PLoS ONE: stanse av XB130 er knyttet Både Prognose og kjemosensitivitet av magekreft

Abstract

XB130 er en nylig preget adapter protein som ble rapportert å fremme skjoldbrusktumorvekst, men dens rolle i utviklingen av andre typer kreft som magekreft (GC) er fortsatt ukjent. Følgelig undersøkte vi sammenhengen mellom XB130 uttrykk og prognosen for GC pasienter. Fagene var 411 pasienter med GC i etapper jeg til IV. XB130 uttrykk ble undersøkt i kirurgiske eksemplarer av GC. Kaplan-Meier analyse og Cox-modellen ble brukt for å vurdere den prognostiske betydningen av XB130 for overlevelse og gjentakelse. Videre ble GC-celler som stabilt transfektert med XB130 kort hårnål RNA etablert for å analysere effekten av XB130 på følsomheten kjemoterapi. Resultatene viser at både XB130 mRNA og protein ekspresjon ble påvist i normale mage vev. pasienter I-III på total overlevelse tiden av scenen IV pasienter og sykdomsfri periode etter radikal reseksjon av GC i scenen var betydelig kortere når immunhistokjemisk farging for XB130 var lav enn når farging ble høy (både p
<0,05). XB130 uttrykk også spådd svulst følsomhet for flere kjemoterapi agenter. Levedyktigheten til både XB130-Silenced SGC7901 celler og villtype-celler ble undertrykket med 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin, og irinotecan på en doseavhengig måte, men cisplatin og irinotecan var mer følsomme mot sXB130-dempede GC-celler og 5-FU viste høyere følsomhet for villtype-celler. Når behandlet av 5-FU, pasienter med høyt uttrykk for XB130 tumorer hadde høyere overlevelse enn de med lav uttrykk svulster. Disse funnene tyder på at redusert XB130 protein uttrykk er en prognostisk biomarkør for kortere overlevelse og en høyere tilbakefall hos pasienter med GC, samt for respons på kjemoterapi

Citation. Shi M, Huang W, Lin L Zheng D, Zuo Q, Wang L, et al. (2012) stanse av XB130 er knyttet Både Prognose og kjemosensitivitet av magekreft. PLoS ONE 7 (8): e41660. doi: 10,1371 /journal.pone.0041660

Redaktør: Zilong Wen, Hong Kong University of Science and Technology, Kina

mottatt: 31 mars 2012; Godkjent: 24 juni 2012; Publisert: 23 august 2012

Copyright: © Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Program på Key Basic Research Project (2012CB945100, til WL og YL), team Program of Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (S2011030003134, til WL og YL) Natural. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

onkogener og anti-onkogener har en viktig rolle i utvikling og progresjon av Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC), og genetisk heterogenitet har vist seg å påvirke prognosen markert. Derfor, på jakt etter nye gener og proteiner med potensiell verdi som diagnostisk eller prognostisk verktøy er viktig, og målretting nye onkogener er en annen lovende tilnærming til kreftbehandling.

XB130 er en nylig identifiserte adapter protein som er sterkt uttrykt i milt og skjoldbruskkjertelen hos mennesker, mens det viser svak ekspresjon i nyre, hjerne, lunge og bukspyttkjertel [1]. XB130 har blitt påvist i follikulært og papillær thyroideakarsinom, så vel som i humane lungekreft-cellelinjer [2]. Selv om sin ekspresjon ble redusert i thyroid karsinom, ble XB130 funnet å være en tumor promoter [2]. Det har blitt rapportert at XB130 ikke bare har en rolle i cellevekst, overlevelse, motilitet, og invasjon [2], [3], [4], men er også involvert i signaltransduksjon [1]. XB130 reguleres av Rac og av cytoskjelettet [3], og det er involvert i aktivering av c-Src [1] og den fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) /Akt sti [4], som i sin tur regulerer cytoskeletal funksjon [3]. Disse signalveier er også blitt vist å ha en viktig rolle i utvikling og progresjon av GC [5], [6], [7]. Derfor, kan det være en rolle XB130 i GC også. Imidlertid har ingen forskning på dette nylig funnet adapter protein blitt gjort på området gastroenterologi hittil. I denne studien hypotese vi at XB130 uttrykk kan være assosiert med overlevelse og /eller tumor residiv samt med kjemosensitivitet av GC.

Resultater

XB130 uttrykk i normale mage vev og GC

Forskjellig fra tidligere rapporter, bekreftet vi at XB130 er konstitutivt uttrykt i normale vev av human lever, tykktarm, milt og mage (Figur 1a). Immunhistokjemi ble utført for å evaluere XB130 ekspresjon i alle 411 par av parafininnstøpte seksjoner fra GC og deres tilstøtende ikke-tumorvev. Vi fant at XB130 ble overveiende uttrykt i cytoplasma i normal gastrisk vev, mens det var signifikant nedregulert i vev av GC. Vi videre kategorisert GCer inn XB130 positiver (høy uttrykk med poengsum ≥3) og negative (lav uttrykk med poengsum < 3) ved farging score (Figur 1b). Forekomst av XB130 positive og negative i fase I-III GC var ingen forskjell, men den delen av XB130 negativer var høyere i stadium IV og i post-kirurgi tilbakefall grupper (Figur 1c). Kvantifisert mRNA nivå av XB130 ble oppdaget i stadium IV palliativ reseksjon prøver og betydelig redusert i avansert GCer (figur 1d). Tilsvarende redusert protein uttrykk for XB130 i avansert GC ble også bekreftet av western blot (figur 1e).

Lav uttrykk for XB130 er korrelert med dårlig prognose

I analysen av samlet 411 tilfeller av GC i trinn i-IV, kumulert overlevelse av pasienter med XB130 negativ farging var signifikant lavere enn de med positiv farging (figur 2a). Hos pasienter med stadium IV GC som mistet operasjonen kur muligheten, det viste signifikant lavere overlevelse i XB130 negativ gruppe (figur 2b). Median total overlevelse av pasienter med avansert stadium var lengre i XB130 positiv gruppe enn i negativ gruppe (16,7 vs. 8,5 måneder, HR for negativ gruppe var 1,72, p = 0,011, tabell 1). Hos pasienter ved stadium I-III GC som fikk radikal resect kirurgi, det sykdomsfri overlevelse i XB130 positive var høyere enn den negative gruppen (p < 0,05, figur 2c), mens median tid til gjentakelse var 36 og 24 måneder i positive og negative grupper, henholdsvis (Tabell 1, HR for negative pasienter var 1,2, p = 0,022). Disse funnene tyder på at lav uttrykk for XB130 er assosiert med kortere overlevelse og høyere tilbakefall i GC pasienter.

prognostisk verdi av andre clinicopathological parametere

påvirkning av andre clinicopathological parametere på total overlevelse og sykdoms- overlevelse ble oppført i tabell 1 og figur 3. i tillegg til XB130, resultatene av Kaplan-Meier overlevelsesfunksjonsanalyse hos pasienter på IV stadium gruppert etter den kjente faktorer som carcinoembryonic antigen (CEA) konsentrasjon, differensial grad, metastase , ascites og kjemoterapi demonstrerte betydelig innflytelse på den kumulerte overlevelse (figur 3 a-e). I en univariat Cox regresjonsanalyse hos pasienter fikk radikal terapi, bemerket vi at scenen var også en signifikant prognostisk faktor for gjentakelse (tabell 1).

I en multivariat analyse ved hjelp av Cox-modell, bemerket vi at XB130, CEA, kjemoterapi og ascites (alle p < 0,01) var uavhengige faktorer for å forutsi HR for død hos pasienter med stadium IV, mens XB130 (p = 0,044) og scene (p < 0,000) var uavhengige faktorer for å forutsi HR for gjentakelse etter radikal reseksjon av GC hos pasienter ved stadium i-III (tabell 2).

Kjemoterapeutika følsomhet i respons til XB130 stanse

for å finne ut det terapeutiske potensialet i målretting XB130, vi vurdert celle levedyktighet SH- XB130 i respons til 5-FU, cisplatin og irinotecan. Den celleviabilitet i SH-XB130 og villtype-grupper ble begge undertrykket ved alle tre kjemoterapeutiske midler på en doseavhengig måte. Henholdsvis, sammenlignet med sh-XB130, villtype kontroll viste mer følsomme for 5-FU manifestert ved en betydelig lavere cellelevedyktighet (figur 4a), mens cisplatin (figur 4b) og irinotecan (figur 4c) ble vist å være mer effektiv i SH- XB130 gruppen enn i villtype kontroll.

Survival analyse i GC pasienter som fikk 5-FU terapi

Sortert etter XB130 negative og positive, vi evaluert 5-FU terapi i stadium IV GC pasienter i en retrospektiv studie. Behandlet av 5-FU, pasienter med XB130 positiv farging hatt en høyere overlevelse enn de negative gruppen (Figur 4d). Tilsvarende XB130 positive med 5-FU behandling hadde lengre median total overlevelse tid (figur 4d). Siden det var få pasienter behandlet med cisplatin eller irinotecan, ble påvirket av XB130 uttrykk nivå på kliniske terapeutiske effekter ikke sammenlignes i studien.

Diskusjoner

XB130 er et nylig klonet 130 kDa-adapter protein og er rapportert å være overveiende uttrykt i skjoldbruskkjertelen og milt vev validert av nord blot og spiller en multifunksjonell rolle i celle overlevelse, spredning, invasjon i skjoldbrusktumor [2], [3], [4], men dens mRNA og protein uttrykk i annet vev er ikke blitt bekreftet av real-time PCR, western blot eller immunhistokjemi. I denne artikkelen vil vi først ga bevis for at XB130 mRNA og protein ble også konstitutivt uttrykt i normal mage vev og relativt lavere uttrykk i GC-celler. Disse funnene er i kontrast med tidligere rapporter om at XB130 mRNA var knapt synlig i andre vev, bortsett fra skjoldbruskkjertelen og milt [1], [4], dels fordi de bare brukes Northern blot for bekreftelse. XB130 uttrykk er redusert i skjoldbruskkjertelen svulst, men det er fortsatt helt uklart om XB130 er en prognostisk biomarkør andre ondartede svulster som magekreft (GC) [2]. For å bekrefte at XB130 deltar i GC progresjon, hadde vi analysert overlevelse eller tilbakefall hos 411 pasienter med GC og bemerket at XB130 lav uttrykk spådd en lavere overlevelse og høyere tilbakefall. Videre ble kjemoterapeutiske følsomhet basere på XB130 uttrykk evalueres for første gang, og cellulære eksperimenter og klinisk retrospektiv studie indikerte at nedregulering av XB130 øker narkotika følsomhet for cisplatin og irinotecan og reduserer narkotika følsomhet for 5-fluorouracil.

Gitt den kreftfremkallende i tidligere rapporter [2], [8], [9], XB130 bør betraktes som et oncogent annet enn en tumor-undertrykkende protein, selv om ytterligere studier er nødvendig for å teste hvorvidt det er også tilfelle i GC. Så, hvordan å forklare den kliniske betydningen av vår klinisk observasjon at XB130 downregulation spår en lav total overlevelse i avansert GC og høyere tilbakefall hos pasienter behandlet med radikal reseksjon kirurgi? Faktisk er det kjent at tumorigenesis kan følge av forandringer av multiple gener og proteiner, mens XB130, adapteren protein med mer enn ett funksjonelt domene, kan påvirkes av flere oppstrøms- og nedstrøms faktorer. Derfor er det for tidlig å bedømme om et gen eller et protein er onkogen eller ikke bare basere på sin ekspresjon i kliniske prøver, selv om den sistnevnte fikk antyde noen hint. Egentlig kan nedregulering av XB130 i GC bli betraktet som en kompenserende justering, fordi noen tumor suppressorer ville bli mobilisert for å motstå XB130 under progresjon av GC. På lignende måte ble det rapportert at tumor suppressor p53-ekspresjon var høyere i dårlig differensiert GC enn i godt differensierte seg [10], mens i tidlig magekreftformer med lave nivåer av apoptose, økt ekspresjon av Bcl-2 og p53 var mer sannsynlig for å fremme metastase [11], [12].

XB130 kan være et proto-onkogen, som bevarer i normalt vev. Slike proto-onkogener kan bidra til å opprettholde fysiske funksjoner av cellefornyelse og oppover migrasjon i normale magesekken. Samtidig er det et annet sett med å regulere gener som hindrer normal celle over-spredning og metaplasi. Men når probiotics balansen er disequilibrated, celle-proliferasjon og metastase er ute av kontroll, og følgelig fører til kreftutvikling [13]. Denne klassiske teorien om proto-onkogen kan gi en akseptabel forklaring på hvorfor normalt vev med så høy XB130 uttrykk fremdeles "sunn". Det er kjent at mange gener og signalveier spille pro-onkogene eller anti-onkogene roller på en kontekstavhengig måte, slik at det er ikke uvanlig at det samme gen kan utøve forskjellig virkning på forskjellige stadier eller i forskjellige vevstyper av kreftutviklingen [ ,,,0],14], [15], [16]. I denne studien, selv om vi ikke berøre funksjonene XB130 i normal mage vev, er dette temaet interessant også, og trenger videre forskning.

Hvis XB130 uttrykk mønster kan tjene som en surrogatmarkør prediktiv kjemoterapi svar, vil det også gi en forklaring for prognosen. Foreløpig fluoropyrimidin derivater basert og platina sammensatte-basert kombinasjonsregimer har blitt akseptert som konvensjonell førstelinjebehandling for GC [17], mens irinotecan, en topoisomerase inhibitor, er ansatt som andrelinjebehandling [18], og cisplatin har i stor grad brukes i behandling av avansert, unresectable GC [19]. I den foreliggende forskning, ble kjemoterapeutisk-følsomhetsstudier basere på XB130 uttrykk nivå utført. I GC-celler, XB130 knockdown indikerte bedre respons til cisplatin og irinotecan, men med mindre følsomhet for 5-FU. Våre kliniske data viste en kortere total overlevelse tid i 5-FU-behandlede pasienter med lav uttrykk for XB130, noe som tyder på at XB130 nedregulering reduserer reaksjonsevne til 5-FU, som kan være en annen forklaring på dårlig prognose hos pasienter med lav uttrykk for XB130 I denne studien. Våre funn i GC cellelinje implisere at i avansert GCer, hvorav de fleste er kjennetegnet av XB130 lav uttrykk, kan ha mer nytte av cisplatin og irinotecan annet enn 5-FU. Gitt den heterogene genomisk bakgrunnen som forskjellige uttrykk for XB130 i GC, er det mulig at enkelte bestander kan ha nytte av irinotecan og /eller cisplatin som det blir foreslått i vår cellular eksperiment, og er verdt for videre undersøkelser. Videre prospektive undersøkelser kan avgjøre om XB130 uttrykk mønstre kan brukes til å hjelpe stratifisere pasienter i ulike multimodale behandlingsregimer.

I sammendraget, har vår nåværende studie gitt første bevis for at XB130 eksistens i mage vev og GC for første gang . Vi bekreftet at kjemoterapeutisk følsomhet evalueringen baserer på XB130 uttrykket ble først rettet, noe som indikerer at XB130 lav uttrykk pasienter kan være sensitive for cisplatin og irinotecan, krever likevel senior bevis. Den kliniske potensialet i denne studien omfatter (1) XB130 kan virke som GC prognostisk biomarkør for sin lave uttrykk impliserer for ugunstige utfall; (2) Siden XB130 lav uttrykt GC er lydhør overfor cisplatin og irinotecan overlegen til 5-fluorouracil i vår kjemoterapeutisk følsomhet studie, kan vurderingen av XB130 uttrykk hjelpe klinisk medisin i GC.

Materialer og Metoder

pasienter og prøver vev

Alle 411 pasienter ble histologisk diagnostisert på Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina) fra 2000 til 2011. Tumor scenen ble definert i henhold til den syvende utgaven av AJCC kreft staging manuelle 2010. Prøver for diagnostiske formål ble tatt med samtykke fra den enkelte pasient. Studien ble godkjent av Institutional Review Board av Nanfang Hospital, Southern Medical University. Gjennomsnittlig oppfølgingstid for alle pasienter var 59,5 (95% KI: fra 55,5 til 63,5) måneder. Den kliniske egenskaper og XB130 uttrykk for alle GC pasientene, er beskrevet i tabell 1. Pasienter av I-III-trinns GC ble utført radikal reseksjon, mens pasienter i stadium IV mottok palliativ operasjon.

Før immunhistokjemisk analyse, i parafininnstøpte primære vevsprøver ble kuttet i 4 mikrometer tykke seksjoner, og montert på glassplater. Ni par av tumor og kreftfrem tilstøtende normalt vev fra GC pasienter stadium IV ble tilfeldig samlet for kvantitativ real-time PCR og seks par for western blot analyse.

Immunohistochemistry

Immunhistokjemisk farging ble utført bruke Dako Envision System (Dako, Carpinteria, CA) og kanin anti-XB130 Ab (1:100; Abnove) etter produsentens anbefalte protokoll. For XB130 vurdering, ble vevet delen skannet helt å tildele resultatet. Den fargeintensitet ble scoret som 0 (negativ), en (svak), 2 (middels) eller 3 (sterk). Graden av farging ble scoret som 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), eller 4 (76% -100%), i henhold til de prosenter av positivt fargede områder i forhold til hele carcinoma området (eller hel del for normale prøver). Summen av fargeintensitet og omfang score ble brukt som den endelige farging score (0-7) for XB130. For det formål å overleve evaluering, ble svulster med en slutt farging Resultatet ≥3 ansett for å være positiv. XB130 farging ble evaluert uavhengig av to personer blindet for de kliniske parametre.

fluorescens kvantitativ PCR

Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkripsjon av cDNA ble deretter hentet med iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Alle RNA dataene ble presentert i forhold til husholdningsgenet β-actin bruker ΔΔCt metoden. Rutine PCR ble også utført for å undersøke ekspresjonen XB130 i forskjellig organ av humane og mus (primer-sekvensene i Tabell S1).

Western blotting

Vevene ble vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning ( PBS) og lyseres med lyseringsbuffer protein i 30 min. Sentrifugering ble utført, og protein-inneholdende supernatant ble beholdt. Protein lysater ble separert electrophorectically på 10% SDS-polyakrylamidgel og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA). Deretter immunoblotting ble utført ved å bruke kanin anti-XB130 antistoff (PradoWalnut, CA, USA) og β-aktin (Santa Cruz, CA). Immunreaktive bånd ble visualisert ved den forbedrede kjemiluminescens metode (Amersham) med en western blotting deteksjonssystem (Kodak Digital Science, Rochester, NY, USA) og ble kvantifisert av Image programvare QuantityOne v4.6.2.

Cell kultur

Celler fra SGC7901-cellelinjen ble dyrket i fullstendig medium [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone)]. Stabilt-transfekterte celler ble opprettholdt i media med nærvær av puromycin (Sigma-Aldrich). Cellene ble inkubert ved 5% CO _{2 ved 37 ° C.}

stabilt transfektert cellelinjer etablering

Tre forskjellige shRNA sekvenser av XB130 ble klonet inn pSuper-Rretro-puromycin plasmid med restriksjonsenzym Bgl II, Hind III (New England Biolabs) og T4 DNA-ligase (Takara). Både pSuper-Rretro-puro-shXB130 og pSuper-Rretro-puro ble konstruert. pSuper-Rretro-puromycin-shXB130 kombinert med pakking plasmidvektor eller krafse vektor som negativ kontroll ble pakket inn i virus ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. SGC7901-celler ble transfektert med plasmider ved hjelp av Lipofectamine shRNA 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), gjentatt tre ganger. Celler ble dyrket som nevnt ovenfor, og enkle kolonier ble valgt ved Western blotting og fluorescens kvantitativ PCR og brukt for videre eksperimenter. Tre shRNA targeting XB130 og en scramble ble utformet (tabell S2). Både mRNA og protein uttrykk for XB130 (primer sekvens i tabell S1, uttrykk Resultatene i figur S1 A, B) ble bekreftet ved real-time PCR og Western blot. Adenovirus-infeksjon effektivitet ble vist i fig S1C og D.

Celleviabilitet analyse

trypsinert og sådd ut på 96-brønners plater ved initial densitet på 0,2 x 10 ^{4 /brønn, ble cellene dyrket og observert ved 1, 3, 5 og 7 dag. Celleviabilitet ble bestemt av metyl thiazolyltetrazolium (MTT) analyse i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ble målt ved 570 nm med 655 nm som referansebølgelengde. Alle forsøkene ble utført in triplo.}

Kjemoterapeutika-sensitivitetsvurderingen i GC-celler

Celler av villtype kontroll og sh-XB130 ble dyrket i medium med 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin eller irinotecan ved forskjellige konsentrasjoner. Førtiåtte timer senere ble celleviabilitet evaluert.

Statistisk analyse

Resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± SEM eller median. Chi-kvadrat test for kategoriske variabler og t-test for kontinuerlige variabler ble brukt. Overlevelse og tilbakefall priser ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier metoden. Statistisk signifikans ble akseptert på en p
verdi på mindre enn 0,05.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Validering av genet stanse effekten av små hårnål RNA av XB130 (sh-XB130) og infeksiøs effektiviteten av adenovirus. XB130 downregulated celler linje modeller ble bekreftet ved real-time PCR (a) og Western blot (b). -Celler transfektert med vektor krafse tjente som negativ kontroll og ikke-transfekterte MOCK som kontroll. Den infektive effektivitet av adenovirus i 293ft dyrkede celler ble bekreftet ved normale (c) og fluorescens (d) microscopies. Inset i A er amplifikasjonskurve av real-time PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s001 plakater (PPT)
Tabell S1.
Primer sekvenser for Real-time eller rutine PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
XB130 Sh-RNA-sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s003 plakater (DOC)

• PLoS ONE: Adenoviral Levering av EMX2 Gene undertrykker vekst i Human Gastric Cancer
• PLoS ONE: Avvikende Trender i Siste populasjonsbasert overlevelse i spiserør og mage Cancer