PLoS ONE: Сайленсинг XB130 связан как с прогнозом и химиочувствительность Желудочный Cancer

Абстрактный
<р> XB130 недавно адаптер характеризуется белок, который, как сообщается, способствуют росту опухоли щитовидной железы, но его роль в прогрессии другие виды рака, такие как рак желудка (GC) остается неизвестной. Соответственно, мы исследовали связь между экспрессией XB130 и прогноз больных ГХ. Обследовано 411 пациентов с GC в стадии I до IV. Выражение XB130 исследовали в хирургических образцах GC. Анализ Каплана-Мейера и модель пропорционального риска Кокса были использованы для оценки прогностической значимости XB130 для выживания и рецидива. Кроме того, GC клетки, стабильно трансфицированные XB130 короткой шпильки РНК были созданы для анализа влияния XB130 на чувствительность к химиотерапии. Результаты показывают, что оба XB130 мРНК и экспрессию белка были обнаружены в нормальных тканях желудка. Общее время выживания стадии IV пациентов и безрецидивной периода после радикальной резекции GC в стадии больных I-III были значительно короче, когда иммуногистохимическое окрашивание на XB130 была низкой, чем при окраске была высокой (как р
&л; 0,05). Выражение XB130 также предсказал чувствительность опухоли к нескольким химиотерапевтических агентов. Жизнеспособность как XB130-низкошумная SGC7901 клетки и клетки дикого типа было подавлено 5-фторурацил (5-ФУ), цисплатин, и иринотекана в зависимости от дозы, но цисплатин и иринотекана были более чувствительны к sXB130-молчащих GC клеток и 5-ФУ показали более высокую чувствительность к клеткам дикого типа. При обработке на 5-ФУ, пациенты с высоким уровнем экспрессии опухолей XB130 имели более высокую выживаемость, чем те, с низким уровнем экспрессии опухолей. Эти данные показывают, что снижение экспрессии белка XB130 является прогностическим биомаркером выживаемости короче и выше частота рецидивов у пациентов с GC, а также для ответа на химиотерапию
<р> Образец цитирования:. Ши M, Хуан W, L Лин , Чжэн D, Цзо Q, Ван L, и др. (2012) Сайленсинг XB130 связан как с прогнозом и химиочувствительность рака желудка. PLoS ONE 7 (8): e41660. DOI: 10.1371 /journal.pone.0041660
<р> Редактор: Zilong Вэнь, Гонконгский университет науки и технологии, Китай
<р> поступила: 31 марта 2012 года; Принято: 24 июня 2012 года; Опубликовано: 23 августа, 2012
<р> Copyright: © Ши и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от Национальной программы по ключевым вопросам базового научно-исследовательского проекта (2012CB945100, к WL и YL), программы команды из фонда естественных наук провинции Гуандун, Китай (S2011030003134, к WL и YL). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> онкогенов и антионкогенов играют жизненно важную роль в развитии и прогрессии рака желудка (GC), и генетической гетерогенности было доказано влиять на прогноз заметно. Таким образом, охота на новых генов и белков с потенциальной ценностью в качестве диагностических или прогностических инструментов имеет важное значение, и ориентации новых онкогенов является еще одним перспективным подходом к лечению рака.
<Р> XB130 является недавно идентифицированный адаптер белок, который сильно выражен в селезенке и щитовидной железы людей, в то время как он показывает слабую экспрессию в почках, головном мозге, легких, поджелудочной железы и [1]. XB130 был обнаружен в фолликулярной и папиллярной карциномы щитовидной железы, а также в линиях карциномы легких клеток человека [2]. Несмотря на то, его экспрессия была снижена при раке щитовидной железы, XB130 Было обнаружено, что промотор опухоли [2]. Сообщалось, что XB130 не только играет роль в пролиферации клеток, выживаемости, подвижности и инвазии [2], [3], [4], но также участвует в передаче сигнала [1]. XB130 регулируется Rac и цитоскелета [3], и он участвует в активации с-Src [1] и фосфатидилэтаноламин-инозитол-3-киназы (PI3K) /Akt пути [4], что, в свою очередь, регулируют цитоскелета функции [3]. Эти сигнальные пути также было показано, играют важную роль в развитии и прогрессировании GC [5], [6], [7]. Следовательно, может быть роль XB130 в GC тоже. Тем не менее, ни одно исследование по найденному белка адаптера не было сделано в области гастроэнтерологии до сих пор. В данном исследовании мы предположили, что экспрессия XB130 может быть связано с выживанием и /или рецидива опухоли, а также с химиочувствительность GC.

Результаты

XB130 выражение в нормальных тканях желудка и GC

в отличие от предыдущих докладов, мы подтвердили, что XB130 конститутивно экспрессируется в нормальных тканях печени человека, толстой кишки, селезенки и желудка (рисунок 1а). Иммуногистохимия выполняли для оценки экспрессии XB130 во всех 411 пар залитых парафином секций от GC и прилегающих к ним тканей неопухолевых. Мы обнаружили, что XB130 была преимущественно экспрессируется в цитоплазме в нормальной желудочной ткани, в то время как она была значительно подавлена ​​в тканях GC. Кроме того, мы классифицировали ШС в XB130 позитивов (высокая экспрессия со счетом ≥3) и негативы (низкая экспрессия со счетом &ЛТ; 3) по оценки окрашивания (рис 1b). Заболеваемость XB130 позитивы и негативы в стадии I-III GC были без разницы, но часть XB130 негативов была выше на стадии IV и в рекуррентным групп после операции (рис 1в). Количественные уровень мРНК XB130 был обнаружен в образцах IV стадии паллиативная резекция и значительно снижается в пожилом ГКС (рис 1d). Аналогичным образом, снижение экспрессии белка XB130 в пожилом GC была также подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга (рис 1е).

Низкая экспрессия XB130 коррелирует с плохим прогнозом

В анализе общих 411 случаев GC на стадии I-IV, накопленная выживаемость пациентов с XB130 отрицательным окрашиванием была значительно ниже, чем те, с положительным окрашиванием (рис 2а). У больных с IV стадией GC, которые потеряли возможность операции вылечить, он показал значительный более низкий уровень выживаемости в группе XB130 отрицательной (рис 2b). Медиана общей выживаемости пациентов на поздней стадии была больше в группе XB130 положительной, чем в отрицательной группе (16,7 против 8,5 месяцев, HR для отрицательной группе была 1,72, р = 0,011; таблица 1). У пациентов на стадии I-III ГК, которые получили радикальной операции резекцию, выживаемость без признаков заболевания в XB130 положительной группе была выше, чем отрицательной группе (р &ЛТ; 0,05; рис 2С), в то время как среднее время перевозникновение было 36 и 24 месяцев в положительных и отрицательных группах, соответственно (таблица 1, HR для отрицательных пациентов составил 1,2, р = 0,022). Эти данные показывают, что низкая экспрессия XB130 ассоциируется с более короткой выживаемости и высшего рецидива у больных ГЦ.

прогностическое значение других параметров клинико-патологическими
<р> Влияние других параметров на клинико-патологическими общей выживаемости и признаков заболевания свободная выживаемость указана в таблице 1 и на рисунке 3. в дополнение к XB130, результаты Kaplan-Meier анализа функции выживаемости у больных на IV стадии, сгруппированных по хорошо известных факторов, таких как раково антигена (СЕА) концентрация, дифференциал степени, метастазирование , асцит и химиотерапии продемонстрировали существенное влияние на кумулятивной выживаемости (рис 3 а-е). В одномерный Кокс регрессионного анализа у пациентов получили радикальную терапию, мы отметили, что этап был также значительным прогностическим фактором для перевозникновения (таблица 1).
<Р> В многофакторного анализа с использованием модели Кокса, мы отмечали, что XB130, CEA, химиотерапия и асцит (во всех случаях р и л; 0,01) были независимыми факторами для прогнозирования HR для смерти у больных на стадии IV, в то время как XB130 (р = 0,044) и стадия (р &л; 0,000) были независимыми факторами для прогнозирования HR для рецидивом после радикальной резекции GC у пациентов на стадии I-III (таблица 2).

химиотерапевтические чувствительность в ответ на XB130 глушителей
<р> для того, чтобы выяснить, терапевтический потенциал в ориентации XB130, мы оценивали жизнеспособность клеток SH- XB130 в ответ на 5-FU, цисплатин и иринотекана. Жизнеспособность клеток в SH-XB130 и дикого типа групп оба были подавлены всеми тремя химиотерапевтических агентов в зависимости от дозы образом. Соответственно, сравнивать с ш-XB130, контроль дикого типа показал, более чувствительны к 5-FU, проявляющееся значительно меньшей жизнеспособности клеток (рис 4а), в то время как цисплатин (4б) и иринотекана (рис 4в) были продемонстрированы более эффективными в SH- группа XB130, чем в контроле дикого типа.

анализ выживаемости у больных ГЦ приема 5-FU терапия
<р> Сортировка по XB130 негатива и позитива, мы оценивали 5-ФУ терапии у больных IV стадии GC в ретроспективное исследование. Лечится 5-ФУ, у пациентов с XB130 положительное окрашивание пользовались более высокий уровень выживаемости, чем отрицательной группы (рис 4г). Соответственно, XB130 позитивов с 5-FU терапия была больше медианы общей выживаемости (рис 4г). С тех пор было несколько пациентов, получавших цисплатин или иринотекана, влияние уровня экспрессии XB130 на клинические терапевтические эффекты не были сопоставлены в настоящем исследовании.

Обсуждение
<р> XB130 является недавно клонировали 130 кДа-адаптер белок и, как сообщается, преимущественно экспрессируется в щитовидной железе и тканях селезенки валидированных с помощью нозерн-блоттинга и играет многофункциональную роль в выживании клеток, пролиферации, инвазии в опухоль щитовидной железы [2], [3], [4], но его мРНК и экспрессии белка в других тканях не была подтверждена ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга или иммуногистохимии. В этой статье мы во-первых, дали доказательства того, что XB130 мРНК и белок были также конститутивно выраженной в нормальной ткани желудка и относительно более низкую экспрессию в клетках GC. Эти результаты, в отличие от предыдущих докладов, что XB130 мРНК была едва обнаруживаемой в других тканях, за исключением щитовидной железы и селезенки [1], [4], отчасти потому, что они только использовали Нозерн-блот для подтверждения. экспрессия XB130 снижается в опухоли щитовидной железы, но он по-прежнему совершенно неясно, является ли XB130 прогностическим биомаркером других злокачественных опухолей, таких как рак желудка (GC) [2]. Для того, чтобы подтвердить, что XB130 принимает участие в прогрессировании ГХ, мы проанализировали выживаемость или рецидивов у 411 пациентов с GC и отметил, что низкая экспрессия XB130 предсказывали более низкую выживаемость и высокий рецидив. Кроме того, химиотерапевтические чувствительность на основе экспрессии XB130 оценивали в первый раз, и клеточные эксперименты и клинические ретроспективное исследование показало, что понижающая регуляция XB130 увеличивает лекарственной чувствительности к цисплатина и иринотекана и снижает лекарственную чувствительность к 5-фторурацилом.
<Р> С учетом канцерогенность в предыдущих докладах [2], [8], [9], XB130 следует рассматривать как онкогенными, кроме белка опухолевой супрессии, хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить, является ли это также имеет место в GC. Тогда как объяснить клиническую значимость нашего клинического наблюдения, что XB130 деактивация предсказывает низкую общую выживаемость в передовых GC и частоту рецидивов у пациентов, получавших радикальной операции резекции? На самом деле, известно, что канцерогенез может быть результатом изменений множества генов и белков, в то время как XB130, адаптер белка с более чем одной функциональной области, может зависеть от нескольких вверх и вниз по течению факторов. Поэтому слишком рано судить о том, является онкогенными или не только на основе его экспрессии в клинических образцах ген или белок, хотя последний сделал намек некоторые подсказки. На самом деле, понижающая регуляция XB130 в GC можно считать компенсаторно регулировки, так как некоторые опухолевые супрессоры будут мобилизованы, чтобы противостоять XB130 во время прогрессирования ГХ. Аналогичным образом, было сообщено, что экспрессия р53 супрессоров опухолей была в слабо дифференцированной GC выше, чем в хорошо дифференцированных из них [10], в то время как в начале рака желудка с низким уровнем апоптоза, повышенная экспрессия Bcl-2 и р53, более вероятно, содействовать метастазирование [11], [12].
<р> XB130 может быть прото-онкогенов, который сохраняет в нормальной ткани. Такие протоонкогены могут внести свой вклад в поддержание физических функций обновления клеток и миграции вверх в нормальном желудке. Между тем, существует еще один набор генов, регулирующих которые мешают нормальной клетки чрезмерной пролиферации и метаплазии. Однако, как только Микроэкологические баланс неравновесии, пролиферации клеток и метастазирование выходит из-под контроля, следовательно, приводит к канцерогенеза [13]. Эта классическая теория прото-онкогена может дать приемлемое объяснение, почему нормальная ткань с таким выражением высокой XB130 до сих пор остается "здоровым". Известно, что многие гены и сигнальные пути играют про-онкогенные или анти-онкогенные роли на контекстно-зависимой манере, так что это не редкость, что тот же ген может оказывать различное воздействие на различных стадиях или в различных типах тканей развития рака [ ,,,0],14], [15], [16]. В настоящем исследовании, хотя мы не затрагивали функции XB130 в нормальной ткани желудка, эта тема интересна, а также и нуждаются в дальнейших исследованиях
.

Если выражение XB130 модель может служить в качестве суррогатного маркера Predictive химиотерапии ответ, было бы также дать объяснение прогноза. В настоящее время, фторопиримидинов производные на основе и платины комбинированные схемы соединений на основе были приняты в качестве обычной терапии первой линии для GC [17], в то время как иринотекана, топоизомеразы I ингибитор, используется в качестве второй линии терапии [18], и цисплатина в основном используется в лечении передовых, неоперабельной GC [19]. В настоящем исследовании, исследования химиотерапевтического-чувствительности, основываясь на уровне экспрессии XB130 были проведены. В GC клетках, XB130 нокдаун показали лучшую чувствительность к цисплатин и иринотекана, но с меньшей чувствительностью к 5-ФУ. Наши клинические данные показали более короткое общее время выживания в 5-ФУ лечение больных с низкой экспрессией XB130, предполагая, что XB130 деактивация снижает восприимчивость к 5-ФУ, что может быть еще одно объяснение плохим прогнозом у пациентов с низкой экспрессией XB130 в этом исследовании. Наши результаты в клеточной линии GC впутать, что в странах с развитой ШС, большинство из которых являются признакам низкой экспрессии XB130, может больше пользы от цисплатин и иринотекана, кроме 5-ФУ. С учетом гетерогенного геномную фона такие как различные выражения XB130 в GC, то возможно, что некоторые группы населения могли бы извлечь выгоду из иринотекана и /или цисплатин, как это предложено в нашем клеточном эксперименте, и целесообразно для дальнейшего исследования. Дальнейшие перспективные исследования могут определить, можно ли использовать паттерны экспрессии XB130, чтобы помочь стратифицировать пациентов в различные режимы лечения мультимодальных.
<Р> Таким образом, наше настоящее исследование предоставило первое доказательство того, что существование XB130 в желудочном ткани и GC впервые , Мы проверили, что химиотерапевтическое чувствительность оценки базирование на экспрессию XB130 впервые была направлена, показывая, что XB130 пациентов низкая экспрессия может быть чувствительным к цисплатин и иринотекана, но старший доказательств требует. Клинические перспективы данного исследования включает в себя (1) XB130 может выступать в качестве GC прогностического биомаркера для его низкой экспрессии для причастности неблагоприятных исходов; (2) Так как XB130 низкой выраженной GC реагируют на цисплатин и иринотекана превосходит 5-фторурацила в нашем исследовании химиотерапевтического чувствительности, оценка экспрессии XB130 может помочь вести клиническое лечение в GC.

Материалы и методы

пациенты и образцы ткани
<р> Все 411 пациентов были гистологически диагностированы в Nanfang больницы, Южный медицинский университет (Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай) с 2000 по 2011 опухолевой стадии была определена в соответствии с 7-е издание рака AJCC постановка ручные 2010. Образцы для диагностических целей были приняты с согласия от каждого пациента. Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом больницы Nanfang, Южный медицинский университет. Среднее время наблюдения для всех пациентов был 59,5 (95% ДИ: от 55,5 до 63,5) месяцев. Клинические характеристики и XB130 экспрессия всех больных ГХ описаны в таблице 1. Пациенты I-III стадии ГХ проводили радикальную резекцию, а пациенты на стадии IV получили паллиативную операцию.
<Р> До иммуногистохимии анализа, образцы первичных тканей парафином нарезали мкм срезы толщиной 4, и смонтированы на предметных стеклах. Девять пар опухоли и рак смежно нормальных тканей от больных ГХ стадии IV были случайным образом собирали для количественной ПЦР в реальном времени и шесть пар для Вестерн-блот-анализа.

Immunohistochemistry
<р> Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием системы Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) и кролика против XB130 Ab (1:100; Abnove) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Для оценки XB130, секция ткани была отсканирована полностью присвоить баллы. Интенсивность окрашивания оценивали как 0 (отрицательный), 1 (слабый), 2 (средняя) или 3 (сильный). Степень окрашивания оценивали как 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), или 4 (76% -100%), в соответствии с процентным содержанием положительно окрашенных областей по отношению ко всей площади карциномы (или весь раздел для нормальных образцов). Сумма интенсивности окрашивания и степени оценки был использован в качестве окончательной оценки окрашивания (0-7) для XB130. С целью оценки выживаемости, опухолей, имеющих окончательный окрашивающий балл ≥3 считались положительными. XB130 иммунное оценивали независимо друг от друга двумя людьми, слепыми к клиническим параметрам.

Флуоресцентный количественной ПЦР
<р> Общую РНК экстрагировали с использованием тризола набора (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Обратную транскрипцию кДНК затем была получена с iScript ™ Синтез кДНК Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, США) инструкций, а производителя. Все данные РНК были представлены по отношению к гену домашнего хозяйства бета-актина с использованием метода ΔΔCt. Рутинное ПЦР проводили также для изучения экспрессии XB130 в другом органе человека и мыши (последовательностей праймера в таблице S1).

Западная
блоттинга <р> Ткани дважды промывали холодным фосфатно-буферным солевым раствором ( PBS), и лизируют с белком буфера для лизиса в течение 30 мин. Проводили центрифугирование, и белок-содержащий супернатант сохраняется. Белковые лизаты были разделены electrophorectically на 10% SDS-полиакриламидном геле и переносили на мембраны поливинилиденфторида (Immobilon P, Millipore, Бедфорд, штат Массачусетс). Затем иммуноблоттинг проводили с использованием кроличьих анти-XB130 антитела (PradoWalnut, CA, USA) и бета-актина (Santa Cruz, CA). Иммунореактивного полосы визуализировали методом усиленной хемилюминесценции (Amersham) с западной промокательной системой обнаружения (Kodak Digital Science, Рочестер, штат Нью-Йорк, США) и количественно определяли с помощью программного обеспечения Image QuantityOne v4.6.2.

Культура клеток <бр>

клетки из клеточной линии SGC7901 культивировали в полной среде [Roswell институт Мемориальный парк (RPMI) 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Hyclone)]. Стабильно трансфицированные клетки поддерживали в среде с наличием пуромицин (Sigma-Aldrich). Клетки инкубировали при 5% CO <югу> 2 при 37 ° C.

Стабильно трансфецированные клеточные линии, установление
<р> три различные последовательности shRNA из XB130 были клонированы в pSuper-Rretro-пуромицин плазмиды фермента рестрикции Bgl II, Hind III (New England Biolabs) и ДНК-лигазы Т4 (Takara). Оба были построены pSuper-Rretro-Puro-shXB130 и pSuper-Rretro-Пуро. pSuper-Rretro-пуромицин-shXB130 в сочетании с вектором плазмиды упаковки или скремблирования вектора в качестве отрицательного контроля были упакованы в вирус с использованием метода фосфата кальция. SGC7901 клетки трансфицируют shRNA плазмид с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), повторяется три раза. Клетки культивировали, как упоминалось выше, и отдельные колонии были выбраны Вестерн-блоттинга и флуоресцентной количественной ПЦР и использовали для дальнейших экспериментов. Три shRNA ориентации XB130 и один скремблирования были разработаны (Таблица S2). Оба мРНК и экспрессию белка XB130 (праймера в таблице S1, приводит к экспрессии на рисунке S1A, Б) были подтверждены ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга. Эффективность аденовируса инфекция проявилась на рисунке S1C и D.

Жизнеспособность клеток анализ
<р> трипсином и высевали на 96-луночные планшеты при начальной плотности 0,2 × 10 ^{4 /лунку, клетки культивируют и наблюдали в 1, 3, 5 и 7-й день. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа метил thiazolyltetrazolium (МТТ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Оптическую плотность измеряли при 570 нм, с 655 нм в качестве стандартной длины волны. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.}

Оценка химиотерапевтические чувствительности в GC клетки
<р> Клетки контроля дикого типа и ш-XB130 культивировали в среде с 5-фторурацилом (5-FU), цисплатин или иринотекана различными концентрациями. Через сорок восемь часов спустя, жизнеспособность клеток оценивали.

Статистический анализ
<р> Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM или медианы. были использованы тест хи-квадрат для категориальных переменных и Т-критерия Стьюдента для непрерывных переменных. Выживание и рецидивов ставки рассчитывались по методу Каплана-Мейера. Статистическая значимость была принята в значения менее 0,05 р
.

Поддержка Информация рис S1
.
Валидация гена глушителей эффекта малых шпилька РНК из XB130 (SH-XB130) и инфекционный эффективности аденовируса. XB130 подавляются клетки модели линии были подтверждены ПЦР в реальном времени (а) и Вестерн-блот (б). Клетки, трансфицированные с помощью скремблирования вектором служил в качестве отрицательного контроля и не-трансфицировали Мок в качестве контроля. Инфекционный эффективность аденовируса в 293FT культивируемых клетках было подтверждено нормальным (с) и флуоресценции (г) микроскопии. Врезка в А усиление кривая ПЦР в реальном времени
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0041660.s001
(РРТ)
таблице S1.
Последовательности праймеров в режиме реального времени или обычной ПЦР
DOI: 10.1371. /journal.pone.0041660.s002
(DOC)
Таблица S2.
XB130 Sh-последовательности РНК
DOI: 10.1371. /journal.pone.0041660.s003
(DOC)

• PLoS ONE: аденовируса Поставка Emx2 генов подавляет рост в человека рака желудка
• PLoS ONE: дивергенция Тенденции последних населения на основе выживаемости в пищеводных и желудочных рака