PLOS ONE: PFTK1 Promove câncer gástrico Progressão pela regulação da proliferação, migração e Invasion

Abstract

PFTK1, também conhecido como PFTAIRE1, CDK14, é um novo membro proteínas quinases serina /treonina-relacionados Cdc2. Estudos recentes mostram que PFTK1 é altamente expresso em vários tumores malignos, tais como o carcinoma hepatocelular, o cancro esofágico, o cancro da mama, e envolvida na regulação do ciclo celular, os tumores de proliferação, migração e invasão que influenciar ainda mais o prognóstico de tumores. No entanto, a expressão e a significância fisiológica de PFTK1 no cancro gástrico permanecem obscuros. Neste estudo, analisamos a expressão e significado clínico PFTK1 por Western blot em 8 emparelhado tecidos frescos câncer gástrico, os tecidos da mucosa gástrica não tumorais, e imuno-histoquímica em 161 fatias paraffinembedded. expressão alta PFTK1 foi correlacionado com o grau do tumor, invasão linfonodal, bem como Ki-67. Por meio de contagem celular Kit (CCK) -8 ensaio, citometria de fluxo, ensaios de formação de colónias, cicatrização de feridas e Transwell, os estudos in vitro demonstraram que a sobre-expressão PFTK1 promoveu a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico, enquanto PFTK1 knockdown conduziu aos resultados opostos. Nossas descobertas pela primeira vez suporte que PFTK1 pode desempenhar um papel importante na regulação da proliferação gástrica câncer, migração e proporcionaria uma nova estratégia terapêutica promissora contra o cancro gástrico humano

Citation:. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J., Wang Q, et ai. (2015) PFTK1 Promove câncer gástrico Progressão pela regulação da proliferação, migração e invasão. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10.1371 /journal.pone.0140451

editor: Keping Xie, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, United States |

Recebido: 07 de maio de 2015; Aceito: 25 de setembro de 2015; Publicação: 21 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de Ciência Natural da China (No. 81.302.285, No. 81.402.015)

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que existem interesses não há concorrentes.

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tumor maligno mais comum ea segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todos os tipos de cânceres em todo o mundo [1]. É difícil de curar, a menos que se encontra numa fase precoce [2]. Devido à falta de especificidade, taxa de diagnóstico precoce é baixa ea maioria dos pacientes com câncer gástrico estão em fase de meia-tarde quando o diagnóstico. 40% -60% dos pacientes com câncer gástrico recebeu operação radical câncer gástrico, muitas vezes, têm recidiva pós-operatória e metástases, estas características afetam seriamente a sobrevivência a longo prazo em pacientes com câncer gástrico [3,4]. Apesar do grande avanço do novo diagnóstico e estratégias de tratamento do câncer gástrico, os mecanismos moleculares exatos de câncer gástrico permanece pouco entender. Assim, a identificação dos mecanismos moleculares durante a progressão do cancro gástrico e metástase pode oferecer aos pacientes com novas estratégias de diagnóstico e terapêuticas.

PFTK1 (também conhecido como PFTAIRE1, CDK14) é um novo membro relacionado Cdc2-serina /treonina proteínas quinases que é identificado pela primeira vez no sistema nervoso do rato e é um regulador crucial de ciclinas e ciclo celular [5,6]. Poucos estudos têm sido realizados para caracterizar a sua função fisiológica ou importância biológica. É relatado que PFTK1 é altamente expresso no cérebro, pâncreas, rim, ovário e. CDKs ligam a caixa de ciclina específico para formar complexos de proteína-quinase funcionais e regulada em parte pela sua localização subcelular [7]. Por exemplo, a ciclina Y, um romance ciclina associada à membrana, interage com PFTK1 aumenta a actividade de cinase e recruta PFTK1 PFTK1 para a membrana do plasma [8]. PFTK1 interage com ciclina B2 co-localização no núcleo em carcinoma hepatocelular [9]. A função fundamental da PFTK1 é relatado como uma cinase dependente de ciclina (CDK) que regula a progressão do ciclo celular e a proliferação das células interagindo especificamente com membros de proteínas de ciclina, tais como ciclina D3 (CCND3), ciclina Y (CCNY) e forma um complexo ternário com p21 inibidor do ciclo celular, fosforila o, assim, Rb supressora de tumor para G1 /S de transição [10]. KO Ciclina Y em linhas de células de glioma faz com que o ciclo celular bloqueada no período S [11]. Ciclina Y interage com PFTK1 ajustar M fase da mitose [12]. Estes resultados implicam que em conjunto PFTK1 pode funcionar como um promotor do tumor através de regulação do ciclo celular. Por outro lado, diversos estudos demonstraram que PFTK1 também tem outras funções importantes. PFTK1 modula a diferenciação de oligodendrócitos via PI3K /AKT [13]. Recentemente PFTK1 confere motilidade celular HCC através de inactivação da função supressora móveis se liga à actina de TAGLN2 via fosforilação [14]. PFTK1 mediada por fosforilação permite associação de CAD para filamentos de actina F, resultando no aumento da polimerização das fibras de stress de actina, promovendo, assim, a migração celular e invasão de células de carcinoma hepatocelular [15,16]. Superexpressão de PFTK1 pode conferir um fenótipo móveis em hepatócitos malignas [9]. De acordo com os achados moleculares, CCNY e /ou PFTK1 só pode ativar a sinalização de Wnt não-canônico para melhorar a motilidade celular em células de carcinoma hepatocelular [17]. Todos estes estudos implicam que PFTK1 podem estar envolvidos na proliferação celular e motilidade, no entanto a expressão ea importância dos PFTK1 em células de câncer gástrico ainda são obscuros.

Em nosso estudo, teve como objetivo realizar uma análise abrangente de expressão PFTK1 e seu papel prognóstico em células cancerosas gástricas. Foi examinada a expressão de PFTK1 e sua associação com características clínicas e Ki-67 por Western blot e imunohistoquímica (IHC). O nosso estudo mostrou que PFTK1 promoveu a proliferação, migração e invasão de células gástricas cancerosas por CCK-8, análises de citometria de fluxo, analisa a formação de colónias, Transwell ensaio, afectadas a expressão de proteínas relacionadas. Estas descobertas foram primeiramente relatada em células cancerosas gástricas e pode proporcionar uma nova visão sobre o desenvolvimento de terapias experimentais no câncer gástrico.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

Cento e sessenta -um amostras de tecido de câncer gástrico e combinados tecidos noncancer adjacentes foram selecionados de pacientes submetidos a cirurgia entre 2007 e 2013 no Departamento de Patologia, Hospital Tumor Nantong. Estes tecidos foram armazenados a -80 ° C imediatamente após a remoção cirúrgica. Para exame histológico, todas as amostras de tecido gástrico foram fixados em formalina a 10% tamponada e embebidos em parafina para seccionamento. espécimes ressecados foram classificados de acordo com a sétima edição da Classificação TNM para o cancro gástrico [1] .Todos as informações clínico-patológico incluíram idade, sexo, profundidade de infiltração, estado de diferenciação, invasão linfonodal, invasão do nervo e estágio TNM. A aprovação de tecidos removidos para fins de investigação foi obtida a partir da Comissão de Ética de Nantong Hospital Tumor. consentimento informado assinado também foi obtido a partir de cada paciente. As principais variáveis ​​clínicas e patológicas foram resumidos na tabela 1.

Western blot análise

ensaio Western blot foi utilizada para detectar algumas proteínas [18-20]. Em primeiro lugar, os tecidos Caner gástricas e as células foram rompido em tampão de lise (1 M Tris-HCl pH 7,5, 1% de Triton X-100, 10% de sulfato de sódio (SDS), 1% de NP-40, 0,5 M de EDTA, 0,5% de sódio desoxicolato, 10 ug /mL de aprotinina, PMSF 1 mM, 10 ug /mL de leupeptina) e depois centrifugados a 10000 × g durante 30 min para recolher o sobrenadante. O sobrenadante foi diluído em tampão de carregamento 2 x SDS e fervida. Uma quantidade equivalente de proteínas a partir de cada amostra foram sujeitos a electroforese em 10% de dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida transferida para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) de membrana (Millipore, Bedford, MA). Depois disso, as membranas foram bloqueadas durante cerca de 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários. Após lavagem com tampão fosfato salino (PBS) contendo 0,1% de Tween 20, três vezes, cada uma durante 5 minutos, as membranas foram então incubadas com IgG-peroxidase de rábano ligada como anticorpo secundário durante mais 2 h à temperatura ambiente. As membranas foram então desenvolvidos utilizando os sistemas de detecção de ECL (Imaging Technology, Ontário, Canadá). Os anticorpos utilizados neste estudo incluíram: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-Ciclina E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1.000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenina (1: 1.000, Santa Cruz Biotechnology), anti-DVL1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

imuno-histoquímica analisa

em resumo, cortes de tecido foram desparafinados em xilol e reidratados através etanóis classificados. Em seguida, extinguiu-se as secções em 3% de peróxido de metanol durante cerca de 10 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena. Por alta pressão e a temperatura no autoclave, a sua imunorreactividade foi aumentada em tampão de citrato 0,1 M, durante 3 minutos. As secções de tecido foram incubadas com o anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) e anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) durante 120 min à temperatura ambiente. De acordo com as instruções do fabricante, Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS), os tecidos foram incubados com rábano polímero de Ig anti-ratinho conjugado com peroxidase como um segundo anticorpo (kit Envision, Dako) durante 20 min à temperatura ambiente. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado na montanha de resina. Para quantificar PFTK1 e Ki-67 de expressão de proteínas, tanto a extensão da imunorreactividade e a intensidade foram avaliadas e pontuadas. Cinco campos de alta potência foram escolhidos aleatoriamente para cada seção e pelo menos 300 células foram contadas por campo. Para análise estatística dos PFTK1, cada lâmina foi avaliada utilizando um sistema de pontuação semiquantitativo tanto para a intensidade da mancha e a percentagem de células positivas malignas. As células foram pontuadas como se segue: 1 (células de tumor coradas ≤25%), 2 (26% de células de tumor coradas -50%), 3 (51% de células de tumor coradas -75%), 4 (76% de células tumorais -100% manchado). Para a avaliação da densidade: 1 coloração fraca; 2 coloração moderada; 3 coloração forte. Em seguida, multiplicou as duas pontuações e classificados em dois grupos: baixa expressão e de alta expressão. Quanto à análise estatística de Ki-67, < 50% de células tumorais coradas um preço tão baixo expressão e ≥ 50% de células tumorais coradas tão elevada expressão. A fim de evitar erros técnicos, a coloração foi repetido três vezes e foram obtidos resultados semelhantes.

As culturas de células e transfecção transiente

e MGC803 HGC27 eram linhas de células gástricas, que foram adquiridos a partir da biblioteca de células da Academia chinesa de Ciências. Ambos foram cultivadas em meio RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, EUA). SGC7901 e GES1 eram mais linhas de células gástricas, que foram gentilmente cedidas pelo Departamento de Patologia Pesquisa da Universidade de Nantong. SGC7901 GES1 e foram cultivadas em meio DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, EUA). Todos os meios foram feitas com 10% de soro fetal de bovino (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U /mistura de penicilina-estreptomicina (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, EUA ), a 37 ° C e 5% de CO _{2. PFTK1 pequeno-ARN interferente (siRNA) foram concebidos e sintetizados por Shanghai Genechem (China). O siARN sequências de direccionamento PFTK1 foram como se segue: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. O plasmídeo Bandeira-PFTK1 foi comprado de Shanghai Genechem (China). Lipofectamine 2000 (de reagente de transfecção Life Technologies) foi usado para transfecção células seguindo as instruções do fabricante.}

análise de citometria de fluxo

Em primeiro lugar, todas as linhas de células gástricas foram fixadas em etanol a 70% durante a noite a -20 ° C. segundo, depois lavou-se por tampão de citrato-fosfato e PBS, as células foram incubadas com 1 mg /ml com ARNase durante 30 minutos a 37 ° C. Em seguida, as células foram coradas com 50 ug /ml de iodeto de propídio em tampão fosfato salino (PBS) -Triton durante mais 20 min a 4 ° C. Finalmente, as células foram analisadas usando um citómetro de fluxo Becton Dickinson FACScan BD (San José, CA) e os programas de análise de aquisição CellQuest. A experiência foi realizada três vezes.

ensaios de formação de colónias

MGC803 células foram cultivadas em seis placas de cultura (Corning Inc., Corning NY) a uma densidade de 200 células /poço após transfecção PFTK1 #siRNA e Flag-PFTK1 de acordo com as instruções do fabricante. Após duas semanas, as colónias de células (≥50 células /colónia) foi contado por coloração com violeta de cristal a 0,5%.

ensaios de proliferação celular

MGC803 células normais, que incluem a transfecção de PFTK1 # siRNA e Flag-PFTK1 foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de células de fragmentação (Corning Inc., Corning NY) a uma densidade de 2 × 10 ^{4 células /poço em 100 ul de cultura e crescidas durante a noite. De acordo com as instruções do fabricante, as células foram medidos usando um comercial de CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão). CCK-8 reagentes foram adicionados a cada poço durante 2 h de incubação a 37 ° C. A absorvância foi lida no comprimento de onda de 450 nm num leitor de placas automatizado. Os experimentos deve repetir pelo menos três vezes.}

-cicatrização de feridas ensaio

MGC803 células foram cultivadas em seis placas de cultura (Corning Inc, Corning NY) a uma densidade de 5 × 10 ^{5 células /poço e cultivadas até à confluência durante a noite. Após transfectadas 48 horas, as células foram incubadas com meio isento de soro. Uma linha foi riscado dentro da camada de células conflent usando a extremidade de uma fie 10 ml de ponta de pipeta (tempo 0) e as células foram lavadas com PBS. Imagens de células que migram foram sequencialmente tomada após 24 h, 48 h durante o fechamento da região feridos.}

Trans-well ensaio de migração

ensaio de migração celular foi realizada utilizando transpoço câmara (tamanho de poro 8,0 lm; Costar, Cambridge, Nova Iorque, EUA). Cerca de 1 × 10 ^{5 células /ml foram semeadas nas câmaras superiores em forma, e meio RPMI-1640 foi adicionado às câmaras inferiores. Após 24 h, os melhores células que não migraram foram foram removidos e as células de fundo, que foram migradas foram fixadas com paraformaldeído e coradas com violeta de cristal. O número de células que migram em 5 campos foi contabilizada com 200 × ampliação, e foram determinadas as médias de cada câmara. Todas as experiências foram repetidas três vezes}

Trans-ensaio de invasão bem

ensaio de migração celular foi realizada utilizando Transwell câmara (8.0 lm tamanho de poro; Cos t ar, Cambridge, Nova Iorque, EUA).. BD MatrigelTM membrana basal da matriz foi adicionada à câmara superior por 1 h a 37 ° C. Em seguida, 500 ul de meio que contém o factor quimiotáctico foi colocada na câmara inferior. Cerca de 1 × 10 ^{5 células /ml foram semeadas em câmaras superiores a 37 ° C durante 24 h.Cells foram então fixadas com paraformaldeído e coradas com violeta de cristal. Todos os experimentos foram repetidos três vezes.}

A análise estatística

Toda a análise estatística foi foram realizados utilizando as estatísticas SPSS 19 pacote de software. O PFTK1, Ki-67 e as características clínico-patológicas foram analisados ​​através do χ ^{2 de teste. As curvas de sobrevida global foram calculados com o método de Kaplan-Meier e foram testados com o teste log-rank. A análise multivariada foi analisada pelo modelo de riscos proporcionais de Cox, a relação risco e seu intervalo de confiança de 95% foram registrados para cada marcador. Os valores foram expressos em média ± SE, e P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.}

Resultados

PFTK1 é overexpressed em tecidos tumorais gástricas

É relatado que PFTK1 é um importante quinase dependente da ciclina que pode regular o ciclo celular, mas a pesquisa sobre câncer gástrico nunca foi estudada. Desde superexpressão de PFTK1 foi encontrado em câncer de fígado e câncer de esôfago em comparação com tecidos normais. Por isso, é interessante para a análise da expressão de PFTK1 em tecidos tumorais gástricas e sua coorelation com antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Em primeiro lugar, examinamos a expressão de PFTK1 em 8 pares de tecidos de tumores gástricos e os seus correspondentes não tumorais, tecidos da mucosa gástrica por Western blot. Como mostrado na Fig 1, em comparação com os tecidos normais adjacentes, regulação positiva de PFTK1 foi detectada em todas as oito tecidos gástricos em acordo com PCNA. A fim de confirmar o significado clínico da PFTK1 na progressão do cancro gástrico, imuno-histoquímica (IHQ) as análises foi usado para observar a expressão da proteína PFTK1 em 161 tecidos com câncer gástrico. Como esperado, a expressão de PFTK1 e grau do tumor foram relacionados negativamente. PFTK1 tinha uma expressão significativamente maior em espécimes pouco diferenciados de espécimes em bem diferenciados, o que era consistente com Ki-67. PFTK1 foi expressa na membrana celular, citoplasma, enquanto, Ki-67, principalmente no núcleo. O resultado foi mostrado na Figura 2. Em seguida, foi investigada a correlação entre PFTK1 e Ki-67 pelo coeficiente de correlação de Pearson. Podemos ver na Figura 3A que PFTK1 foi positivamente associado com Ki-67 (γ de Pearson = 0,833, P Art < 0,001).

PFTK1 está associada a características clínicas adversas e tumor gástrico pobres sobrevivência

estudo de associação clínica dos pacientes foi explorada para analisar a correlação de PFTK1 com câncer gástrico características clinicopatológicas entre 161 tecidos. Os dados clínico-patológicos foram listadas na Tabela 1. alta expressão de PFTK1 estava relacionada com o grau do tumor ( P
= 0,009), profundidade de infiltração ( P
= 0,002), invasão de linfonodos ( P
= 0,000), bem como o Ki-67 ( P
= 0,000). Mas não houve correlação entre a expressão PFTK1 e outras variáveis ​​clínicas, tais como idade, sexo, invasão do nervo, e estágio TNM.

Além disso, a análise de Kaplan-Meier foi utilizado para analisar a associação entre a expressão PFTK1 e 161 sobrevida dos pacientes. De acordo com as curvas de sobrevivência, alta expressão de PFTK1 foi obviamente correlacionada com sobrevida global pobres, enquanto a baixa expressão de PFTK1 foi correlacionada com melhor sobrevida global. E a relação tempo de sobrevivência e de perigo mediana foi mostrado na Figura 3B. Além disso, a análise univariada em tecidos com câncer gástrico mostrou que o grau do tumor ( P
= 0,020), profundidade de infiltração ( P
= 0,011), invasão de linfonodos ( P
= 0,011), estadiamento TNM (P = 0,031), expressão PFTK1 ( P
= 0,002) e Ki-67 ( P
= 0,013) foram fatores prognósticos de sobrevida global (Tabela 2 ). análise multivariada pelo modelo de riscos proporcionais de Cox sugeriu PFTK1 foi uma indicadores prognósticos independentes de sobrevida global dos pacientes ( P
= 0,048, Tabela 3). Em suma, nossos resultados demonstraram que a expressão de PFTK1 está significativamente associado com características clínicas e sobrevida global pobres.

A expressão de PFTK1 em células cancerosas gástricas não transfectadas e transfectadas

Como PFTK1 é overexpressed em tecidos tumorais gástricas, em seguida, analisamos a expressão de PFTK1 em linhas celulares, incluindo MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. A partir da Fig 4A, a expressão de PFTK1 na linha celular normal de GES1 gástrica foi menor do que em linhas de células gástricas MGC803, SGC7901, HGC27. Para estudar ainda mais a função de PFTK1 em células cancerosas gástricas in vitro,
MGC803 células foram transfectadas com PFTK1-siRNA e SGC7901 células foram transfectadas com Flag-PFTK1. Western blot foi usado para medir a expressão PFTK1. Quando Bandeira-PFTK1 foi transfectado em SGC7901, PFTK1 tinha uma expressão mais elevada (Fig 4B). Enquanto PFTK1-siARN foi transfectado em MGC803, PFTK1 siRNAalcançada a maior eficiência knockdown em comparação com outros PFTK1-siARN (Figura 4C). Então, foi selecionado o Flag-PFTK1 e PFTK1-siRNApara continuar as experiências seguintes.

PFTK1 pode promover células migram e invasivo in vitro

É relatado PFTK1 a sobre-expressão pode aumentar a fosforilação de CAD e aprimorar CAD para se ligar a F-actinas, que promovem a migração de carcinoma hepatocelular células [16]. Dado que PFTK1 foi relacionada com a linfa invasão nó em amostras de câncer gástrico, estudamos se PFTK1 poderia afetar gástrica migração células cancerosas e invasão. Cicatrização de feridas e ensaios ensaio Transwell mostrou que a migração das células da Bandeira-PFTK1 foi notavelmente aumentada em comparação com células de controlo. Pelo contrário, a migração de PFTK1-siRNAAs células foram reduzidas em comparação com células de controlo (Fig 5A e 5B). Além disso, ensaios de invasão Matrigel também demonstrou que a regulação positiva de PFTK1 por transfecção Bandeira-PFTK1 poderia avançar a capacidade invasiva e knockdown de PFTK1 poderia atenuar a capacidade invasiva de células de câncer gástrico (Fig 5C). No geral, se possa chegar a uma conclusão que PFTK1 promover a migração e invasão das células cancerosas gástricas.

A expressão de PFTK1 promover a proliferação de células cancerosas gástricas

De acordo com os resultados apresentados acima, PFTK1 foi positivamente correlacionada com PCNA, Ki-67 e grau do tumor, que eram células marcador de proliferação. Nós analisar o papel da PFTK1 na regulação da capacidade de proliferação. Em primeiro lugar, MGC803 células foram transfectadas com ARNsi # PFTK1-4, Bandeira-PFTK1 e foram determinados ensaio CCK-8. Superexpressão de PFTK1 demonstrado para melhorar a taxa de crescimento de células gástricas do que o controle, enquanto knockdown de PFTK1 mostrou o resultado oposto (Fig 6A). Consistente com o reforço da taxa de crescimento celular após PFTK1 superexpressão, ensaio de formação de colónia também mostrou que poderia aumentar a formação de colónia. E knockdown de PFTK1 mostrou o mesmo resultado com CCK-8 ensaio (Fig 6B). Finalmente, exploramos o mecanismo de proliferação de PFTK1 por análise de citometria de fluxo, e os dados sugerem que mais células cancerosas gástricas foram encontrados na fase S na presença de PFTK1 ectópica, células cancerosas menos gástricas foram encontrados na fase S em transfecção com PFTK1- siRNA(Fig 6C). Para resumir, estes dados demonstram que PFTK1 participou na regulação do ciclo celular, acelerando a transição G0 /G1 -S.

A via de sinal de PFTK1 na promoção da proliferação e migração

Para aprofundar o estudo do mecanismo de que PFTK1 regulada proliferação das células cancerosas gástricas, migração, invasão, decidimos para detectar a proteína relacionada mudou por Western blot quando PFTK1 foi overexpressed ou knockdown no MGC803. Como relatado, PFTK1 poderia activar a sinalização de Wnt não-canônico no carcinoma hepatocelular [17]. sinalização Wnt foi relacionada com a proliferação de tumores e a migração. Regulação positiva de PFTK1 parcialmente activado Dvl2, Naked1, MMP2 e elevou a expressão do regulador do ciclo celular ciclina E, mas não mudou DVL1, β-catenina. Além do mais, descobrimos que knockdown de expressão PFTK1 endógeno poderia diminuir Dvl2, Naked1, MMP2, ciclina E expressão, mas não mudou DVL1, β-catenina (Fig 7).

Discussão

Sendo uma das maiores cânceres de incidência no mundo, a taxa de sobrevida em 5 anos de câncer gástrico é inferior a 20% -25% nos EUA, Europa e China por causa de fácil de recaída e de alta taxa de metástase em pós-operatório [2]. infecção por Helicobacter pylori, a alteração de genes supressores de tumores oncogénicos e, a regulação do ciclo celular e a activação da telomerase está associada com o cancro gástrico [21]. regulação do ciclo celular anormal no desenvolvimento do câncer gástrico tem sido o tema de pesquisa nos últimos anos. regulação precisa e rigorosa do ciclo celular depende de alguns fatores de controle, incluindo quinase dependente do ciclo celular (CDKs), proteína do ciclo celular (ciclinas), e do ciclo celular inibidores da quinase dependentes (CKIs). Todo mundo está familiarizado com 11 CDKs clássicos (CDK1-11), PFTK1 como uma quinase dependente novo ciclo celular não é encontrado ao longo ea conexão entre PFTK1 e câncer não é muito, também no câncer gástrico [22].

PFTK1 foi originalmente encontrado no sistema nervoso de ratos [23]. PFTK1 modula a diferenciação de oligodendrócitos via PI3K /AKT [13]. A última pesquisa relatou que PFTK1 é regulada em câncer de esôfago humano, carcinoma hepatocelular e associados com o crescimento do tumor, migração e invasão [14,24]. Em nosso estudo, nós exploramos se a expressão de PFTK1 estava envolvido em gástrica células cancerosas proliferação, migração e invasão. Em primeiro lugar, foi demonstrado que PFTK1 expresso mais elevado em tecidos de cancro gástrico do que em tecidos não tumorais adjacentes por Western blot que, em conformidade com os resultados de outros tipos de cancro (Fig 1). Posteriormente, imuno-histoquímica mostrou alta expressão de PFTK1 estava relacionada com o grau do tumor, profundidade de infiltração, invasão linfonodal, bem como Ki-67 em 161 tecidos com câncer gástrico. Estas descobertas levaram PFTK1 pode afetar a proliferação do câncer gástrico e de migração. De Kaplan-Meier análise revelou que PFTK1 previu sobrevivência global fraca (Fig 3B). análise multivariada pelo modelo de riscos proporcionais de Cox sugeriu PFTK1 foi uma indicadores prognósticos independentes de sobrevida global dos pacientes. A fim de entender melhor o efeito regulador de PFTK1 em células gástricas, MGC803 células foram transfectadas com PFTK1-siRNA, Bandeira-PFTK1 in vitro
(Fig 4). Figura 6 mostrou PFTK1 poderia promover a proliferação por CCK-8, ensaio de formação de colónia. Ao mesmo tempo, PFTK1 aumentou a transformação de fase G1-S de acordo com citometria de fluxo, que coincide com o achado de PFTK1 no carcinoma hepatocelular [10]. Ciclina E foi um dos fatores regulatórios importantes durante a transformação de fase G1-S e proteína ciclina E poderiam definir como fator prognóstico para pacientes com câncer gástrico [25]. Curiosamente, o nível PFTK1 foi aumentada após transfecção com Flag-PFTK1 consistented com PCNA, MMP2 e ciclina E (Fig 7).

Além disso, nós também examinou se PFTK1 poderia afetar células migração e capacidade de invasão pela cicatrização de feridas e ensaio Transwell ensaios. Os resultados mostraram que a sobre-expressão de células poderia aumentar PFTK1 migração e invasão, o que pode ser devido a uma mudança de jusante das vias de sinalização PFTK1 (Fig 5). Como relatado no cancro hepatocelular, PFTK1 e /ou CCNY por si só poderia activar a sinalização de Wnt não canónicas células causando a migração e invasão [17]. vias de Wnt incluiu a canônica Wnt /sinalização de β-catenina e não-canônica Wnt sinalização maneira (Wnt /Ca ^{2 + e Wnt /PCP). caminho de sinalização Wnt desempenhou um papel importante no desenvolvimento de cânceres e proliferação de células regulamentado, migração e invasão [26]. Posteriormente, encontramos a expressão de proteínas β-catenina, DVL1, Dvl2, Naked1. Dvl2 e Naked1 foram positivamente correlacionados com PFTK1 e as proteínas canónica de Wnt /β-catenina relacionados com p-catenina, DVL1 não tinha mudado (Fig 7). A partir do exposto, portanto, especulou que PFTK1 pode promover a migração e invasão através da regulação de sinalização Wnt não-canônico. E havia também artigos de sinalização Wnt não-canônico pronta promove a migração e invasão capacidade das células cancerosas gástricas [27,28].}

Em uma palavra, a expressão de PFTK1 significativamente foi aumentada nos tecidos com cancro gástrico humanos. Superexpressão ou knockdown de PFTK1 por transfecção com Flag-PFTK1 ou PFTK1-siRNA, obviamente, afectada gástrica células cancerosas proliferação, migração e invasão. Os nossos resultados no primeiro tempo, proporcionar novas evidências de PFTK1 no desenvolvimento de cancro da base e de laboratório de alimentação gástrica para tratamento clínico. Mas são necessários mais estudos para compreender o mecanismo preciso de PFTK1 afetando proliferação, migração e capacidade de invasão das células cancerosas gástricas.

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