PLoS ONE: Silencing van XB130 wordt geassocieerd met zowel de prognose en chemosensitivity van Gastric Cancer

Abstract

XB130 is een nieuw kenmerk adapter eiwit dat werd gemeld aan de schildklier tumorgroei te bevorderen, maar zijn rol in de progressie van andere vormen van kanker zoals maagkanker (GC) is niet bekend. Daarom onderzochten we het verband tussen XB130 expressie en de prognose van patiënten GC. De proefpersonen waren 411 patiënten met GC klasse I tot IV. XB130 expressie werd in chirurgische exemplaren van GC onderzocht. Kaplan-Meier-analyse en Cox proportional hazards model werd gebruikt om de prognostische betekenis van XB130 op overleving en herhaling bepalen. Bovendien GC cellen stabiel getransfecteerd met XB130 short hairpin RNA werden vastgesteld om het effect van XB130 de gevoeligheid van chemotherapie te analyseren. De resultaten tonen aan dat zowel XB130 mRNA en eiwitexpressie waren detecteerbaar in normale gastrische weefsels. De totale overlevingstijd van stadium IV patiënten en het ziektevrije periode na radicale resectie van GC in fase I-III patiënten waren significant korter als immunohistochemische kleuring voor XB130 laag was dan toen kleuring werd hoog (beide p
<0,05). XB130 uitdrukking voorspelde ook tumor gevoeligheid voor verschillende chemotherapie agenten. Levensvatbaarheid van zowel XB130 geruisloze SGC7901 cellen en wild-type cellen werd onderdrukt door 5-fluorouracil (5-FU), cisplatin en irinotecan in een dosis-afhankelijke manier, maar cisplatin en irinotecan waren gevoeliger tegen sXB130 geruisloze GC cellen en 5-FU vertoonden hogere gevoeligheid voor wildtype cellen. Wanneer behandeld met 5-FU, patiënten met een hoge expressie van XB130 tumoren hadden een hogere overlevingskans dan die met een lage expressie tumoren. Deze bevindingen geven aan dat gereduceerde XB130 eiwitexpressie is een prognostische biomarker voor kortere overleving en een hogere recidief bij patiënten met GC, en de respons op chemotherapie

Citation:. Shi M, W Huang, Lin L Zheng D, Q Zuo, Wang L, et al. (2012) Silencing van XB130 wordt geassocieerd met zowel de prognose en chemosensitivity van maagkanker. PLoS ONE 7 (8): e41660. doi: 10.1371 /journal.pone.0041660

Editor: Zilong Wen, Hong Kong University of Science and Technology, China

Ontvangen: 31 maart 2012; Aanvaard: 24 juni 2012; Gepubliceerd: 23 augustus 2012

Copyright: © Shi et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Programma op Key Basic Research Project (2012CB945100, naar WL en YL), het Team Programma van Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (S2011030003134, naar WL en YL). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

oncogenen en anti-oncogenen een cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van maagkanker (GC), en genetische heterogeniteit is bewezen dat de prognose aanzienlijk beïnvloeden. Daarom jacht naar nieuwe genen en eiwitten met potentiële waarde als diagnostische of prognostische instrumenten belangrijk en targeting nieuwe oncogenen is een veelbelovende benadering voor kankertherapie.

XB130 is een onlangs geïdentificeerde adaptor eiwit dat sterk tot expressie wordt gebracht in de milt en schildklier van personen, terwijl het zwakke expressie toont in de nieren, hersenen, longen en pancreas [1]. XB130 is aangetroffen in folliculaire en papillair schildkliercarcinoom, alsook in menselijke long carcinoma cellijnen [2]. Hoewel de expressie werd verminderd schildkliercarcinoom werd XB130 bleek een tumor promoter [2]. Vermeld is dat XB130 niet alleen een rol bij celproliferatie, overleving, beweeglijkheid, invasie en [2], [3], [4], maar is ook betrokken bij signaaltransductie [1]. XB130 wordt gereguleerd door Rac en het cytoskelet [3], en is betrokken bij de activering van c-Src [1] en fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) /Akt pathway [4], die op zijn beurt geregeld cytoskelet functie [3]. Deze signaalwegen hebben ook aangetoond dat een essentiële rol in de ontwikkeling en progressie van GC hebben [5], [6], [7]. Derhalve zou er een rol XB130 GC ook. Er is echter geen onderzoek gedaan naar deze nieuw gevonden adapter eiwit is gedaan op het gebied van gastro-enterologie tot nu toe. In deze studie hebben we de hypothese dat XB130 expressie zou kunnen worden geassocieerd met de overleving en /of tumor recidief alsook met de chemosensitivity van GC.

Resultaten

XB130 expressie in normale maag weefsels en GC

in tegenstelling tot eerdere verslagen, bevestigden we dat XB130 constitutief tot expressie wordt gebracht in normale weefsels van de menselijke lever, dikke darm, milt en maag (figuur 1a). Immunohistochemie werd uitgevoerd om XB130 expressie in alle 411 paren van in paraffine ingebedde secties van GC en de naburige niet-tumorweefsels evalueren. We vonden dat XB130 voornamelijk tot expressie werd gebracht in cytoplasma in normaal maagweefsel, zeer aanzienlijk was downgereguleerd in de weefsels van GC. Verder hebben we de GC onderverdeeld in XB130 positieven (hoge expressie met score ≥3) en negatieven (lage expressie met score < 3) door de kleuring scores (figuur 1b). Incidentie van XB130 positieven en negatieven in fase I-III GC waren geen verschil, maar het gedeelte van XB130 negatieve was hoger in fase IV en in de post-operatie recidief groepen (figuur 1c). Gekwantificeerde mRNA niveau van XB130 werd ontdekt in fase IV palliatieve resectie monsters en een aanzienlijk verlaagde in geavanceerde GC (figuur 1d). Op dezelfde manier werd gereduceerd eiwit expressie van XB130 in geavanceerde GC ook geverifieerd door western blot (Figuur 1e).

Lage expressie van XB130 is gecorreleerd met een slechte prognose

In de analyse van de totale 411 gevallen van GC stadium I-IV, cumulatieve overleving van patiënten met XB130 negatieve kleuring was significant lager dan die met positieve kleuring (Figuur 2a). Bij patiënten met stadium IV GC die de operatie genezing gemiste kans, bleek significant lagere overlevingskans in XB130 negatieve groep (Figuur 2b). Mediane totale overlevingstijd van de patiënten in een vergevorderd stadium was langer in XB130 positieve groep dan in de negatieve groep (16,7 versus 8,5 maanden, HR negatieve groep was 1,72, p = 0,011; tabel 1). Bij patiënten in stadium I-III GC die radicale resectie operatie ontvangen, de ziektevrije overleving in XB130 positieve groep was hoger dan de negatieve groep (p < 0,05; figuur 2c), terwijl de mediane tijd tot herhaling was 36 en 24 maanden in positieve en negatieve groepen, respectievelijk (Tabel 1, HR negatieve patiënten was 1,2, p = 0,022). Deze bevindingen wijzen erop dat lage expressie van XB130 wordt geassocieerd met een kortere overleving en een hogere recidief bij GC patiënten.

prognostische waarde van andere clinicopathologische parameters

De invloed van andere clinicopathologische parameters op overall overleving en ziekte- overlevingspercentage werd vermeld in tabel 1 en figuur 3. Naast XB130 resultaten van Kaplan-Meier functieanalyse bij patiënten met stadium IV gegroepeerd op bekende factoren zoals carcino-antigeen (CEA) concentratie differentiële graden, metastase , ascites en chemotherapie vertoonden een significante invloed op de cumulatieve overleving (Figuur 3 a-e). In een univariate Cox regressieanalyse patiënten kregen therapie groep noteerden we dat stadium was ook een significante prognostische factor voor herhaling (tabel 1).

In een multivariate analyse met Cox-model, we vastgesteld dat XB130, CEA, chemotherapie en ascites (alle p < 0,01) waren onafhankelijke factoren HR voor overlijden bij patiënten te voorspellen bij stadium IV, terwijl XB130 (p = 0,044) en de fase (p < 0,000) waren onafhankelijke factoren HR voor herhaling voorspellen na radicale resectie van GC bij patiënten met een stadium I-III (tabel 2).

chemotherapeuticum gevoeligheid in reactie op XB130 zwijgen

om te weten te komen de therapeutische mogelijkheden in te richten XB130, onderzochten we levensvatbaarheid van de cellen van sch- XB130 reactie op 5-FU, irinotecan en cisplatine. De cellevensvatbaarheid in sh-XB130 en wildtype groepen zowel onderdrukt door alle drie chemotherapeutica op een dosis afhankelijke manier. Respectievelijk vergelijken met sh-XB130 wildtype controle bleek gevoeliger voor 5-FU gemanifesteerd door een significant lagere levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 4a), terwijl cisplatine (figuur 4b) en irinotecan (figuur 4c) werden aangetoond effectiever te zijn sch- XB130 groep dan in wild-type controle.

Survival analyse in GC patiënten die 5-FU therapie

Gesorteerd op XB130 negatieve en positieve, we geëvalueerd 5-FU therapie in het stadium IV GC patiënten in een retrospectieve studie. Behandeld met 5-FU, patiënten met XB130 positieve kleuring genoot een hogere overlevingskans dan de negatieve groep (figuur 4d). Dienovereenkomstig, XB130 positieven met 5-FU therapie had de langere mediane totale overlevingstijd (figuur 4d). Omdat er weinig patiënten behandeld met cisplatine of irinotecan waren, werden de invloed van XB130 expressie niveau van de klinische therapeutische effecten niet vergeleken in dit onderzoek.

Discussie

XB130 is een recent gekloond 130 kDa-adapter eiwit en is gerapporteerd voornamelijk tot expressie in de schildklier en de milt weefsels bevestigd door Northern blot en speelt een multifunctionele rol in celoverleving, proliferatie, invasie in schildklier tumor [2], [3], [4], maar het mRNA en eiwitexpressie in andere weefsels werd niet bevestigd door real-time PCR, western blot en immunohistochemie. In dit artikel hebben we in de eerste plaats gaf aanwijzingen dat XB130 mRNA en eiwit werden ook constitutief uitgedrukt in normale maag weefsel en relatief lagere expressie in GC cellen. Deze bevindingen zijn in tegenstelling tot eerdere rapporten die XB130 mRNA nauwelijks detecteerbaar in andere weefsels behalve schildklier en milt [1], [4], mede omdat ze alleen gebruikt Northern blot ter bevestiging. XB130 expressie wordt verlaagd schildklier tumor, maar blijft volledig onduidelijk of XB130 een prognostische biomarker van andere maligne tumoren zoals maagkanker (GC) [2]. Om te bevestigen dat XB130 neemt deel aan de GC progressie, hadden we survival of opnieuw geanalyseerd 411 patiënten met GC en merkte op dat de XB130 lage expressie voorspelde een lagere overleving en hogere herhaling. Bovendien Chemotherapeutische gevoeligheid baseren op XB130 expressie werd geëvalueerd voor de eerste keer, en cellulaire experimenten en klinische retrospectieve studie bleek dat downregulatie van XB130 verhoogt geneesmiddelgevoeligheid cisplatin en irinotecan en vermindert drug gevoeligheid voor 5-fluorouracil.

Aangezien carcinogeniteit in eerdere rapporten [2], [8], [9], XB130 moet worden beschouwd als een oncogeen zijnde een tumor-onderdrukkend eiwit, hoewel verder onderzoek nodig om te testen of het ook in GC. Dan, hoe de klinische betekenis van onze klinische observatie dat XB130 downregulatie voorspelt een lage totale overleving in geavanceerde GC en een hogere kans op herhaling bij patiënten behandeld door radicale resectie operatie uit te leggen? In feite is het bekend dat tumorigenese kan het gevolg zijn van veranderingen van meerdere genen en eiwitten, terwijl XB130 de adapter eiwit met meer dan één functioneel domein, kan worden beïnvloed door meerdere upstream en downstream factoren. Daarom is het te vroeg om te beoordelen of een gen of een eiwit of oncogene niet alleen baseren op de expressie in klinische monsters, hoewel deze wel enkele aanwijzingen duiden. Eigenlijk kan downregulatie van XB130 in GC worden beschouwd als een compenserende aanpassing, omdat sommige tumor suppressors zou worden ingezet om XB130 weerstaan ​​tijdens de progressie van GC. Ook werd gemeld dat de tumor suppressor p53-expressie was hoger in slecht gedifferentieerde GC dan in goed gedifferentieerde degenen [10], terwijl vroege maagkanker met lage niveaus van apoptose, toegenomen expressie van Bcl-2 en p53 was waarschijnlijker metastase [11] bevorderen, [12].

XB130 kan een proto-oncogen, die werd bewaard in normaal weefsel. Dergelijke proto-oncogenen kan bijdragen aan de fysieke functies van de celvernieuwing en daarboven migratie te handhaven in de normale maag. Ondertussen is er een andere set van de regulering van genen die de normale cel over-proliferatie en metaplasie voorkomen. Echter, zodra de probiotica balans disequilibrated, celproliferatie en metastase is uit de hand, dus wat leidt tot het ontstaan ​​van kanker [13]. Dit klassieke theorie van de proto-oncogen kan een aanvaardbare verklaring geven waarom normaal weefsel met zulke hoge XB130 expressie nog steeds "gezond". Het is bekend dat vele genen en signaalwegen spelen pro-oncogene of anti-oncogene rol van de context-afhankelijke manier, dus het is niet ongewoon dat hetzelfde gen ander effect in verschillende stadia of in verschillende weefseltypen van kankerontwikkeling [kunnen uitoefenen ,,,0],14], [15], [16]. In de huidige studie, hoewel we hier niet ingaan op de functies van XB130 in normale maag weefsel, dit onderwerp is interessant als goed en moeten verder onderzoek.

Als XB130 expressie patroon kan dienen als een surrogaat marker voorspellende van de chemotherapie reactie, zou ook een verklaring voor de prognose. Op dit moment, fluoropyrimidinederivaten-gebaseerde en platina-verbinding op basis van combinatie regimes zijn als conventionele eerstelijns behandeling bij GC [17] aanvaard, terwijl irinotecan, een topoisomerase I-remmer, wordt gebruikt als de tweede lijns behandeling [18], en cisplatine heeft grotendeels gebruikt bij de behandeling van gevorderd, unresectable GC [19]. In het huidige onderzoek, chemotherapeutische gevoeligheid studies baseren op XB130 expressie niveau werden uitgevoerd. In GC cellen, XB130 knock-down aangegeven beter inspelen op cisplatine en irinotecan, maar met minder gevoeligheid voor 5-FU. Onze klinische gegevens toonden een kortere totale overleving in 5-FU-behandelde patiënten met lage expressie van XB130 suggereert dat XB130 downregulatie vermindert de respons op 5-FU, die een andere verklaring voor de slechte prognose bij patiënten met lage expressie van XB130 kan in dit onderzoek. Onze bevindingen met GC cellijn impliceren dat geavanceerde GCs, waarvan de meeste worden gekenmerkt door XB130 lage expressie kunnen meer profiteren van cisplatin en irinotecan behalve 5-FU. Gezien de heterogene achtergrond genoom zoals de verschillende expressie van XB130 in GC, is het mogelijk dat sommige populaties kunnen profiteren van irinotecan en /of cisplatin als in onze cellulair experiment voorgesteld, en is nuttig voor verder onderzoek. Verdere prospectieve onderzoeken kunnen bepalen of XB130 expressiepatronen kunnen worden gebruikt om patiënten te helpen stratify in verschillende multimodale behandelingen.

Samenvattend onze studie heeft ontvangen eerste bewijs dat XB130 bestaan ​​maagweefsel en GC voor het eerst . We geverifieerd dat chemotherapeutische gevoeligheid evaluatie te baseren op XB130 expressie in de eerste plaats was gericht, wat aangeeft dat XB130 lage expressie patiënten gevoelig voor cisplatine en irinotecan zou kunnen zijn, maar toch senior bewijs vereist. De klinische prospectieve van deze studie omvat (1) XB130 kunnen optreden als GC prognostische biomarker voor de lage expressie impliceert voor ongunstige uitkomsten; (2) Aangezien XB130 lage expressie GC reageren op cisplatin en irinotecan beter dan 5-fluorouracil in onze chemotherapeutische gevoeligheidsanalyse kan beoordeling van XB130 expressie leidraad klinische medicatie GC.

Materialen en Werkwijzen

patiënten en weefselmonsters

Alle 411 patiënten werden histologisch gediagnosticeerd in Nanfang ziekenhuis, Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, China) van 2000 tot 2011. Tumor stadium werd gedefinieerd op basis van de 7e editie van de AJCC kanker enscenering handleiding 2010. Monsters voor diagnostische doeleinden werden genomen met de toestemming van elke patiënt. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanfang ziekenhuis, Southern Medical University. De gemiddelde follow-up tijd voor alle patiënten was 59,5 (95% BI: 55,5-63,5) maanden. De klinische kenmerken en XB130 expressie van GC de patiënten worden beschreven in Tabel 1. Patiënten I-III fase GC uitgevoerd radicale resectie, terwijl patiënten met stadium IV ontvangen palliatieve werking.

Voorafgaand aan analyse werd de immunohistochemie paraffine ingebedde primaire weefselmonsters werden gesneden in 4 urn dikke secties en gemonteerd op glasplaatjes. Negen paren van de tumor en kanker-aangrenzende normale weefsels van fase IV GC patiënten werden willekeurig verzameld voor kwantitatieve real-time PCR en zes paren voor western blot analyse.

Immunohistochemie

Immunohistochemische kleuring is uitgevoerd met het Dako Envision System (Dako, Carpinteria, CA) en konijn anti-XB130 Ab (1:100; Abnove) volgens aanbevolen protocol van de fabrikant. Voor XB130 evaluatie, werd het gedeelte weefsel volledig gescand om de scores toe te wijzen. De kleuring intensiteit werd gescoord als 0 (negatief), 1 (zwak), 2 (gemiddeld), of 3 (sterk). De mate van kleuring werd gescoord als 0 (0%) 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) of 4 (76% -100%), volgens de percentages van positief gekleurde gebieden met betrekking tot het hele gebied carcinoom (of volledige sectie normale monsters). De som van de kleurintensiteit en de omvang scores werd als de uiteindelijke kleuring scores (0-7) voor XB130. Voor het doel van de overleving evaluatie, werden tumoren met een finale kleuring score van ≥3 als positief beschouwd. XB130 immunokleuring werd onafhankelijk beoordeeld door twee personen blind voor de klinische parameters.

Fluorescence kwantitatieve PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol-kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reverse transcriptie van cDNA werd vervolgens verkregen met iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) zijn volgens de voorschriften van de fabrikant. Alle RNA gegevens werden gepresenteerd met betrekking tot de huishoudgen β-actine met de ΔΔCt methode. Routine PCR werd ook uitgevoerd om de expressie XB130 in verschillende organen van mens en muis (primer sequenties in tabel S1) onderzoekt.

Western blotting

De weefsels werden tweemaal met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing gewassen ( PBS) en gelyseerd met lysisbuffer eiwit gedurende 30 min. Centrifugeren werd uitgevoerd en eiwitbevattende supernatant werd behouden. Het eiwit lysaten werden electrophorectically op 10% SDS-polyacrylamidegel gescheiden en overgebracht op polyvinylideenfluoride membranen (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA). Vervolgens werd immunoblotting uitgevoerd met konijnen anti-XB130 antilichaam (PradoWalnut, CA, USA) en β-actine (Santa Cruz, CA). Immunoreactieve banden werden zichtbaar gemaakt door de methode van de versterkte chemiluminescentie (Amersham) met een Western blotting detectiesysteem (Kodak Digital Science, Rochester, NY, USA) en werden gekwantificeerd door Image software QuantityOne v4.6.2.

Celkweek

cellen uit SGC7901 cellijn werden gekweekt in compleet medium [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) met 10% foetaal runderserum (FBS) (Hyclone)]. Stabiel getransfecteerde cellen werden in medium gehouden met de aanwezigheid van puromycine (Sigma-Aldrich). Cellen werden geïncubeerd bij 5% CO _{2 bij 37 ° C.}

Stabiel getransfecteerde cellijnen inrichting

Drie verschillende shRNA sequenties van XB130 werden gekloneerd in pSUPER-Rretro-puromycine plasmide met restrictie-enzym BglII, HindIII (New England Biolabs) en T4 DNA-ligase (Takara). Beide pSUPER-Rretro-puro-shXB130 en pSUPER-Rretro-puro werden gebouwd. pSUPER-Rretro-puromycine-shXB130 gecombineerd met verpakking plasmidevector of scramble vector als negatieve controle in het virus werden gepakt met behulp van de calciumfosfaat methode. SGC7901 cellen werden getransfecteerd met shRNA plasmiden met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), driemaal herhaald. De cellen werden gekweekt zoals hierboven vermeld, en afzonderlijke kolonies werden door middel van Western blotting en fluorescentie kwantitatieve PCR gekozen en gebruikt voor verdere experimenten. Drie shRNA targeting XB130 en één scramble werden ontworpen (tabel S2). Zowel mRNA en eiwitexpressie van XB130 (primersequentie in tabel S1, expressie resulteert in figuur S1 A, B) werden bevestigd door real-time PCR en Western blot. Adenovirus infectie-efficiëntie werd toonde in figuur S1C en D.

Cel levensvatbaarheid

getrypsiniseerd en gezaaid op 96-well platen met initiële dichtheid van 0,2 x 10 ^{4 /putje werden cellen gekweekt en waargenomen bij 1, 3, 5 en 7 dagen. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door methyl thiazolyltetrazolium (MTT) bepaling volgens de instructies van de fabrikant. De absorptie werd gemeten bij 570 nm met 655 nm als referentie golflengte. Alle experimenten werden uitgevoerd in triplo.}

chemotherapeuticum gevoeligheid evaluatie GC cellen

De cellen van wildtype controle en sh-XB130 werden gekweekt in het medium met 5-fluorouracil (5-FU), cisplatine of irinotecan door verschillende concentraties. Achtenveertig uur later werd de cellevensvatbaarheid geëvalueerd.

Statistische analyse

De resultaten worden als het gemiddelde ± SEM of de mediaan. De chi-kwadraat test voor categorische variabelen en t-toets voor continue variabelen werden gebruikt. Overleving en herhaling werden berekend volgens de Kaplan-Meier-methode. Statistische significantie werd op een p
waarde van minder dan 0,05 aanvaard.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
Validatie van de gene silencing effect van kleine haarspeld RNA's van XB130 (sh-XB130) en de efficiëntie van infectieuze adenovirus. XB130 downregulated cellen lijn modellen werden bevestigd door real-time PCR (a) en Western blot (b). Getransfecteerd door scramble vector diende als negatieve controle en ongetransfecteerde MOCK als controle. De efficiëntie van infectieuze adenovirus 293FT gekweekte cellen werd bevestigd door normale (c) en fluorescentie (d) microscopie. Inzet in A is de versterking curve van real-time PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s001
(PPT)
Tabel S1.
Primer sequenties voor real-time of routine PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s002
(DOC)
tabel S2.
XB130 Sh-RNA-sequenties
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041660.s003
(DOC)

• PLoS ONE: Adenovirale levering van de EMX2 Gene onderdrukt groei in Human MaagKanker
• PLoS ONE: uiteenlopende trends in recente basis van de bevolking Survival tarieven in Esophageal en MaagKanker