PLoS ONE: NMe2 Vermindert proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen te beperken Metastasis

Abstract

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en heeft een hoge mate van metastase. Onze hypothese is dat NMe2
(nucleosidedifosfaat Kinase 2), die eerder als anti-metastatische gen beschouwd, speelt een rol bij het invasieve karakter van maagkanker cellen. Met een tissue chiptechnologie immunohistochemie we aangetoond dat NMe2 expressie geassocieerd met niveaus van differentiatie van maagkanker cellen en hun metastasen in de lymfeknopen. Wanneer de NMe2
genproduct tot overexpressie gebracht door; in vitro
stabiele transfectie, cellen van BGC823 en MKN45 maagkanker cellijnen waren snelheden van proliferatie, migratie en invasie verminderd door collageen matrix wijst een remmende activiteit van NMe2 bij de verspreiding en invasie van maagkanker. NMe2 kon daarom ernstig als een risicofactor voor maagkanker invasiviteit en een potentieel nieuw doelwit voor gentherapie te versterken of te induceren NMe2 expressie

Visum:. Liu Yf, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, L Zhang, et al. (2015) NMe2 Vermindert proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen te beperken metastase. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10.1371 /journal.pone.0115968

Academic Editor: Jian Cao, Stony Brook University, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 18 april 2014; Aanvaard: 3 december 2014; Gepubliceerd: 20 februari 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering: Deze studie werd ondersteund door het programma ondersteunt voor Chang-Jiang Scholars en Innovative Research Team in University (PCSIRT: IRT1137) en de Basic Research fondsen voor de Central Universiteiten (lzujbky-2013-ct06). De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of voorbereiding van dit manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

introductie

Cancer blijft als een belangrijke oorzaak van de dood, goed voor 14,1 miljoen nieuwe gevallen en 8,2 miljoen doden in 2012 [1]. Het aantal nieuwe gevallen naar verwachting 70% wereldwijd 22 miljoen stijgen in de komende twintig jaar [2]. Kanker in de longen, maag, lever, dikke darm en borsten de hoogste mortaliteit [3]. Maagkanker cellen kunnen direct verspreiden naar aangrenzende organen (lokale invasie), zoals de pancreas, colon transversum, de lever en de milt en op afstand lymfeklieren, de longen en botweefsel. Terwijl ze twee verschillende pathologische processen, lokale invasie en metastase op afstand met elkaar verbonden zijn, waar de voormalige vaak bevordert en propageert het laatste. Genetische mutaties en hun afwijkende producten zijn de belangrijkste kenmerken en enablers van kankercellen voor proliferatie, weerstand tegen apoptose, lokale invasie, metastase, het immuunsysteem fraude, angiogenese, en de respons op DNA-schade. NME
(nucleosidedifosfaat Kinase 2 of niet-uitgezaaide cellen) vertegenwoordigt een groep van kanker-geassocieerde en /of kanker reguleren genen.

NME
bestaat uit een familie van 10 genen die ook bekend staan ​​als de NM23
genen [4] en is geassocieerd met onderdrukking van kanker metastase en invasie weefselbeschadiging [5]. Onder de leden van dit gen familie, NME1 Kopen en NMe2
uitgebreid zijn bestudeerd voor hun kanker-onderdrukkende activiteiten. NMe2
, die wordt afgebeeld op chromosoom 17q21 [6,7], codeert de B subeenheid van het nucleoside difosfaat (NDP) kinase [4]. Het product is vermeld dat de metastase van borstkanker en melanoom cellen te remmen; en een daling van de expressie correleerde met een grotere metastatisch potentieel van deze kankers [8,9]. Echter, NMe2
overexpressie werd ook geassocieerd met een slechte prognose voor neuroblastoom en osteosarcoom [10,11]. Bovendien werd de NMe2
gen niet gecorreleerd met de metastase van hepatocellulaire endometrium en schildkliercarcinoom [12-14]. Deze ogenschijnlijk tegenstrijdige gegevens suggereren dat NMe2 verschillende effecten op verschillende soorten kankercellen en hun vermogen kunnen ter plaatse te binnenvallen omringende weefsels of organen metastasen op afstand.

Door deze diverse NMe2 activiteiten van verschillende kankertypes, analyseerden we operatief verwijderd weefsel van patiënten met maagkanker en de bijbehorende NMe2 expressie in deze weefsels met de pathologische kenmerken. Deze pathologie studie werd aangevuld met In vitro
experimenten, waar we de tarieven van de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen die stabiel zijn getransfecteerd met een menselijke NMe2
cDNA om zijn product overexpressie onderzocht . Deze In vitro
experimenten zijn ontworpen om de invasiviteit van kankercellen die verschillende niveaus van NMe2 uitdrukken begrijpen.

Materialen en methoden

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie het uitvoeren van het menselijk onderzoek van Lanzhou University, School of Medicine. Patiënten of hun verzorgers, mits de schriftelijke toestemming alvorens te worden aangeworven in de studie.

Tissue immunohistochemie

We analyseerden NMe2 expressie bij maagkanker en aangrenzende normale weefsels operatief verwijderd uit 139 patiënten opgenomen in het leger regionaal Ziekenhuis in de stad Lanzhou van 2011 tot 2012. Geen van de patiënten behandeld met chemotherapie of bestraling voor de operatie. Deze kanker operatief verwijderd weefsel werden verwerkt voor hematoxyline en eosine (HE) kleuring. In het kort werd een wax module geponste opening 42 gaten (6 × 7 holes /chip) van elk 2 mm. Weefsel blokken werden ingebed in deze gaten (één monster /hole). Deze wax module werd vervolgens doorgesneden, zodat weefsel van 40 patiënten die gelijktijdig op een enkele dia kon worden onderzocht om vlek uniformiteit. Voor controle werden gaten voor- en ingebed met weefsel van de niet-kanker lever en nieren, respectievelijk. Nme2 expressie werd gedetecteerd met een commercieel immunohistochemie kit (Beijing ZSGB Biotechnology Co, Ltd.) met een konijn anti-humaan NMe2 antilichaam (1: 300 verdunning, Beijing Biosynthese Biotechnologie Co, Ltd.) volgens de instructies van de fabrikant. Niveaus van expressie Nme2 numeriek gescoord als getoond in tabel 1 door een patholoog die was geblindeerd voor de klinische gegevens van deze patiënten.

Celkweek en transfectie cDNA

Cellen uit de BGC823 en MKN45 maag kanker cellijnen werden gekocht van de Chinese Academy of Science (Shanghai, China). Cellen in de BGC823 lijn waren oorspronkelijk van een 62-jarige man met een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag en die in de MKN45 lijn afgeleid van een metastatische massa van de lever van een 62-jarige Japanse vrouw met een ongedifferentieerde adenocarcinoom van de buik. Cellen van beide lijnen had restgehalten NMe2 expressie en zijn derhalve ideaal voor het bestuderen van het effect van het genproduct tot overexpressie op maagkanker cellen in vitro
.

De cellen werden gekweekt in een DMEM medium (Sigma, St. Louis, MO, VS) met 10% foetaal kalfsserum (Hangzhou Sijiqing Biological Materials engineering Co, Ltd, Hangzhou, China) bij 37 ° C met 5% CO _{2 en 95 % lucht. Bij 70-80% confluentie, werden deze getransfecteerd met het cDNA voor het humane NMe2
gen dat werd gekloond in een vector pcDNA3.1 (Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, China) met gebruik van Lipofectamine 2000 zoals de DNA-carrier (Invitrogen, Grand Island, NY, VS). Cellen die stabiel NMe2 (aangeduid als NMe2) werden geselecteerd door het kweken van de getransfecteerde cellen in DMEM medium bevattende 1 mg /ml G418. Controlecellen werden getransfecteerd met pcDNA vector zonder NMe2
cDNA insert (aangeduid als mock) en ondergingen dezelfde selectie. Un-getransfecteerde ouderlijke cellen werden ook onderzocht als basislijn controles. Een overexpressie van NMe2 werd bepaald door RT-PCR op het niveau van NMe2
mRNA en immunoblots van getransfecteerde cellysaten onder toepassing van een polyklonaal antilichaam NMe2 kwantificeren (1:. 100 verdunning, Beijing Biosynthese Biotechnology Co, Ltd)}

RNA-isolatie en RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd uit getransfecteerde en ongetransfecteerde cellen met behulp van een commercieel RNA isolatie kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian, China) volgens de instructies van de fabrikant. RNA (2 pg) van elk monster werd aan omgekeerde transcriptie onder toepassing van een PrimeScript RT Kit volgens het protocol van de fabrikant. De complementaire DNA omgekeerd getranscribeerd van het RNA geëxtraheerd uit deze cellen werd geamplificeerd door een Taq-polymerase met de volgende primers voor NMe2
cDNA: 5'-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 '(voorwaarts) en 5'-3-GGTCTCCCCAAGCATCACTC '(omgekeerde). Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) werd eveneens als controle geamplificeerd met de volgende primers: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '(voorwaarts) en 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3' (omgekeerde). De amplificatiereactie werd gestart door denatureren DNA bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 30 cycli van matrijs denaturatie bij 94 ° C gedurende 1 min, primer annealing bij 60 ° C gedurende 1 minuut, en primerverlenging bij 72 ° C gedurende 1 minuut. De NMe2 overexpressie werd kwantitatief gedefinieerd als een toename van de NMe2
mRNA door twee maal of meer van de door het sham getransfecteerde cellen te stellen baseline.

Immunofluorescentie kleuring van de NMe2
product

Cellen stabiel getransfecteerd met de NMe2
cDNA en een voertuig vector werden uitgeplaat op dekglaasjes en toegestaan ​​te groeien tot samenvloeiing. Ze werden tweemaal gewassen met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), in 4% paraformaldehyd in PBS gedurende 15 min gefixeerd, gepermeabiliseerd met 0,5% Triton X-100 en geïncubeerd met 1% runderserumalbumine (BSA) voor 30 min blokkeren aspecifieke binding. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met een konijn-antilichaam tegen humaan NMe2 (1: 100, Beijing Biosynthese Biotechnology) gedurende 24 uur bij 4 ° C gevolgd door incubatie met FITC-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 100, Beijing Biosynthese Biotechnology) gedurende 1 uur . Alle antilichamen werden verdund in PBS bevattende 1% BSA. Kernen werden tegengekleurd met DAPI (1: 100 in PBS, 10 min bij kamertemperatuur).

celcyclusanalyse

Cellen die stabiel NMe2 en controlecellen in kweek werden verzameld en met 70% vaste ijskoude ethanol bij 4 ° C gedurende 24 uur, tweemaal gewassen met ijskoude PBS en vervolgens behandeld met RNase A (20 ug /ml) gedurende 30 min bij 37 ° C. Ze werden geïncubeerd met propidiumjodide (10 ug /ml eindconcentratie) in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor analyse met flowcytometrie voor DNA ploïdie.

Kolonie vorming assay

Getransfecteerde en controle cellen werden gekweekt bij een initiële dichtheid van 1000 cellen per 100 mm kweekschaal in volledig DMEM medium gedurende maximaal 4 weken. Zij werden vervolgens gekleurd met methylviolet. Alle celkolonies die groter zijn dan 2 mm in diameter waren (bestanddeel ≥50 cellen) werden geteld in drie afzonderlijke schotels en uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Ten behoeve van de validatie data, hebben we ook levensvatbare cellen die gekweekt waren voor maximaal 96 uur. Kort ouderlijke BCG823 en MKN45 cellen en cellen die stabiel werden getransfecteerd met hetzij een humane NMe2
cDNA of het voertuig vector (pc-DNA 3,1) werden uitgeplaat bij een dichtheid van 2 x 10 ^{4 cellen /ml. Ze werden losgemaakt 48-96 uur na eerste enten met 1% trypsine en gecentrifugeerd bij 1600 x g. Celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in PBS en geïncubeerd met 0,04% van trypan blauw voor 3 minuten. Overlevende cellen werden geteld op een hemocytometer.}

Tests voor celmigratie

Twee complementaire testen werden uitgevoerd om het effect van overexpressie NMe2 op de snelheid van celmigratie gemeten. Eerst was een wondgenezende assay, waarbij cellen in platen met 6 putjes uitgeplaat en men liet ze groeien tot ≥ 95% confluent. Na tweemaal wassen cellen met PBS, werd een steriele pipet gebruikt om de cel monolaag (4-5 parallelle krassen /plaat) krabben. De cellen werden weer gewassen met PBS, gefotografeerd met gekraste sporen markeren en geïncubeerd met 2,5 ml serumvrij DMEM medium. Bij een uitgangswaarde celmigratie werd een gekraste gebied gedeeltelijk door cellen gemigreerd naar de gewonde gebied 24-48 uur na verwonding, resulterend in een kleinere celvrije omgeving. Omdat deze wondgenezing assay semi-kwantitatieve, werden de resultaten verder bevestigd met een Transwell celmigratie assay. Kort samengevat, 6 x 10 ^{5 cellen gesuspendeerd in 500 ul serumvrij medium dat 0,1% BSA werden uitgeplaat in een Transwell (BD Biosciences) die in een 24 wells plaat geplaatst. De onderste kamer bevatte 500 pl compleet DMEM medium. Men liet de cellen groeien in de bovenste kamer van 24 uur tot celmigratie vergemakkelijken van de bovenste kamer naar de onderste kamer. Op het einde van deze incubatieperiode, het membraan in de bovenste kamer werd gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten, gewassen met destilleren water en lucht gedroogd. Cellen aan de tegenoverliggende zijde van de kamer (transmigrated) werden gekleurd met 0,1% methyl violet (Dade-Behring, Newark, DE) gedurende 30 minuten, gewassen, en bekeken onder een rechtopstaande microscoop (400 x, Nikon). Cel migratie werd gedefinieerd als het aantal cellen op het membraan in 5 willekeurige beoordeling velden.}

Assay voor cellulaire invasie

Transwell kamers werden bekleed met rattenstaart type I fibrillair collageen [15] gedurende 30 min bij 37 ° C. Overmaat vloeistof werd verwijderd en bekleed kamers werden aan de lucht gedroogd gedurende 1 uur in een steriele omgeving. De cellen werden gesuspendeerd in 500 ul serumvrij DMEM medium dat 0,1% BSA tot een uiteindelijke dichtheid van 6 x 10 ^{5 en uitgeplaat op de collageenmatrix in een transwell dat op een plaat met 24 putjes geplaatst. De onderste kamer bevatte 500 pl compleet DMEM medium. Cellen bleven op het membraanoppervlak werden voorzichtig verwijderd 24 uur na cellen werden gezaaid en het membraan werd gefixeerd en gekleurd voor cellen die door de collageenmatrix had transmigrated naar de andere kant van de transwell membraan.}

Statistische analyses

Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van de SPSS 20.0 statistisch programma. Kwantitatieve waarden werden uitgedrukt als gemiddelde en SEM. De volgende statistische analyses werden gebruikt in de studie: Fisher's exact test of chi-kwadraat test voor het definiëren van de relatie tussen NMe2 expressie en pathologische kenmerken van kankerweefsel; een ANOVA voor groepen vergelijking tussen ouderlijke cellen en cellen die met ofwel een voertuig vector of een mens NMe2
cDNA; en Pearson-analyse voor correlatie tussen NMe2 expressie en differentiatie en uitzaaiing van kankercellen.

Resultaten

Vereniging van NMe2 expressie met histologische kenmerken van maagkanker

We verzamelden chirurgische exemplaar uit 139 patiënten met adenocarcinoom van de maag. Tabel 2 geeft de demografische gegevens van deze patiënten en histologische kenmerken van kankerweefsel van deze patiënten. Nme2 expressie was zwak of niet gedetecteerd in slecht gedifferentieerde weefsels, maar was intensief goed gedifferentieerd weefsel op een niveau dat vergelijkbaar aangrenzend normaal weefsel (fig. 1). Een hoog NMe2 expressie werd geassocieerd met een significant verlaagd metastase naar de lymfeklieren ( p
= 0,038), maar niet met de grootte van de primaire tumor en de diepte van kankerinvasie. Een Pearson correlatie analyse toonde aan dat NMe2 expressie onafhankelijk werd geassocieerd met de tarieven van de celdifferentiatie (r = 0,436, p
= 0.000) en verspreid naar de lokale lymfeklieren (r = -0,281, p
= 0,001, tabel 1).

Effect van NMe2 op de proliferatie van maagkanker cellen in de cultuur

Om de associatie van NMe2 expressie met pathologische kenmerken van maagkanker cellen verder te onderzoeken, bestudeerden we cellen de BGC823 en MKN45 maagkanker lijnen, die NMe2 zwak tot expressie in een gehalte vergeleken met slecht gedifferentieerde kankerweefsel (fig. 1). Deze cellen werden getransfecteerd met een menselijke NMe2
cDNA tot overexpressie NMe2 kwantitatief gemeten door een toename van de NMe2
mRNA (kwantitatieve RT-PCR) en NMe2 eiwitproduct (immunofluorescentie, fig. 2 ).

vervolgens onderzochten hoe overexpressie NMe2 gereguleerde celgroei door meting van de DNA ploïdie en kolonievorming van deze cellen. Detecteerden we geen verschil in DNA ploïdie tussen overexpressie NMe2 en de niet-getransfecteerde en pseudo-getransfecteerde cellen van beide lijnen (Tabel 3 en Figuur S1.), Wat suggereert dat een toename van expressie NMe2 geen effect op de celcyclus gehad. Echter, NMe2-overexpressie cellen hadden een significant verminderd vermogen om kolonies te vormen in kweek vergeleken met placebo getransfecteerde en ongetransfecteerde cellen (Fig. 3). Deze waarneming werd bevestigd door de resultaten van een cel-telmethode (Fig. 3C)

Effect van NMe2 op mobiele migratie en invasie

We naast geëvalueerd het vermogen van NMe2-overexpressie cellen om te migreren, omdat een directionele migratie is een belangrijke voorwaarde voor de invasie van kankercellen naar de omliggende weefsel. Deze directionele migratie werd onderzocht met behulp van een wondgenezing assay, die de snelheid van de cellen migratie meet in het gebied van de schade die door een scherp voorwerp. Zoals getoond in Fig. 4A en 4B, de breedte van een gewonde gebied na 48 uur in kweken was groter voor NMe2
getransfecteerde cellen dan voor niet-getransfecteerde en mock-getransfecteerde cellen. De langzame migratie werd gevonden in cellen uit beide cellijnen, wat suggereert dat overexpressie NMe2 gemigreerd veel langzamer. Omdat deze wondgenezing assay semi-kwantitatieve, we ook kwantitatief meten van de snelheid van celmigratie met een Transwell-assay. Consistent met de wondgenezing assay NMe2 overexpressie cellen gemigreerd -50% van ongetransfecteerde of mock-getransfecteerde cellen (Fig. 4).

Een afname in celmigratie zou kunnen verminderen het vermogen van deze cellen binnenvallen omliggende weefsel. Om deze mogelijkheid te testen meten we de invasie van kankercellen aan de collageenmatrix in een gevestigde Transwell kamer assay. BGC823 cellen die overexpressie NMe2 aanzienlijk verminderd hun vermogen om een ​​collageenmatrix binnendringen tot 60% van niet-getransfecteerde en pseudo-getransfecteerde cellen (Fig. 5). De snelheid van inval was eveneens verminderd MKN45 cellen getransfecteerd met de NMe2
cDNA in vergelijking met ouderlijke cellen die zijn getransfecteerd met een vector voertuig (fig. 5).

Discussie

We hebben de relatie tussen de expressie NMe2 en kenmerken van maagkanker in weefsels chirurgisch verwijderd van patiënten en in gekweekte cellen onderzocht vanuit twee bekende maagkanker lijnen. Het onderzoek is noodzakelijk omdat NMe2
werd oorspronkelijk geïdentificeerd als het eerste metastase suppressor gen, maar het vermogen om kanker lokale invasie en metastase externe blok lijkt celtypespecifieke bij kankers die tot nu toe zijn onderzocht [8- worden 14]. Zo een analyse van 35 patiënten met schildkliercarcinoom papillair carcinoom en 11 van metastatische lymfeknopen een significant verlaagd niveau van de NME1
mRNA in metastatische lymfeknopen, terwijl NMe2
mRNA werd niet veranderd in de oorspronkelijke tumor en lymfklieren [14], wat suggereert differentiële rol van NME1 en NMe2 bij kanker en metastase. Een meta-analyse van 278 patiënten met darmkanker, 177 met borstkanker, 137 met eierstokkanker en 77 met longkanker vonden ook slechts in beperkte mate van NMe2 expressie bij uitgezaaide kanker in vergelijking met niet-uitgezaaide kanker [17]. Ondanks een negatieve associatie tussen NME1 /NMe2 expressie en kankerinvasie de plaatselijke lymfeklieren en infiltratie endometrial, NME expressie was niet geassocieerd met TNM scores en de differentiatie van intrauterine membraan carcinoom en cervicale kanker [16]. Hier geven we verscheidene lijnen van bewijs dat NMe2 beperkt de proliferatie, migratie en invasie van de extracellulaire matrix van maagkanker cellen.

Eerst wordt een hoger NMe2 expressie in goed gedifferentieerde en minder invasief weefsels van maagkanker operatief verwijderd voordat chemotherapie en radiotherapie in een groot patiënt cohort (tabel 1 & fig. 1). De metastase van kanker lokale lymfeknopen werd voorkomen bij het kankerweefsel dat een lage NMe2 expressie en deze correlatie tussen NMe2 expressie en differentiatie /metastase in deze patiënt weefsels hadden blijft nadat de gegevens werden gestratificeerd voor leeftijd, geslacht, de grootte van de primaire tumor en invasiediepte (tabel 1 & 2). Deze bevindingen komen overeen met een recent rapport dat NMe2 bindt de telomeer repeat bindende factor 2 in de kern om telomerase activiteit [37] verminderen, hetgeen duidt op een mechanistische verband tussen NMe2 expressie en overleving van kankercellen.

Ten tweede, we onderzocht effecten van overexpressie NMe2 op aantallen proliferatie, migratie en invasie van de extracellulaire matrix in vitro
van cellen uit de twee goed bestudeerde maagkanker cellijnen BGC823 en MKN45 [18-21]. De transfectie met een menselijke NMe2
cDNA resulteerde in een tweevoudige of grotere mate van NMe2 expressie in deze cellen in vergelijking met getransfecteerde cellen spot (fig. 2). Deze Nme2 overexpressie had geen invloed DNA ploïdie (tabel 3), maar aanzienlijk vertraagd de kolonievorming van deze cellen (fig. 3), hetgeen suggereert dat overexpressie NMe2 vertraagt ​​de overgang van DNA replicatie mitose. Dit resultaat is in overeenstemming met eerdere rapporten die NMe2 geen invloed op de groei van gekweekte kankercellen en wordt niet geassocieerd met de grootte van primaire kanker geïmplanteerd in dieren [22-27]. Het is echter in strijd met rapporten die NMe2 bevordert [28,29] of verkleint [30] de proliferatie van andere typen kankercellen. Exacte redenen voor de discrepantie nog verder worden onderzocht, maar deze gegevens suggereren celtype-specifieke effecten van de NMe2
gen over de pathogenese van kanker.

Ten derde, in tegenstelling tot een minimaal effect op de proliferatie van kankercellen maag, de overexpressie van NMe2 resulteert een aanzienlijke vermindering van celmigratie en invasie door de collageenmatrix zoals aangetoond in drie verschillende, maar complementaire assays (figuren 4 &. 5). Onze gegevens ondersteunen eerdere bevindingen van soortgelijke remmende effecten op borstkanker [8], oraal plaveiselcelcarcinoom [28] en melanoomcellen [9], ofschoon uitzonderingen opnieuw opgemerkt bij hepatocellulaire [13,29] en colorectale carcinoma cellen [31]. Moet nog worden bepaald of verminderde migratie en invasie van NMe2-overexpressie cellen het gevolg van een verminderd vermogen van deze cellen om proliferatie.

De resultaten die maagkanker cellen gevoelig overexpressie NMe2, maar kritische vraag blijft wat regelt deze diverse NMe2 activiteiten tussen verschillende soorten kankercellen. Een mogelijk mechanisme is dat een NMe2 activiteit afhankelijk up- en downstream moleculen die interageren met NMe2 in een bepaald celtype. Meerdere moleculen eerder geïdentificeerd interactie of reguleren NMe2, zoals EGFR, c-erbB-2
, c-erbB-3 Kopen en geslachtssteroïden receptor in ovariumcarcinoom [32]. Plakoglobine werd gemeld om met NMe2 zijn expressie in cellen van humane tong plaveiselcelcarcinoom [33] bevorderen. Nme2 bleek eveneens interactie met MDM2 (Muis dubbele minuut 2 homoloog) aan de motiliteit van renale carcinoma cellen [34] te verminderen. MDM2 is een E3 ubiquitine-eiwit ligase en dient als een negatieve regulator van p53. De relatie tussen de NMe2
-gen en genen van myc
familie blijkt gecompliceerder te zijn. Producten van de NME1 Kopen en NMe2
genen zijn voorgesteld stroomafwaarts van de c- myc
regelgeving weg te zijn [7] en betrokken zijn bij de down-regulatie van Cdc42 functie neuroblastoma [35]. Nme2 is ook gemeld om met de G-quadruplex DNA in de nuclease overgevoelige element van de c-myc
promotor om c-myc-expressie [36] induceren. Een systeembiologische benadering van deze specifieke trajecten in plaats van individuele moleculen te onderzoeken nodig zijn om de rollen van de NMe2
gen en zijn product in verschillende soorten kanker te ontleden.

Kortom, we hebben aangetoond dat een overexpressie van NMe2 vermindert de migratie en invasie van maagkanker cellen aan de extracellulaire matrix in vitro
. Hierdoor wordt NMe2 expressie geassocieerd met de goed gedifferentieerd en minder invasitve histologie van maagkanker. Deze resultaten suggereren dat de NMe2
gen en zijn product kunnen dienen als potentiële merker voor het voorspellen van de invasiviteit van maagkanker en ook als een therapeutisch doelwit dat kan worden up-gereguleerd via gentherapie.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Effect van overexpressie Nme2 maagkanker cellen celcyclus. Ondernemingen De DNA ploïdie van cellen getransfecteerd met NMe2
cDNA werd geanalyseerd door middel van flowcytometrie met een commerciële kit volgens instructies van de fabrikant. De panelen A-C waren voor ouderlijke BCG823 cellen en die getransfecteerd met de NMe2
cDNA of vector. De panelen D-F waren voor MKN45 cellen met dezelfde behandelingen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115968.s001
(DOC)

• PLoS ONE: transcriptiefactoren en microRNA-Co-gereguleerde genen bij maagkanker invasie in Ex Vivo
• PLoS ONE: de klinische betekenis en de risicofactoren van Solitary lymfekliermetastasen bij maagkanker