiston komitean käytön ja hoidon Animals Jiangsu University. HGC-27-solut (1 x 10 ^{6) ja MSC (5 x 10 5) trypsinoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen 200 ui PBS: ää, tässä järjestyksessä. Sitten solut sekoitettiin ja co-ruiskutetaan vasempaan kylkeen nude-hiirissä. Kasvaimet poistettiin kirurgisesti 20 päivän kuluttua injektion, valokuvataan ja painotettuna. Tuumorin koko arvioitiin mittaamalla tulkilla ja lasketaan muunnetun ellipsoidin kaavan (L x W x W /2), jossa L edustaa pituutta, ja W on leveys.}

immunohistokemia

for- maliini- kiinteä parafinoidut hiiri kasvainkudossektioista ensin parafiini ksyleenillä, vedettömät kautta arvostellaan etanolia. Leikkeet keitettiin 10 min sitraattipuskurissa (pH 6,0, 10 mM) antigeenin haku. Endogeenisen peroksidaasin estyi altistuminen 3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan. Sitten leikkeet blokattiin 5% BSA: ta (Boster Bioengineering, Wuhan, Kiina) ja inkuboitiin asianmukaisesti laimennetun PCNA tai VEGF primaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen pestiin PBS: llä, leikkeet sitten inkuboitiin laimennetulla sekundaarisen vasta-aineen kanssa 20 min. Lopuksi osat tehtiin näkyviksi 3,3'-diaminobentsidiini (DAB) ja sitten vasta- värjättiin hematoksyliinillä tutkittavaksi valomikroskoopilla (200 x).

Ensisijainen ihmisen mono- Isolation

Ihmisen monosyyttejä saatiin buffy coat of aäreisverinäytteiden lahjoittanut terveen luovuttajan käyttämällä Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Tuore RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää vaihdettiin joka 2 päivää, ja tarttumattomat solut poistettiin ja puhdistettiin. Monosyyttejä inkuboitiin 7 päivää ja 50 ng /ml M-CSF: ää, lisättiin, jolloin saatiin makrofageja (M). Sitten 24 h supernatantin erittämä makrofagien kerättiin ja suodatettiin. Kiinnittyneet MSC: t käsiteltiin makrofagien supernatantin läsnä ollessa tai ilman LPS: ää (1 ug /ml) 48 tuntia ja pestään. Supernatantit aktivoitu MSC: kerättiin 24 tuntia myöhemmin ja käytettiin seuraavissa tutkimuksissa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin SPSS Statistics ohjelmisto 16.0. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Erot eri ryhmien analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA. Erot PDTC hoitojen testattiin t
testiä. Tilastollinen P
arvo < 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Co-kulttuuri makrofageihin Under tulehdustila Up-säänneltyjen ilmentymisen inflammatoristen sytokiinien ja Stemness Geenit MSC: t

vaikutuksen tutkimiseksi makrofagien on MSC: eiden mukaisesti tulehdustila, yhteisrahoittaisimme viljeltiin MSC: THP-1-solujen läsnä ollessa tai ilman LPS: ää (1 ug /ml) 48 tuntia. THP-1-solut poistettiin PBS pesemällä ja kiinnittyneet MSC: eitä viljeltiin tuoreessa väliaineessa vielä 24 h (kuvio S1). Luminex -koe sen määrittämiseksi tasoille useiden tulehduksellisten tekijöitä supernatanteista MSC:. Tulokset osoittivat, että IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF: n ja G-CSF oli merkittävästi lisääntynyt supernatantti MSC: viljeltiin yhdessä THP-1-soluja, kun läsnä oli LPS: ään. Alhainen tai havaitsemattomia Näiden sytokiinien tasot havaittiin MSC-, jotka eivät olleet viljeltiin yhdessä THP-1-soluja (kuvio 1A). Vahvistaa lisääntyneen ekspression näiden tulehduksellisten sytokiinien, me muotoon real-time PCR havaita mRNA Näiden sytokiinien tasot. Huomasimme, että yhdenmukainen Luminex määrityksen tulokset (kuvio 1 B), rinnakkaisviljelemällä THP-1-solujen kanssa sääteli mRNA tasot IL-6, IL-8 ja TNF-α MSC-. Sen määrittämiseksi, onko yhdessä viljelemisen THP-1-soluissa vaikuttaa stemness MSC: eiden, havaitsimme ilmaus Oct4 ja Sox2 MSC-käyttäen Western blot. Tulokset osoittivat, että sekä Oct4 ja Sox2-proteiinin tasot nousivat MSC-, jotka olivat viljeltiin yhdessä THP-1-soluissa (kuvio 1C). Edelleen vahvistaa tämän ilmiön, tutkimme myös mRNA tasot Oct4 ja Sox2 MSC-. Tulokset reaaliaikaisten PCR osoitti, että rinnakkaisviljelemällä THP-1-solujen kanssa sääteli ilmaus Oct4 ja Sox2 geenien MSC: (kuvio 1 D). Yleisesti, nämä tulokset viittaavat siihen, että MSC: t olivat merkittävästi aktivoitu tuottamaan korkeampia tulehduksellisten sytokiinien viljeltiin yh- THP-1-soluilla tulehdustila.

Makrofagit-aktivoitu MSC: Enhanced leviämisen ja Migration mahalaukun epiteelisolujen

makrofagien ja MSC ovat tärkeä osa kasvaimen microenvironment. Sen osoittamiseksi, toiminnallisten roolien makrofagien aktivoitu MSC: t, keräsimme supernatantit aktivoitu MSC: iden ja inkuboitiin mahalaukun epiteeli- solulinjan GES-1 48 tuntia. Sitten suoritetaan solujen pesäkemuodostusta arvioida leviämisen GES-1-soluissa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, soluja inkuboitiin supernatantin kanssa aktivoitua MSC: kasvoi nopeammin ja on muodostettu enemmän ja suurempia pesäkkeitä kuin muissa ryhmissä. Lisäksi inkubaation supernatantti aktivoitu MSC: t myös lisääntynyt proteiinin tasot PCNA ja VEGF GES-1-soluissa (kuvio 2B). Tulokset siirtokuoppaan migraatiokokeessa osoitti, että kuinka monen GES-1 solut aktivoituvat MSC: t plus LPS ryhmässä oli enemmän kuin muissa ryhmissä (kuvio 2C). Tulokset Western blot analyysit osoittivat, että makrofagit aktivoituvan MSC: t lisäsi ilmaisun mesenkyymisolun merkkiaineiden (N-kadheriinin ja vimentiinista) ja väheni ilmaus epiteelisolujen merkki (E-kadheriinin) in GES-1-soluissa (kuvio 2D). Me seuraavaksi määritetään VEGF: n ilmentymistä, MMP-9: n ja TGF-β käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Kuten kuviossa 2E, inkubaation supernatantti aktivoida MSC: plus LPS ryhmä sääteli VEGF: n ilmentymistä, MMP-9 ja TGF-β in GES-1-soluissa. Täten MSC: t aktivoitiin makrofagien tulehduksellisten ympäristössä merkittävästi edistänyt mahalaukun epiteelin solujen lisääntymisen ja muuttoliike.

Makrofageilla-aktivoitu MSC: t edistänyt kasvua ja Migration mahasyövän Cells

Koska makrofagit aktivoituvan MSC: t vaikuttavat maha- epiteelisolujen proliferaatio ja migraatio, me seuraavaksi määritti makrofagien-aktivoitujen MSC: t ihmisen mahasyövän HGC-27 soluihin. Tulokset solujen pesäkkeiden muodostumisen testi osoitti, että HGC-27-soluja inkuboitiin supernatantin kanssa, makrofageista-aktivoitu MSC: kasvoi nopeammin ja muodostivat suurempia klooneja kuin muissa ryhmissä (kuvio 3A). Western pultti analyysit osoittivat, että proteiini tasot PCNA ja VEGF HGC-27-solut olivat merkittävästi ajan säätelee supematantilla makrofagien-aktivoitua MSC: (kuva 3B). Transwell migraatiokokeessa paljasti, että määrä siirtää HGC-27-solujen silmiinpistävän kasvoi supernatantti makrofagien aktivoitu MSC-(kuvio 3C). Western blot-analyysit osoittivat, että makrofagit aktivoituvan MSC: t indusoi ilmentymistä mesenkyymisolun merkkiaineiden (N-kadheriinin ja vimentiinista) ja esti ilmaisun epiteelisolujen merkki (E-kadheriinin) in HGC-27-solut (kuvio 3D). MRNA-tasot VEGF, MMP-9: n ja TGF-β lisääntyivät myös HGC-27-solujen käsittelyn jälkeen supernatantti makrofagien aktivoitu MSC-(kuvio 3E). Ottaen huomioon, että syöpäsolu stemness liittyy vahvasti muuton, havaitsimme ilmentymistä stemness geenien HGC-27 soluihin. Ilmentyminen Oct4 ja Sox2 oli erityisesti ajan säätelee supematantilla makrofagien-aktivoitua MSC: (kuvio 3F). In sopusoinnussa real-time PCR tuloksia, proteiinin tasot Oct4 ja Sox2 lisääntyivät myös HGC-27-solujen supernatantti makrofagien aktivoitu MSC-(kuvio 3G). Lyhyesti, nämä tulokset viittaavat siihen, että makrofagit aktivoituvan MSC: t edistetään myös mahalaukun syöpäsolujen kasvua, maahanmuuton induktion EMT ja solun stemness alle tulehdustila.

Makrofageilla aktivoituvan MSC: t mainosvideosuositukset Mahalaukun Cell Proliferation ja Migration Through NF KB: Pathway

jotta tutkia mekanismia vastuussa edistää rooli makrofagien aktivoituva MSC: t solun proliferaatio ja migraatio, päätimme ilmaus useiden keskeisten signalointi muuntimet tulehduksen ja syövän, kuten STAT3, ERK ja NF -κB, mahalaukun epiteelisolujen ja mahalaukun syöpäsoluja. Tulokset Western blot-analyysit osoittivat, että tasot p-STAT3, p-ERK ja p-NF-KB olivat merkitsevästi korkeammat GES-1 solut, joita käsiteltiin supernatantit aktivoitu MSC: kuin muissa ryhmissä. Proteiini taso NF-KB ei ollut muutosta kun taas ERK ja STAT3 väheni hieman (kuvio 4A). Korotukset p-STAT3, p-ERK ja p-NF-KB-proteiinin tasot havaittiin myös HGC-27-solujen käsittelyn jälkeen supernatantit aktivoitu MSC-(kuvio 4B). Varmistimme up-regulation of p-STAT3, p-ERK ja p-NF-KB-proteiinin tasot, jotka supernatantit aktivoitu MSC: t toisessa mahasyövän solulinja SGC7901 (kuvio S2). Sen määrittämiseksi, oliko alavirran kohdegeeneissä myös aktivoida HGC-27-solut, tutkimme ilmaus sykliini D1, C-myc ja C-Jun-proteiineista. Kuten on esitetty kuviossa 4C, proteiinin tasot sykliini D1 ja C-Jun olivat koholla käsittelyn jälkeen supernatantit aktivoitu MSC-.

tulevaisuudessa määrittämiseksi, NF-KB: n on merkittävä rooli Aktivoituneiden MSC: t, HGC-27-soluja, jotka on esikäsitelty PDTC estää NF-KB: n fosforylaation ja inkuboitiin sitten supernatantit aktivoitu MSC:. Olemme havainneet, että NF-KB: n fosforylaation aktivoiduilla MSC: in HGC-27-soluissa oli merkittävästi inhiboi PDTC (kuvio 4D). Tulokset solujen pesäkkeiden muodostumisen ja siirtokuoppaan muuttoliike määritykset osoittivat, että tehostettu lisääntymistä ja migraatio HGC-27 solujen aktivoitua MSC: vähensi merkittävästi PDTC hoidetuissa ryhmissä (kuviot 4E ja 4F). Lisäksi PDTC hoito esti myös ylössäätöä VEGF, MMP-9 ja TGF-β aktivoitujen MSC: in HGC-27-solut (kuvio 4G). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että aktivoitu MSC: nopea mahalaukun epiteelisolujen ja mahasyövän solujen lisääntymistä ja maahanmuuton NF-KB.

Makrofageilla-aktivoitua MSC: t mainosvideosuositukset mahasyövän Growth in vivo

Koska näyttöä siitä, että makrofagit aktivoituvan MSC: t voisivat tehostaa mahan solujen lisääntymistä in vitro
, mietimme onko nämä MSC: iden kohdistama edistää rooli mahalaukun syövän kasvua in vivo
. Niinpä yhteistyössä ruiskutetaan HGC-27-solujen kanssa aktivoitua MSC: t nude-hiiriin. Kaksikymmentä päivää myöhemmin kasvain kudokset poistettiin, mitattiin ja painotetaan. Kuten kuvioissa 5A ja 5B ksenograftikasvaimina aktivoitu MSC-co-ruiskutetaan ryhmä olivat suurempia kuin muissa ryhmissä. Immunohistokemiallista analyysit suoritettiin sen määrittämiseksi, ekspression kasvuun liittyviä proteiineja ja pro-angiogeenisten tekijöiden kasvainkudoksissa. Mitä vahvempi positiivinen värjäytyminen PCNA ja VEGF havaittiin aktivoitu MSC: yhteistyössä ruiskutetaan ryhmä (kuvio 5C). Reaaliaikainen PCR-analyysit suoritettiin havaitsemiseksi VEGF: n ilmentymistä, MMP-9: n ja TGF-β kasvainkudoksissa. Olemme havainneet, että ilmaus kaikkien näiden geenien yhteistyössä ruiskutetaan ryhmät olivat korkeampi kuin HGC-27-solut yksin ryhmä (kuvio 5D). Tulokset reaaliaikaisten PCR-analyysit osoittivat, että mRNA tasot Oct4, Sox2 ja Sall4 olivat korkeimmat aktivoitu MSC: yhteistyössä ruiskutetaan ryhmä (kuvio 5E). Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että makrofagit aktivoituvan MSC: nopea mahalaukun syövän kasvua in vivo
.

Ensisijainen Monosyytit Aktivoidut MSC: Kehota mahasyövän Cell Proliferation ja Migration kautta NF-KB

edelleen vahvistaa aktivoinnin MSC: eiden makrofagien kysymään mahasyövän solun proliferaatio ja migraatio, me eristetty monosyytit ihmisen perifeerisen veren ja kerättiin supernatantti monosyyteistä eriytetty makrofageissa. Inkubaation jälkeen supernatantti monosyyteistä eriytetty makrofagit, MSC: t kerättiin talteen ja kokonais-RNA uutettiin reaaliaikaisen PCR-analyysit. Kuten kuviossa 6B on esitetty, käsittelemällä supernatantti monosyyteistä eriytetty makrofagien säädelty mRNA tasoja IL-6, IL-8, MCP-1 ja VEGF MSC-. Sitten inkuboidaan mahasyövän solujen supernatantti aktivoitu MSC:. Tulokset solujen pesäkkeiden muodostumisen ja siirtokuoppaan muuttoliike määritykset osoittivat, että supernatantti aktivoitu MSC: t parantavat lisääntymistä ja migraatio HGC-27-solut (kuviot 6C ja 6D). Olemme lisäksi osoittaneet, että inkubaation supernatantit aktivoidusta MSC: t lisäsi ilmentymistä p-STAT3, p-ERK ja p-NF-KB: HGC-27-solut (kuvio 6E). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että sopusoinnussa THP-1-solut, ihmisen ensisijainen makrofageissa aktivoituu myös MSC: kysymään mahasyövän solujen lisääntymisen ja maahanmuuton NF-KB.

Keskustelu

aikana viime vuosikymmeninä yhteys tulehduksen syöpä on herättänyt paljon huomiota [5], [6]. Pitkäaikainen altistuminen epiteelisolujen tulehduksellinen mikroympäristölle johtaa pahanlaatuisiksi [9], [19]. Strooman solujen on osoitettu olevan kriittisesti mukana etenemistä tulehdus syövän moduloimalla tulehduksellinen microenvironment [7], [8]. Makrofagien ja MSC: t ovat kaksi pääosaa kasvaimen strooman ja osallistua laajuuden säätelyssä tulehdusreaktion aikana syövän synnyn [16]. Kuitenkin vuorovaikutus makrofagien ja MSC mahasyövän ole hyvin tunnettu.

Mahalaukun syöpä on kehittynyt pitkän aikavälin krooninen gastriitti ja on klassinen malli tulehduksesta liittyvän syöpään. Olemme aiemmin eristetty asukas MSC: ihmisen mahasyöpä kudosten ja osoittivat, että mahasyövän kudosta johdettu MSC: erittyy paljon tulehdusta edistävien sytokiinien ja edistää mahalaukun syövän etenemisessä. Prosessin aikana tulehdus, monosyyttien /makrofagien voitaisiin palvelukseen antaa MSC: kasvaimen edistäviä ominaisuuksia [16]. Lisäksi Helicobacter pylori
aiheuttaa krooninen tulehdus mahalaukun epiteelisolujen kautta vapauttamaan LPS olemassa sen solun seinät. Tässä tutkimuksessa olemme esikäsitelty MSC: makrofageihin läsnä LPS matkia mahasyövän mikroympäristön ja määrittää, onko makrofagien aktivoitu MSC: t edistävät mahalaukun syövän etenemisessä. Olemme osoittaneet, että MSC: itä inkuboitiin makrofagien LPS erittyy korkeampia tulehduksellisten sytokiinien. Tuore tutkimus kertoi, että jatkuva stimulaatio kanssa makrofagien elatusaine aiheuttama MSC: hankkia tulehdusta fenotyyppi [17]. Vuonna sopusoinnussa niiden tutkimus, huomasimme, että lyhyen ajan inkubaation makrofagien aktivoituu myös MSC: tuottamaan korkeamman tulehdussytokiinejä.

epiteelikasvaimet mesenkyymisoluyhteisviljelmissä-siirtymä (EMT) on merkittävä prosessi aikana syövän etäpesäkkeiden [20]. Vuosien uudelleenohjelmointia liittyvät ominaisuudet EMT on katsottu johtuvan parantaa solujen plastisuus syöpäsoluissa. Syövän kantasoluja on otettu käyttöön, ja osoitettu myötävaikuttavan tuumorigeneesiin ja kasvaimen etäpesäkkeiden [21] - [24]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että ala- populaation varren kaltainen ja mesenkymaalisten kaltaisia ​​soluja näkyy enemmän kasvainten muodostumiseen maha- epiteelisolujen in vitro ja in vivo
[25]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että aktivoitu MSC jotka viljeltiin yhdessä makrofagien LPS: n läsnäolon, voi huomattavasti parantaa siirtymistä mahalaukun epiteelisolujen sekä mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi osoitimme, että supernatantit aktivoidusta MSC: aiheuttamaa EMT mahalaukun epiteeli- ja mahalaukun syöpäsoluja. Selventämään näitä tuloksia, havaitsimme ilmentymistä stemness geenien mahalaukun syöpäsoluja. Olemme havainneet, että ilmaus Oct4 ja Sox2, kaksi suurta stemness liittyviä geenejä, oli ilmeisesti lisääntyi aktivoitua MSC:. Angiogeneesi on tärkeää kasvaimen metastaasin ja VEGF: n ilmentymistä liittyy läheisesti mahalaukun syövän ennusteeseen [26], [27]. Huomasimme, että VEGF-ekspressio lisääntyi merkittävästi käsittelyn jälkeen supernatantit aktivoidusta MSC: mahasyövän soluissa sekä in vitro
ja in vivo
. Näiden tulosten perusteella, ehdotimme, että makrofagit aktivoituvan MSC: t erittyy enemmän tulehduksellisten sytokiinien ja edistänyt proliferaatio ja migraatio mahalaukun syöpäsolujen induktion EMT ja solun stemness.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että MSC: t edistävät mahasyövän kasvua erilaisia ​​reittejä [28], [29] ja tuoreessa tutkimuksessa on osoitettu, että VEGF ilmentyminen liittyy läheisesti NF-KB mahasyövän [30]. Lisäksi TGF-β tärkeä rooli valvoa solujen lisääntymisen, apoptoosin, erilaistuminen, muuttoliike, ja soluväliaineen kehittämiseen [31], [32]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että TGF-β aktivoi NF-KB: n ja sillä tärkeä rooli edistymistä synergistinen aktivaatio eri reittien [33], [34]. TGF-β-välitteinen induktio matriksimetalloproteinaasi 9 (MMP-9) on raportoitu säätelevän NF-KB: n ja JNK-polkuja [35]. TNF-stimuloimaa MMP-9 tuotanto aktivoi myös NF-KB: n ja ERK signalointireitteihin [36]. Lisäksi etenemistä mahalaukun epiteelisolujen mahalaukun syövän solujen on osoitettu säätelevän sytokiinien ilmentymistä ja NF-KB: n signalointireitin [37]. Toinen raportti viittaa siihen, että estämällä sekä lisääntymistä ja angiogeneesin kanssa huumeiden väliintuloa mahasyövän liittyy tukahduttaminen NF-KB [38]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että makrofagit aktivoituva MSC: säädelty fosforylaation NF-KB ja VEGF: n ilmentymistä, TGF-β, ja MMP-9 mahalaukun soluissa. Samanaikainen kasvaa STAT3 ja ERK-fosforylaation voi aiheuttaa NF-KB: n, koska NF-KB: n on aikaisemmin osoitettu säätelevän STAT3 ja ERK signalointireittien [39], [40].

Yhteenvetona, me osoitettu tässä tutkimuksessa, että MSC: t aktivoituvat makrofagit hankittu proinflammatoristen fenotyyppi ja edistää mahalaukun epiteelisolujen ja syövän solujen lisääntymistä ja maahanmuuton NF-KB: n aktivoitumisen. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusia todisteita modulaatio mahalaukun epiteelisolujen ja syöpäsolujen MSC: t alle tulehduksellinen ympäristössä ja edelleen oivalluksia roolit strooman solujen etenemistä krooninen tulehdus syöpään.

tukeminen Information
Kuva S1.
Co-kulttuuri MSC: eiden kanssa THP-1-soluissa. Edustavat kuvat THP-1-soluissa ja MSC suorassa yhteistyössä kulttuuri järjestelmä ennen (vasemmalla) ja jälkeen (oikea) PBS pesua. Suurennus, × 100, asteikko bar = 50 pm.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s001
(TIF) B Kuva S2.
Makrofagit aktivoitu mcss indusoi NF-KB: SGC-7901-soluja. SGC7901 soluja käsiteltiin supernatantit makrofagien aktivoitu MSC: t ja ilmentymistä p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-KB: n ja NF-KB-proteiinien SGC-7901-solut havaittiin käyttäen Western blot .
doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s002
(TIF) B Taulukko S1.
Luettelo alukesekvenssien.
doi: 10,1371 /journal.pone.0097569.s003
(DOC) B

• PLoS ONE: Normaali fibroblastit indusoivat E-kadheriinin Loss ja lisätä imusolmukemääritysmenetelmä etäpesäke Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Prognostic arvo imusolmuke Ratio vaiheessa III mahasyöpäpotilaista voimakkaassa Resektio