PLoS One: aktiválása mesenchymalis őssejtek makrofágok Prompts Emberi gyomorkarcinóma Növekedés NF-kB útvonal

absztrakt katalógusa

Egyre több bizonyíték van arra, hogy a makrofágok aktiválásához mesenchymalis őssejtek (MSC), hogy megszerezzék gyulladáskeltő fenotípus. Ugyanakkor a szerepe MSC által aktivált makrofágok gyomorrák még jórészt ismeretlen. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy MSC-k aktivált makrofágok által, hogy készítsen megnövekedett szintű gyulladásos citokinek. Cell kolónia képződését és Transwell migrációs assay során kiderült, hogy a felülúszókat az aktivált MSC elősegítheti mindkét gyomor epiteliális sejtek és a gyomorrák sejtek proliferációját és migrációját. Ezen túlmenően, a kifejezés a epithelialis-mesenchymalis átmenet (EMT), angiogenezis, és stemness kapcsolatos gének fokozott volt aktiválva MSC. A foszforilált formáit az NF-kB, ERK és STAT3 a gyomor sejteket emelkedett aktív MSC. Gátlása az NF-kB aktiválás által PDTC blokkolt hatása aktivált MSC a gyomor rákos sejteket. Co-befecskendezés aktivált MSC gyomor rákos sejtek meggyorsíthatja gyomorrák növekedését. Ezen túlmenően, a humán perifériás vér monociták eredetű makrofágok is aktiválódik MSC, hogy jelezzen gyomorrák sejtek proliferációját és migrációját. Mindent összevetve, eredményeink arra utalnak, hogy az MSC-k által aktivált makrofágok szert gyulladáskeltő fenotípus és azonnali gyomorrák növekedése egy NF-kB-függő módon, amely újabb bizonyítékot a moduláció MSC által tumor és a mikrokörnyezet további betekintést a szerepét stroma sejtek gyomor karcinogenezis és a rák progressziójának.

bevezető hivatkozás: Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J., Huang F, Cai J, et al. (2014) aktiválása mesenchymalis őssejtek makrofágok Prompts Emberi gyomorkarcinóma Növekedés NF-kB útvonal. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569 katalógusa

Szerkesztő: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japán katalógusa

Beérkezett: Február 18, 2014 Elfogadva: 21. április 2014; Megjelent: május 13, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Yang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a fő kutatási terv a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Grant No. 91129718), a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Grant nem. 81302119, 81201660, 81071421), Jiangsu tartomány Kiemelkedő Sci-tech innováció Team Főiskolák és egyetemek (Grant nincs. SJK2013-10), Jiangsu tartomány Project Tudományos és technológiai innovációs és eredmények Transformation (Grant no.BL2012055), Jiangsu tartomány Kiemelkedő Egészségügyi Tudományos vezető és sci-tech innováció csapat Program (Grant no.LJ201117) a Természettudományi Alapítvány a Jiangsu tartomány (Grant no.BK2012709, BK20130540) Doktori Program Alapítvány állami oktatási minisztérium (Grant nincs. 20113227110011), Jiangsu tartomány Természetes Scicence Research Főiskolák és egyetemek (13KJB320001). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

gyomorrák egyik leggyakrabban előforduló rosszindulatú betegségek és tartja egyik fő oka a rák okozta halálozás világszerte [1], [2]. Kínában van mintegy 360.000 számú hal gyomorrák évente [3]. Bár az előfordulási gyakoriság csökkent az elmúlt években a nyugati, a túlélés még rosszabb [4]. Az elmúlt évtizedekben nagy erőfeszítéseket tettek gyakorolt ​​megvilágítására patogenezisében gyomorrák. Ugyanakkor a komplex mechanizmusa gyomor carcinogenesis még feltáratlan. Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a hosszú távú krónikus gyulladás az egyik fő oka a tumorigenezis. Release pro-gyulladásos mediátorok és a fokozott helyi szint az oxigén és nitrogén gyökök hozzájárulhatnak a karcinogenezis [5]. A rosszul szabályozott citokinek gyulladásos mikrokörnyezetben stimulálja a gének expresszióját rákkal fejlesztés, valamint módosítja a strukturális jellemzői mikrokörnyezet, hogy gyorsítsa a rák kialakulásában és progressziójában [6] - [9].

tumor mikrokörnyezetében áll, a különböző kötőszöveti sejtek , beleértve az infiltráló immunsejtek, karcinóma-asszociált fibroblasztok (CAF-eket), mezenchymális őssejtek (MSC), és a vér és nyirok érrendszeri hálózatokat. Ezek a sejtek kölcsönhatásban vannak egymással és képez gyulladásos mikrokörnyezet és hozzájárulhat a tumorképződéshez [10], [11]. Között a kötőszöveti sejtek, makrofágok, ugyanolyan fontos az immunrendszer szabályozó sejtek játszanak meghatározó szerepet játszanak az gyulladás tumor mikrokörnyezetében. Például, a makrofágok izolált tumor mikrokörnyezetében emlőrákos betegek titkos kemotaktikus citokinek növelni metasztázis karcinóma sejtek [12]. A makrofágok azt is kimutatták, hogy támogassák a gyulladásos válasz és a tumorgenezis keresztül kihatással van a gyulladásos citokinek expresszálódása és megváltoztatja a molekuláris onkogén belüli programok epiteliális sejtek [13].

mezenchymális őssejtek (MSC) egy másik fő komponense a tumor mikrokörnyezet és tekintik a prekurzor sejtek kapcsolódó rák mesenchymalis sejtek és az endoteliális sejtek [14]. A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az MSC-k titkos oldható faktorok, hogy támogassák a rákos sejtek szaporodását és metasztázis [10]. Egy gyulladás-asszociált gyomorrák modell, MSC-k lehet aktiválni felé CAF-ek, hogy növelje a krónikus gyulladás és a rák progressziójának [15]. Továbbá, MSC-k számoltak monocitákat /makrofágokat, hogy támogassák a tumornövekedést a CCR-2-depedent módon [16]. Közötti kölcsönhatások makrofágok és MSC-k egy aktivált, pro-gyulladásos fenotípus magas CXCL10 és IL-6 szekréciót, ami befolyásolhatja a gyulladásos mikrokörnyezet [17].

gyomorrák egy klasszikus modell a krónikus gyulladás a rák. Ugyanakkor a szerepe MSC által aktivált makrofágok gyomorrákban és a mögöttes mechanizmus még nagyrészt ismeretlen. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy MSC-k erősen aktivált makrofágok által alatt gyulladásos állapot, a termelés gyulladásos citokinek és a tumor-elősegítő faktorok, ami a javítása gyomornyálkahártya sejt és a rák sejtek proliferációját és migrációját aktiválásán keresztül az NF-kB utat. Eredményeink azt mutatják, hogy a makrofágok által aktivált MSC elősegítik a gyomorrák növekedés és progresszió gyulladásos állapot. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonal HGC-27, humán gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1, és az emberi histiocitás leukémia sejtvonal THP-1-et vásárolt a Biokémiai Intézet és Sejtbiológiai a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). GES-1 és a THP-1 sejtek RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 10% magzati borjúszérummal (FBS, Invitrogen), és HGC-27 sejteket tartottunk fenn a magas glükóz DMEM (H -DMEM, Invitrogen) és 10% FBS-sel. MSC származnak köldökzsinór és tenyésztettünk alacsony glükóz DMEM (L-DMEM, Invitrogen) és 10% FBS-sel. A sejteket minden inkubáljuk 37 ° C-on, nedvesített sejttenyésztő inkubátorban, 5% CO _{2. A friss köldökzsinór szöveteket gyűjtöttünk egészséges gyermekágyi anya után írásos beleegyezését adta. MSC izoláltuk és jellemeztük a korábban leírt [18]. Minden kísérlet engedélyezett terv szerint az etikai bizottság a Jiangsu Egyetemen. MSC a folyosón 3 választottak ki a kísérletekhez. Katalógusa}

A felülúszót előkészítése katalógusa

A készítmény a makrofág kapcsolódó MSC felülúszót, MSC (3 × 10 ^{5) oltottunk, hogy csatlakozzanak. A THP-1 sejteket (01:01 arány) adunk hozzá friss tápközeggel jelenlétében vagy távollétében LPS (1 ng /ml). Együtt-tenyésztés után 48 órán át, a táptalajt eldobjuk, és a sejteket óvatosan mossuk PBS-sel, hogy távolítsa el a THP-1 sejtekben. A felülúszókat aktivált MSC gyűjtöttünk 24 órával később, egy 0,22-um szűrő és -80 ° C-on a felhasználásig. Amikor használt sejt funkció elemzi, a felülúszókat aktivált MSC összekeverünk azonos térfogatú 10% FBS-t tartalmazó H-DMEM vagy RPMI-1640 tápközeg. A jelátviteli útvonal elemzések, a sejteket kezeltük a felülúszóit aktivált MSC 1 órán át.}

Luminex Assay

Emberi citokin & kemokin mágneses gyöngy panel készlet (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) kimutatására tervezett granulocita-kolónia stimuláló faktor (G-CSF), a vérlemezke eredetű növekedési faktor-BB (PDGF-BB), monocita kemoattraktáns fehérje 1 (MCP-1), a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α), a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 és IL-8 a felülúszóban az aktivált MSC. Az összes eljárást dolgoztak fel, a gyártó utasításai szerint. A jelek detektálására és elemeztük segítségével Luminex200 rendszer (Millipore).

Transwell migrációs tesztvizsgálat

kezelés után a felülúszókat aktivált MSC-k 48 órán át, GES-1 és HGC-27 sejteket ( 1 × 10 ^{5 /lyuk) kerültek be a felső kamrába (8 um) (Corning, NY, USA) szérummentes közegben. A komplett tápközeget helyeztünk az alsó kamrába. Az inkubálás után 12 órán sejteket alján maradt a polikarbonát membrán arra letörölni pamut törlőkendő. A migráló sejtek az alsó felület a membrán ezután metanollal fixáltuk 30 percig. A migrált sejteket megfestettük kristályibolya 15 percig számláltuk hat véletlenszerűen területeken a mikroszkóp alatt (100 ×).}

Cell telepképző assay

A sejteket összegyűjtöttük a kezelés után a felülúszóit MSC 48 óra, és beoltjuk a 6-lyukú lemezekre (1000 sejt /lyuk), és tenyésztjük 10 napig. A táptalajt megváltozott minden harmadik nap. Végén a növekedési időszak sejteket metanollal fixáltuk 30 percig, és megfestettük kristályibolya 15 percig. A sejt kolóniákat fényképezett és a telepek számát megszámoljuk a statisztikai elemzéshez.

RNS kivonása és a valós idejű PCR

Teljes RNS-t extraháltunk Trizol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai . Öt mikrogramm RNS-t használt kvantitatív valós idejű PCR analízis. β-aktin használtunk belső kontrollként. A szekvenciák specifikus primereket minden táblázatban felsorolt ​​S1.

Western Blot

sejteket lizáltuk, és homogenizáltuk RIPA-pufferben kiegészített komplett proteáz inhibitorok. Azonos mennyiségű fehérjét (200 ug) oldani 12% -os SDS-PAGE. A fehérjéket ezután PVDF membránokra vittük át elektroforézist követően. Miután blokkoltuk 5% (w /v) zsírmentes tej 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, a membránokat ezután inkubáljuk a megfelelő megfelelő hígításait specifikus primer antitestekkel egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. A források primer antitestek a következők voltak: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentin vagy anti-foszfo-STAT3 (Signalway Antibody, USA), az anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Kína), anti-E-cadherin, anti- ERK1 /2, anti foszfo-ERK1 /2 és az anti-N-kadherin (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kB, anti-foszfo-NF- kB, anti-CyclinD1, anti-VEGF és anti-c-Jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), az anti-c-myc (Proteintech Group, Chicago, IL, USA).

Animal Modell katalógusa

Három-öt hetes BALB /c csupasz egereket szereztünk SLAC Laboratory Animal Center (Sanghaj, Kína). Az állatokat összhangban fenntartott intézményi politika, és az összes vizsgálatokat végeztünk jóváhagyásával az egyetem bizottság használata és ápolása állatok Jiangsu Egyetemen. HGC-27 sejteket (1 × 10 ^{6) és MSC-k (5 × 10 5) tripszinizáltuk, mostuk és újraszuszpendáltuk 200}

• PLoS One: Normál fibroblasztok Váltsa E-Cadherint Loss és növelése nyirokcsomó-metasztázis Gyomor Cancer
• PLoS One: prognosztikai értéke nyirokcsomó arány a Stage III gyomorrákos betegek gyökeres Resection