PLoS ONE: Die Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen durch Makrophagen Prompts menschlichen Magenkrebswachstum durch NF-kappaB-Bahn

Abstrakt

mehr deutet zeigen, dass Makrophagen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aktivieren zu erwerben proinflammatorischen Phänotyp. Allerdings bleibt die Rolle von MSCs durch Makrophagen bei Magenkrebs aktiviert weitgehend unbekannt. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass MSCs von Makrophagen aktiviert wurden erhöhte Spiegel von inflammatorischen Zytokinen erzeugen. Zellkoloniebildung und Transwell-Migrationsassays zeigten, dass die Überstände aus den aktivierten MSCs sowohl Magen-Epithelzellen und Magenkrebs fördern könnte die Zellproliferation und Migration. Darüber hinaus ist die Expression von epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT), Angiogenese und stemness-Genen wurde in aktivierten MSCs erhöht. Die phosphorylierten Formen von NF-kappaB, ERK und STAT3 in Magenzellen wurden durch aktive MSCs erhöht. Die Hemmung von NF-kappaB-Aktivierung durch PDTC blockiert die Wirkung von aktivierten MSCs auf die Magenkrebszellen. Co-Injektion von aktiviertem MSCs mit Magenkrebszellen könnte Magenkrebswachstum zu beschleunigen. Außerdem MSCs humanen peripheren Blut-Monozyten abgeleitete Makrophagen auch Magenkrebszellproliferation und -migration zu veran aktiviert. Zusammengenommen unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSCs durch Makrophagen aktiviert erwerben proinflammatorischen Phänotyp und prompt Magenkrebswachstum in einem NF-kappaB-abhängigen Art und Weise, die für die Modulation der MSCs durch Tumor-Mikroumgebung und weitere Einblicke in die Rolle von Stromazellen neue Beweise liefert Zellen in Magen-Krebsentstehung und Tumorprogression

Citation:. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) Die Aktivierung von mesenchymalen Stammzellen durch Makrophagen Prompts menschlichen Magenkrebswachstum durch NF-kappaB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10.1371 /journal.pone.0097569

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Empfangen: 18. Februar 2014; Akzeptiert: 21. April 2014; Veröffentlicht: 13. Mai 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von den großen Forschungsplan des National Natural Science Foundation of China (Erteilungsnummer 91129718) unterstützt, der National Natural Science Foundation of China (Förder-Nr. 81302119, 81201660, 81071421), Provinz Jiangsu für herausragende Sci-Tech-Innovation Team in Colleges und Universitäten (Förder-Nr. SJK2013-10), Projekt Jiangsu Provinz wissenschaftlichen und technologischen Innovation und Erfolge Transformation (Grants no.BL2012055), Provinz Jiangsu hervorragende medizinische Akademische Führer und Sci-Tech-Innovation Team-Programm (Zuschuss no.LJ201117), die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (Grants no.BK2012709, BK20130540), Promotionsprogramm Stiftung der staatlichen Bildungsministerium (Förder-Nr. 20113227110011), Provinz Jiangsu für Natur Scicence Forschung in Hochschulen und Universitäten (13KJB320001). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der am häufigsten auftretenden bösartigen Tumoren und hält eine Hauptursache der Krebssterblichkeit in der ganzen Welt [1], [2]. In China gibt es etwa 360.000 Menschen sterben an Magenkrebs jedes Jahr [3]. Obwohl die Häufigkeit in den letzten Jahren im Westen abgenommen hat, ist das Überleben noch schlimmer [4]. In den vergangenen Jahrzehnten hat große Anstrengungen unternommen worden, um die Entstehung von Magenkrebs aufzuklären. Jedoch ist die komplexe Mechanismus der Karzinogenese Magen noch freigelegt. Thesaurierend Beweise zeigen, dass langfristige chronische Entzündung eine der führenden Ursachen für tumorigenesis ist. Freisetzung von pro-inflammatorischen Mediatoren und erhöhte lokale Konzentrationen von Sauerstoff und Stickstoff-Spezies kann zu Karzinogenese beitragen [5]. Die Dysregulation der Produktion von Zytokinen in Entzündungsmikro stimuliert die Expression von Genen, die mit der Entwicklung von Krebs assoziiert und modifiziert Strukturmerkmale von Mikroumgebung Krebs Initiierung und Progression [6] zu beschleunigen - [9].

Tumor-Mikroumgebung besteht aus verschiedenen Stromazellen einschließlich infiltrierenden Immunzellen, Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAFs), mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Blut und lymphatischen Gefäßnetzen. Diese Zellen interagieren miteinander und Entzündungsmikro dar und tragen zu Tumorigenese [10], [11]. Unter den Stroma-Zellen, Makrophagen, wie wichtig immunregulatorische Zellen, spielen eine dominierende Rolle Entzündung in Tumor-Mikroumgebung in der Verwaltung. Beispielsweise isolierte Makrophagen von Tumor-Mikroumgebung von Brustkrebspatientinnen secret chemotaktische Cytokine, die Metastasierung von Karzinomzellen zu erhöhen [12]. Makrophagen wurden auch die molekularen onkogenen Programme innerhalb Epithelzellen [13].

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine weitere Hauptkomponente des Tumors zu fördern Entzündungsreaktion und Tumorigenese durch aufprall auf die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen und Ändern gezeigt Mikroumgebung und werden als die Vorläuferzellen von Krebs assoziiert mesenchymalen Zellen und Endothelzellen [14] betrachtet. Die bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass MSCs secret lösliche Faktoren Krebszellproliferation und Metastasierung [10] zu fördern. In einer entzündungsbedingten Magenkrebs-Modell, könnte MSCs in Richtung CAFs aktiviert werden, um chronische Entzündungen und Krebsprogression [15] zu erhöhen. Ferner wurden MSCs berichtet Monozyten /Makrophagen zu rekrutieren Tumorwachstum in einer CCR2-depedent Weise [16] zu fördern. Die Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und MSCs erzeugen eine aktivierte, pro-inflammatorischen Phänotyp mit hoher CXCL10 und IL-6-Sekretion, die die entzündliche Mikro beeinflussen können [17].

Magenkrebs ein klassisches Modell der chronischen Entzündung zu Krebs. Jedoch aktiviert die Rolle der MSCs durch Makrophagen bei Magenkrebs und dem zugrunde liegenden Mechanismus sind noch weitgehend unbekannt. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass MSCs stark von Makrophagen unter Entzündungszustand aktiviert wurden, inflammatorische Zytokine und tumorfördernde Faktoren zu erzeugen, zur Verbesserung der Magen-Epithelzellen und Krebszellproliferation und -migration durch die Aktivierung von NF-kB-Weg führt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Makrophagen-Aktivierung MSCs Magenkrebs Wachstum und die Progression unter entzündliche Erkrankung fördern.

Materialien und Methoden

Zellkultur

menschlichen Magenkrebszelllinie HGC-27, menschlichen Magen-epithelialen Zelllinie GES-1, und humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie THP-1 wurden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie an der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. GES-1 und THP-1-Zellen in RPMI-1640-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Invitrogen) kultiviert wurden, und HGC-27-Zellen wurden in Hoch-glucose DMEM (H beibehalten -DMEM, Invitrogen) mit 10% FBS. MSCs wurden aus Nabelschnur und kultiviert in DMEM mit niedrigem Glucose (L-DMEM, Invitrogen) mit 10% FBS abgeleitet. Die Zellen wurden alle bei 37 ° C in befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 5% CO _{2 inkubiert. Die frischen Nabelschnur Gewebe wurden von gesunden puerperalis Mütter gesammelt, nachdem eine schriftliche Einverständniserklärung erhalten. MSCs wurden isoliert und charakterisiert, wie zuvor beschrieben [18]. Alle Experiment Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität Jiangsu genehmigt. MSCs bei Passage 3 wurden für die Experimente ausgewählt.}

Supernatant Vorbereitung

Für die Herstellung von Makrophagen assoziiert MSCs Überstand, MSCs (3 × 10 ^{5) wurden ausgesät zu haften. THP-1-Zellen (1.01-Verhältnis) wurden mit frischem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von LPS (1 ug /ml) zugegeben. Nach der Co-Kultur für 48 Stunden wurde das Medium verworfen und die Zellen wurden vorsichtig mit PBS gewaschen THP-1 Zellen zu entfernen. Die Überstände von aktivierten MSCs wurden 24 Stunden später gesammelt, gefiltert mit einem 0,22-um-Filter und bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Bei der Verwendung für die Zellfunktion untersucht, wurden die Überstände von aktivierten MSCs mit einem gleichen Volumen von 10% FBS enthaltendes DMEM-H oder RPMI-1640-Medium gemischt. Für Signalweg analysiert wurden die Zellen für 1 h mit den Überständen von aktivierten MSCs behandelt}

Luminex Assay

Human Zytokin &. Chemokin-Magnetic-Bead-Platte-Kit (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) wurde entwickelt, Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-BB (PDGF-BB), monocyte chemoattractant protein- nachzuweisen 1 (MCP-1), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 und IL-8 im Überstand von aktivierten MSCs. Alle Verfahren wurden gemß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Die Signale wurden nachgewiesen und analysiert unter Verwendung Luminex200-System (Millipore).

Transwell-Migrationstest

Nach der Behandlung mit den Überständen von aktivierten MSCs 48 h, GES-1 und HGC-27-Zellen ( 1 × 10 ^{5 /Vertiefung) wurden in die obere Kammer gegeben (8 um) (Corning, NY, USA) in serumfreiem Medium. Das komplette Medium wurde in die untere Kammer gegeben. Nach einer Inkubation von 12 h am Boden der Polycarbonatmembran verbliebenen Zellen wurden mit Wattestäbchen abgewischt. Die Zellen auf der unteren Oberfläche der Membran migrieren wurden dann 30 min mit Methanol fixiert. Die migrierten Zellen wurden für 15 Minuten mit Kristallviolett gefärbt und in sechs zufälligen Feldern unter dem Mikroskop (100 ×).}

Zellkoloniebildungstest

Die Zellen wurden gezählt mit den Überständen nach der Behandlung gesammelt aus MSCs für 48 h und entkernt, in 6-Well-Platten (1.000 Zellen /Vertiefung) und für 10 Tage kultiviert. Das Medium wurde alle drei Tage gewechselt. Am Ende der Wachstumsperiode wurden die Zellen mit Methanol fixiert und für 30 min mit Kristallviolett gefärbt für 15 min. Die Zellkolonien wurden photographiert, und die Anzahl der Kolonien wurde für die statistische Analyse gezählt.

RNA Extraction and Real-time PCR

Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) extrahiert . Fünf Mikrogramm RNA wurde für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse verwendet. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Sequenzen der spezifischen Primer wurden alle in Tabelle S1 aufgelistet.

Western Blot

Die Zellen wurden lysiert und homogenisiert in RIPA mit vollständiger Protease-Inhibitoren ergänzt Puffer. Gleiche Menge an Proteinen (200 ug) wurde in 12% SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden dann auf PVDF-Membranen nach der Elektrophorese übertragen. Nach dem in 5% blockiert (w /v) fettfreier Milch für 1 h bei Raumtemperatur wurden die Membranen dann an ihren jeweiligen geeigneten Verdünnungen von spezifischen primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Die Quellen der primären Antikörper waren: Anti-Oct4, anti-Sox2, anti-Vimentin und anti-phospho-STAT3 (Signalway Antikörper, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, China), Anti-E-Cadherin, anti- ERK1 /2, anti- phospho-ERK1 /2 und anti-N-Cadherin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Anti-PCNA, Anti-STAT3, anti-NF &kgr; B, anti-phospho-NF- kappaB, anti-CyclinD1, anti-VEGF und Anti-C-Jun (Bioworld Technologie, Louis Park, MN, USA), Anti-C-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, USA).

Animal Modell

Drei bis fünf Wochen alten Balb /c Nacktmäuse wurden von Slac Laboratory Animal Center (Shanghai, China) erworben. Die Tiere wurden in Einklang mit den institutionellen Richtlinien gehalten, und alle Studien wurden mit Zustimmung des Universitätsausschusses Benutzung und Pflege der Tiere von Jiangsu-Universität durchgeführt. HGC-27-Zellen (1 × 10 ^{6) und MSCs (5 × 10 5) wurden mit Trypsin behandelt, gewaschen und in 200 &mgr; l PBS resuspendiert, respectively. Anschließend wurden die Zellen gemischt und in die linke Flanke von Nacktmäusen-co injiziert. Tumoren wurden entfernt chirurgisch 20 Tage nach der Injektion photographiert und gewichtet. Die Tumorgröße wurde durch Dickenmessung beurteilt und berechnet, basierend auf der modifizierten Ellipsoids Formel (L × W × W /2), wobei L die Länge darstellt, und W Breite.}

Immunohistochemistry

Formalin- fixierten und in Paraffin eingebetteten Maus-Tumorgewebeschnitte wurden zuerst in Xylol, rehydratisiert durch abgestufte Ethanol entparaffiniert. Die Schnitte wurden für 10 min in Citratpuffer gekocht (pH 6,0, 10 mM) für Antigen Retrieval. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde 10 min mit der Exposition gegenüber 3% Wasserstoffperoxid inhibiert. Dann werden die Schnitte wurden mit 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, China) blockiert und mit der richtigen verdünnt PCNA oder VEGF primärem Antikörper bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Nachdem sie mit PBS gewaschen wurden die Schnitte dann 20 min mit verdünntem sekundären Antikörper inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht und dann mit Hämatoxylin zur Untersuchung mit dem Lichtmikroskop (200-fach) gegengefärbt.

primären humanen Monozyten Isolation

Menschliche Monozyten wurden erhalten von Leukozytenmanschette von peripheren Blutproben von gesunden Spender gespendet mit Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Frisches RPMI 1640 mit 10% FBS ergänzt wurden alle 2 Tage gewechselt, und nicht-anhaftende Zellen wurden entfernt und gereinigt. Monocyten wurden für 7 Tage inkubiert, und 50 ng /ml M-CSF zugesetzt Makrophagen (M) zu erhalten. Dann 24 h Überstand von Makrophagen sezerniert wurde gesammelt und filtriert. Adhärenten MSCs wurden mit dem Überstand von Makrophagen in Abwesenheit oder in Gegenwart von LPS (1 ug /ml) für 48 h und wusch behandelt. Die Überstände von aktivierten MSCs wurden 24 h später gesammelt und verwendet Studien für folgende.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS Statistics 16.0 Software. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Unterschiede in verschiedenen Gruppen wurden analysiert unter Verwendung von Einweg-ANOVA. Die Unterschiede zwischen den PDTC Behandlungen wurden getestet von t
Test. Statistische P
Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: Normal Fibroblasten E-Cadherin-Verlust herbeiführen und Lymphknotenmetastase in Gastric Cancer
• PLoS ONE: prognostischen Wert des Lymphknotens Verhältnis in Stufe III Magenkrebspatienten unter Radical Resection