PLoS ONE: PFTK1 fördert Magenkrebs Progression durch Regulierung der Proliferation, Migration und Invasion

Abstrakt

PFTK1, auch bekannt als PFTAIRE1, CDK14, ist ein neues Mitglied der Cdc2 bezogenen Serin /Threonin-Proteinkinasen. Jüngste Studien zeigen, dass PFTK1 in mehreren malignen Tumoren wie hepatozellulärem Karzinom, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs stark exprimiert, und in der Regulation des Zellzyklus beteiligt, Tumoren Proliferation, Migration und Invasion, die weiter die Prognose von Tumoren beeinflussen. Allerdings bleiben die Expression und physiologische Bedeutung von PFTK1 bei Magenkrebs unklar. In dieser Studie analysierten wir die Expression und klinische Bedeutung von PFTK1 durch Western-Blot in 8 frischen Magenkrebsgewebe, nontumorous Magenschleimhaut Gewebe und Immunhistochemie auf 161 paraffinembedded Scheiben gepaart. Hohe PFTK1 Expression wurde mit dem Tumorgrad, Lymphknotenbefall sowie Ki-67 korreliert. Durch Zellzählung Kit (CCK) -8-Assay, Durchflusszytometrie, Koloniebildung, Wundheilung und Transwell-Assays zeigten die vitro Studien, dass eine Überexpression PFTK1 Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen gefördert, während PFTK1 Zuschlags auf die gegenüberliegenden Ergebnissen geführt. Unsere Ergebnisse zum ersten Mal unterstützt, dass PFTK1 könnte eine wichtige Rolle bei der Regulation der Magenkrebs Proliferation, Migration spielen und eine neue viel versprechende therapeutische Strategie gegen menschlichen Magenkrebs bieten

Citation:. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J, Wang Q, et al. (2015) PFTK1 fördert Magenkrebs Progression durch Regulierung der Proliferation, Migration und Invasion. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10.1371 /journal.pone.0140451

Editor: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Empfangen: 7. Mai 2015; Akzeptiert: 25. September 2015; Veröffentlicht: 21. Oktober 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:.. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Natural Science Foundation of China (Nr 81302285, Nr 81402015)

Konkurrierende Interessen unterstützt wurde: die Autoren haben erklärt, dass nicht existieren konkurrierende Interessen.

Einführung

Magenkrebs die vierthäufigste bösartige Tumor und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in allen Arten von Krebserkrankungen weltweit ist [1]. Es ist schwer zu heilen, wenn es in einem frühen Stadium festgestellt wird [2]. Aufgrund des Mangels an Spezifität, ist eine frühe Diagnose Rate gering und die Mehrzahl der Patienten mit Magenkrebs sind bei mittleren späten Stadium bei Diagnose. 40% -60% der Patienten mit Magenkrebs erhalten Magenkrebs radikale Operation wird oft postoperativen Rezidiv und Metastasierung haben, ernst diese Eigenschaften die langfristige Überleben bei Patienten mit Magenkrebs beeinflussen [3,4]. Trotz großer Fortschritt neuer Diagnose- und Behandlungsstrategien von Magenkrebs, die genauen molekularen Mechanismen von Magenkrebs bleibt verstehen schlecht. So kann die Identifizierung des molekularen Mechanismus bei Magenkrebsprogression und Metastasierung Patienten schaffen, mit neuer diagnostischer und therapeutischer Strategien.

PFTK1 (auch bekannt als PFTAIRE1, CDK14) ist ein neues Mitglied der Cdc2 bezogenen Serin /Threonin Proteinkinasen, die zuerst in der Maus Nervensystem identifiziert und ist ein wichtiger Regulator der Cycline und Zellzyklus [5,6]. Einige Studien wurden durchgeführt, dessen physiologische Funktion oder biologische Bedeutung zu charakterisieren. Es wird berichtet, dass PFTK1 stark in Gehirn, Pankreas exprimiert wird, Niere und Ovar. CDKs binden an spezifische Cyclin-Box funktionelle Proteinkinase-Komplexen und ihre subzelluläre Lokalisierung durch teil geregelt zu bilden [7]. Zum Beispiel Cyclin Y, a novel membranassoziiertes cyclin, interagiert mit PFTK1 PFTK1 Kinaseaktivität verbessert und rekrutiert PFTK1 zur Plasmamembran [8]. PFTK1 Wechselwirkung mit Cyclin B2 Kolokalisation im Kern in hepatozellulärem Karzinom [9]. Die grundlegende Funktion von PFTK1 als Cyclin-abhängige Kinase (CDK) Regulierung des Zellzyklus und der Zellproliferation mit Mitgliedern von Cyclin-Proteinen durch speziell die Interaktion berichtet wie Cyclin D3 (CCND3), Cyclin Y (CCNY) und bildet einen ternären Komplex mit der Zellzyklus-Inhibitor p21 phosphoryliert somit die Rb-Tumorsuppressor für G1 /S-Übergang [10]. Knockout Cyclin Y in Gliom-Zelllinien macht den Zellzyklus in S-Phase blockiert [11]. Cyclin Y in Wechselwirkung mit PFTK1 M-Phase der Mitose einstellen [12]. Diese Ergebnisse zusammen implizieren, dass PFTK1 als Tumorpromotor wirken kann Zellzyklus über Regulierung. Unterdessen zeigen mehrere Studien, dass PFTK1 auch andere wichtige Funktionen hat. PFTK1 moduliert Oligodendrozyten Differenzierung über PI3K /AKT Weg [13]. Kürzlich PFTK1 verleiht HCC Zellbeweglichkeit durch das Aktin-bindenden motile unterdrückende Funktion von TAGLN2 über die Phosphorylierung Inaktivierung [14]. PFTK1-vermittelte Phosphorylierung ermöglicht Vereinigung von CaD zu F-Aktin-Filamente führt, Polymerisation der Aktin-Stressfasern bei der Verbesserung, damit die Zellmigration und Invasion in HCC Zellen zu fördern [15,16]. Die Überexpression von PFTK1 kann einen frei beweglichen Phänotyp bei malignen Hepatozyten [9] verleihen. In Übereinstimmung mit den molekularen Erkenntnissen CCNY und /oder PFTK1 allein kann nicht-kanonische Wnt-Signal aktivieren, um Zellbeweglichkeit in HCC Zellen [17] zu verbessern. Alle diese Studien implizieren, dass PFTK1 in der Zellproliferation und Motilität beteiligt sein können, sind jedoch die Expression und Bedeutung von PFTK1 in Magenkrebszellen noch unklar.

In unserer Studie wollten wir eine umfassende Analyse zur Durchführung von PFTK1 Ausdruck und seine Prognose Rolle bei Magenkrebszellen. Wir untersuchten die Expression von PFTK1 und seine Verbindung mit klinischen Merkmalen und Ki-67 durch Western-Blot und Immunhistochemie (IHC). Unsere Studie hat gezeigt, dass PFTK1 verstärkte Proliferation, Migration und Invasivität von Magenkrebszellen durch CCK-8, Durchflusszytometrie analysiert, Koloniebildung analysiert, Transwell-Assay beeinflusst die Expression von verwandten Proteinen. Diese Ergebnisse wurden zunächst in Magenkrebszellen berichtet und kann einen neuen Einblick in die Entwicklung von experimentellen Therapien bei Magenkrebs bieten.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

hundertsechzig -on Gewebe Magenkrebs Proben und angepasst benachbarten noncancer Gewebe wurden von Patienten ausgewählt, die eine Operation zwischen 2007 und 2013 am Institut für Pathologie, Nantong Tumor Krankenhaus unterzog. Diese Gewebe wurden bei -80 ° C unmittelbar nach der chirurgischen Entfernung gespeichert. Für die histologische Untersuchung, alle Proben Magengewebe wurden in 10% gepuffertem Formalin und in Paraffin eingebettet zum Schneiden. Reseziert Proben wurden nach der siebten Auflage der TNM-Klassifikation für Magenkrebs eingestuft [1] .Alle die klinisch-pathologischen Informationen Alter enthalten, Geschlecht, Infiltrationstiefe, Differenzierungsstatus, Lymphknotenbefall, Nerven Invasion und TNM-Stadium. Die Zulassung von entfernt Gewebe zu Forschungszwecken wurde von der Ethikkommission der Nantong Tumor Krankenhaus erhalten. Unterzeichnung informierte Zustimmung wurde auch von jedem Patienten erhalten. Die wichtigsten klinischen und pathologischen Variablen in der Tabelle zusammengefasst wurden 1.

Western-Blot-Analyse

Western-Blot-Assay wurde verwendet, um einige Proteine ​​nachzuweisen [18-20]. Zunächst wurden in Lysepuffer rissig die Magen caner Gewebe und Zellen (1 M Tris-Hcl pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% Natriumsulfat (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% Natrium Deoxycholat, 10 ug /ml Aprotinin, 1 mM PMSF, 10 ug /ml Leupeptin) und dann bei 10.000 × g zentrifugiert für 30 min den Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde in 2 × SDS-Ladepuffer verdünnt und zum Sieden erhitzt. Eine äquivalente Menge von Proteinen aus jeder Probe wurden durch 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann übertragen auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran (Millipore, Bedford, MA) elektrophoresiert. Danach wurden die Membranen für ca. 2 h bei Raumtemperatur blockiert und dann über Nacht bei 4 ° C mit den primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) 0,1% Tween 20 dreimal für je 5 min enthält, wurden die Membranen dann mit Meerrettich-Peroxidase-gebundenen IgG als sekundärer Antikörper für weitere 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden dann unter Verwendung der ECL-Detektionssysteme (Imaging Technology, Ontario, Kanada) entwickelt. Die Antikörper, die in dieser Studie enthalten: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-Cyclin E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), Anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-Catenin (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), Anti-MMP-2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

immunhistochemischen Analysen

kurz gesagt, Gewebeschnitte wurden in Xylol und rehydriert entwachstem durch abgestufte ethanole. Dann werden die Abschnitte für etwa 10 min in 3% methanolischer Peroxid abgeschreckt, um endogene Peroxidase-Aktivität blockieren. Von hohem Druck und Temperatur in einem Autoklaven, seine Immunreaktivität wurde für 3 min in 0,1 M Citrat-Puffer verbessert. Gewebeschnitte wurden mit dem anti-PFTK1 inkubiert (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) und Anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) für 120 min bei Raumtemperatur. Gemäß den Anweisungen des Herstellers, nachdem in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, wurden die Gewebe mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem anti-Maus-Ig-Polymer als ein zweiter Antikörper (Envision Kit, Dako) für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Objektträger mit Hämatoxylin gegengefärbt, entwässert und in Harz Halterung montiert. Zur Quantifizierung PFTK1 und Ki-67 Protein-Expression, sowohl das Ausmaß der Immunreaktivität und die Intensität wurden ausgewertet und bewertet. Fünf Hochleistungsfelder wurden zufällig für jeden Abschnitt ausgewählt und mindestens 300 Zellen wurden pro Feld gezählt. Für die statistische Analyse von PFTK1 wurde jede Folie mit einem semi-quantitativen Scoring-System für die Intensität der Färbung und der Prozentsatz der positiven malignen Zellen sowohl ausgewertet. Die Zellen wurden wie folgt bewertet: 1 (≤25% Tumorzellen gefärbt), 2 (26% -50% Tumorzellen gefärbt), 3 (51% -75% Tumorzellen gefärbt), 4 (76% -100% Tumorzellen befleckt). Für Dichte Bewertung: 1 eine schwache Färbung; 2 moderate Färbung; 3 eine starke Färbung. Dann multipliziert man die beiden Partituren und klassifiziert sie in zwei Gruppen: niedrige Expression und hohe Expression. Wie für die statistische Analyse von Ki-67, < 50% Tumorzellen gefärbt, wie niedrige Expression und ≥50% Tumorzellen eine hohe Expression gefärbt. Um technische Fehler zu vermeiden, wurde Färbung dreimal wiederholt, und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Die Zellkulturen und transiente Transfektion

MGC803 und HGC27 Magen-Zelllinien wurden, die aus der Zellbibliothek erworben wurden der chinesischen Akademie der Wissenschaften. Beide wurden in RPMI-1640-Medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) kultiviert. SGC7901 und GES1 waren eine andere Magen-Zelllinien, die von der Abteilung für Pathologie Forschung von Nantong Universität freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. SGC7901 und GES1 wurden in DMEM-Medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) kultiviert. All das Medium mit 10% fötalem Rinderserum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 100 U /ml Penicillin-Streptomycin-Gemisch (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), bei 37 ° C und 5% CO _{2. PFTK1 small-interfering RNA (siRNA) wurden entwickelt und synthetisiert von Shanghai Genechem (China). Die siRNA PFTK1 Targeting-Sequenzen waren wie folgt: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. Die Flag-PFTK1 Plasmid wurde aus Shanghai Genechem (China) erworben. Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz (Life Technologies) wurde nach den Anweisungen des Herstellers für Zellen Transfektion verwendet.}

Die durchflusszytometrische Analyse

Zunächst werden alle Magen-Zelllinien wurden über Nacht bei -20 ° in 70% Ethanol fixiert C. Zweitens, nachdem sie von Citrat-Phosphat-Puffer gewaschen und PBS wurden die Zellen bei 37 ° C für 30 min mit 1 mg /ml RNase A inkubiert. Dann wurden die Zellen mit 50 &mgr; g /ml Propidiumiodid in Phosphate Buffered Saline (PBS) -Triton für weitere 20 min bei 4 ° C gefärbt. Schließlich wurden die Zellen unter Verwendung eines Becton Dickinson FACScan Durchflusszytometer BD (San Jose, CA) und Cellquest Akquisitionsanalyseprogramme analysiert. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt.

Colony Formation Assays

MGC803 Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten (Corning Inc., Corning NY) bei einer Dichte von 200 Zellen /Loch nach Transfizieren PFTK1 #siRNA und Flag-PFTK1 gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach zwei Wochen wurden die Zellkolonien (≥50 Zellen /Kolonie) durch Anfärben mit 0,5% Kristallviolett gezählt.

Zellproliferationsassays

MGC803 Zellen, die normale enthalten, die Transfektion von PFTK1 # siRNA und Flag-PFTK1 wurden ausgesät auf 96-Well-Zellkulturclusterplatten (Corning Inc., Corning NY) bei einer Dichte von 2 × 10 ^{4 Zellen /Vertiefung in 100 ul Kultur und über Nacht gezüchtet. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Zellen unter Verwendung eines kommerziellen CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) gemessen. CCK-8 Reagenzien wurden auch bei 37 ° C für 2 h Inkubation jeweils zugegeben. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm in einem automatischen Plattenlesegerät abgelesen. Die Versuche müssen mindestens dreimal wiederholen.}

Wundheilungs Assay

MGC803 Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten (Corning Inc., Corning NY) bei einer Dichte von 5 x 10 kultiviert ^{5 Zellen /Vertiefung und über Nacht bis zur Konfluenz gezüchtet. Nach 48 Stunden transfiziert wurden die Zellen mit serumfreiem Medium inkubiert. Eine Linie wurde in der conflent Zellschicht mit dem fie Ende einer 10 ml Pipettenspitze gekratzt (Zeit 0) und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Bilder von wandernden Zellen wurden nacheinander nach 24 h genommen, 48 h während des Schließens des verwundeten Region.}

Trans-Well-Migrationstest

Die Zellmigration Test durchgeführt wurde Transwell-Kammer (8,0 lm Porengröße unter Verwendung von; Costar, Cambridge, NY, USA). Etwa 1 × 10 ^{5 Zellen /ml in den oberen Kammern in Medium ausgesät, und RPMI-1640 wurde zu den unteren Kammern gegeben. Nach 24 h, was die Top-Zellen wurden nicht migriert wurden entfernt und die unteren Zellen, die mit Paraformaldehyd und mit Kristallviolett gefärbt wurden migriert wurden behoben. Die Anzahl der wandernden Zellen in 5 Feldern wurde unter 200-facher Vergrößerung gezählt, und die Mittel für jede Kammer bestimmt. Alle Experimente wurden dreimal wiederholt}

Trans gut Invasionstest

Die Zellmigration Assay wurde Transwell Kammer (8,0 lm Porengröße; Costar, Cambridge, NY, USA) durchgeführt werden.. BD MatrigelTM Basalmembranmatrix wurde bei 37 ° C für 1 h in die obere Kammer zugegeben. Dann wurden 500 &mgr; l Medium, chemotaktischer Faktor enthält, wurde in der unteren Kammer platziert. Etwa 1 × 10 ^{5 Zellen /ml in den oberen Kammern bei 37 ° C ausgesät wurden 24 h.Cells dann mit Kristallviolett mit Paraformaldehyd und gefärbt wurden behoben. Alle Experimente wurden dreimal wiederholt.}

Die statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden wurden mit SPSS Statistics 19 Softwarepaket durchgeführt. Die PFTK1, Ki-67-Expression und die klinisch-pathologische Merkmale wurden mit dem χ analysiert ^{2-Test. Die Gesamtüberlebenskurven wurden mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und wurden mit dem Log-Rank-Test geprüft. Multivariate Analyse wurde von Cox Proportional-Hazards-Modell, das Risiko-Verhältnis und dessen 95% Konfidenzintervall wurden für jeden Marker aufgezeichnet analysiert. Die Werte wurden als Mittelwert ± SE ausgedrückt und P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Nachweis und Charakterisierung des metastasierten Krebszellen in der Mesogastrium von Magenkrebs Patients
• PLoS ONE: Dietary Fat Ansaug- und Risiko von Magenkrebs: Eine Meta-Analyse von Beobachtungs Studies