Фон
<р> TGF-β играет двойную роль в прогрессировании рака у человека. На ранних стадиях канцерогенеза TGF-b функции как супрессор опухоли. На поздних стадиях развития опухоли, однако, TGF-β может способствовать росту опухоли и метастазирование. Сдвиг в Smad2 /3 фосфорилирования с карбоксиконце к линкер сайтам является ключевым событием определения биологической функции TGF-бета в ободочной и гепатоцеллюлярной карциномы. В настоящем исследовании мы изучали потенциальную роль дифференциальной Smad2 /3 фосфорилирования аденокарциномы желудка.
Финансирование:. Изучение Работа выполнена при поддержке Бюро здравоохранения провинции Чжэцзян Китая, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); БМБФ "Hepatosys" 0313082L, "Виртуальная печень" и "клеточная терапия" 01GN0987 (S.D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S.D.) и LA997 /5-1 (S.D.); и Дитмар Хопп Stiftung GmbH (S.D.). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является ведущей причиной рака, связанных смерти в мире, занимая второе место у мужчин и у женщин четвертое место по частоте [1]. Патогенез рака желудка связано с несколькими факторами. Среди них, нарушение регуляции сигнальных путей, связанных с процессами развития, включая трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), Wnt /β-катенин, еж и сигнализации Notch, играет центральную роль в развитии и прогрессировании этого вида рака [2].
<р> TGF-β семейства молекул, в том числе TGF-бета-изоформ, Активины и костных морфогенетических белков (BMPs), имеет важные функции в различных физиологических и патофизиологических процессах, например, эмбриональное развитие, аутоиммунные заболевания, фиброз и рак [3], [4]. TGF-β преобразовывает свои сигналы, стимулируя образование гетеромерных комплексов TGF-бета типа I (TGF-βRI) и тип II (TGF-βRII) серин /треонин киназы рецепторов. Активированный TGF-βRI распространяется передача сигналов с помощью набора и фосфорилирования рецептора Регулируют-Smads (R-Smads, включая Smad2 и Smad3). Фосфорилирование C-концевых остатков серина в R-Smads является важным шагом для канонической передачи сигналов TGF-бета. Два наиболее остатков С-концевых серина в серина 465/467 в Smad2 и серина 423/425 в Smad3 фосфорилируются, вместе с третьим остатком нефосфорилированном серина, образуют эволюционно консервативную SSXS мотив во всех R-Smads [5], [6]. Кроме того, C-концевой фосфорилирования Smad2 /3 (Р-Smad2C и P-Smad3C) с помощью TGF-βRI, других киназ, например C-Jun N-концевой киназы (JNK) и Ras-ассоциированных киназ, вызывают фосфорилирование R-Smads на компоновщика участках вокруг серина 249/254 в Smad2 и серин 208/213 в Smad3 (P-Smad2L и P-Smad3L) [7 ], [8]. Фосфорилированные R-Smads образуют комплекс с общей Smad (Co-Smad; SMAD4 у млекопитающих) и трансфер в ядро для гена-мишени транскрипции [3]. Кроме R-Smad и со-Smad, третий тип белка Smad представляет собой ингибитор-Smad (I-Smad; Smad6 и Smad7). I-Smads транскрипционно индуцируется TGF-бета, что указывает на механизм отрицательной обратной связи этого сигнального пути [4].
<Р> TGF-β играет двойную роль в прогрессировании рака у человека [9], [10] , На ранних стадиях рака, TGF-бета действует как опухолевый супрессор путем ингибирования клеточной пролиферации или путем содействия клеточного апоптоза. Тем не менее, на поздних стадиях, TGF-β поддерживает прогрессирование опухоли, такие как вторжение опухолевых клеток, распространения и иммунной уклонения [9]. Кроме того, TGF-β хорошо известна в качестве посредника эпителиальной-к-мезенхимальных перехода (EMT) при раке [11]. Хотя возмущения сигналов TGF-β /Smad играют центральную роль в канцерогенезе в большинстве органов, его опухоль продвижения исход весьма зависит от контекста. Например, передача сигналов TGF-β играет важнейшую роль в поддержании стволовых раковых клеток к самообновлению и онкогенного активности в глиомы и лейкемии, в то время как эффекты передачи сигналов TGF-бета при раке молочной железы стволовые клетки являются спорными [12]. Одно исследование показало, что блокирование TGF-бета путь через доминантный негативный TGF-βRII увеличивает размер ячейки отсека груди стволовой и способствует онкогенеза, что указывает на подавление груди канцерогенеза этого цитокина [13]. В противоположность этому, Мани и его коллеги обнаружили, что TGF-бета пути нам критически в поддержании клеточноподобных свойств стволовых рак молочной железы и онкогенного активности с помощью индукции EMT [14].
При раке желудка, однонуклеотидных полиморфизмов ( ОНП) ТФР-бета связаны с предрасположенностью к стадии I и II стадии рака желудка [15], [16]. Сывороточные уровни TGF-бета были сообщены значительно коррелируют с венозной инвазии у больных раком желудка [17]. Однако детальные механизмы TGF-бета сигнализации в прогрессии рака желудка до сих пор неизвестны. Кроме того, остается неясным, когда и как TGF-β превращается из опухолевого супрессора в опухоли промотора во время канцерогенеза.
<Р> В последнее время, сдвиг в фосфорилирования Smad2 /3 от С-конца к компоновщика сайтов, как было показано, ключевым событием определения биологической функции TGF-бета при раке [18], [19], [20]. Предыдущие исследования, основанные на 12-летнего наблюдения показали, что хронический гепатит /ВГС пациентов с P-Smad2 /3L в тканях печени имели более высокий риск продвижения к гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), чем те, с P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. В соответствии с выводами, содержащимися в ГЦК, подобные наблюдения были сделаны в колоректального рака [7], [22].
<Р> Для изучения вклада дифференциального Smad фосфорилирование к канцерогенеза при раке желудка, мы исследовали P-Smad2 /3C и P-Smad2 /уровни 3L в 130 пациентов с аденокарциномой желудка с помощью иммуногистохимии (IHC). Мы проанализировали возможные корреляции между различными участками фосфорилирования R-Smads и вторжения, метастазов в лимфатических узлах, дифференцировки и стадии рака желудка.
Linker фосфорилирования Smad2 /3 не связан с раком желудка
в отличие от предыдущих результатов от колоректального рака и HCC [7], [8], [21], [22], мы не обнаружили значительное P-Smad2L и /или P-Smad3L положительный окрашивая в желудочных тканей от пациентов с раком желудка. Только 18 из 130 пациентов, показали, п-Smad3L положительное окрашивание в основном в нераковых клетках. Эти результаты свидетельствуют о том, что линкер фосфорилирования в сериновых сайтов Smad2 /3 не имеет решающего значения при раке желудка.
P-Smad3C часто встречается в раковых ассоциированных фибробластов
<р> P-Smad3C IHC оценка не выявили существенную корреляцию с T /N /G /S из образцы желудочного рака (таблица 1). Тем не менее, P-Smad3C положительное окрашивание часто происходило в фибробластах окружающих раковые клетки у больных раком желудка (рис. 1).
<Р> Раковые клетки эпителиального происхождения и не выражают маркеры мезенхимальных, например, a-SMA и коллагена I. Если раковые клетки экспрессируют маркеры мезенхимальных, это наводит на мысль о эпителиально-к-мезенхимальных перехода (EMT) [11]. В настоящем исследовании мы обнаружили α-SMA положительное окрашивание в раковых клетках у 54 из 130 больных раком желудка (например, пациент-1 на рис. 3). Чтобы прояснить потенциальную связь между п-Smad3C и EMT, мы исследовали корреляцию между п-Smad3C окрашивания (рак и окружающие ткани без рака) и α-SMA положительное окрашивание в раковых клетках. Kendall-тау коэффициенты корреляции рангов между баллов р-Smad3C IHC при раке /окружающие ткани без рака и α-SMA IHC порезов рака 0,14 ( р
= 0,08) и -0,09 ( р
= 0,99), соответственно (таблица 3). Для подтверждения EMT у этих пациентов, мы провели совместное окрашивание для улитка, другого специфического маркера для EMT, и коллаген I /α-SMA в желудочных тканях. Конфокальной микроскопии показало совместной локализации улитка и коллагена I (рис. 4А) /α-SMA (рис. 4B) в некоторых клеток рака желудка. Эти α-SMA позитивные клетки рака желудка, а также отображается P-Smad3C положительное окрашивание (рис. 4в). Кроме совместной локализации с α-SMA положительных клеток рака желудка, конфокальной микроскопии показали, что Р-Smad3C колокализуются с коллагеном I в клетках рака желудка (рис. 4D). Кроме того, P-Smad3C положительное окрашивание колокализуются с a-SMA и коллагена I не только в раковых клетках, но и в фибробластах (рис. 4C-4D). Эти результаты свидетельствуют о том, что Р-Smad3C может способствовать EMT рака желудка у некоторых пациентов.
Потеря полного выражения Smad2 и Smad3 у больных с желудочной
рака <р> Помимо измерения P-Smad2 при раке желудка , мы использовали ПЦР в реальном времени для выявления экспрессии мРНК Smad2 и Smad3 при раке желудка и окружающих тканей неопухолевыми из 16 пациентов. 15 и 12 пациентов соответственно продемонстрированные сниженную экспрессию мРНК Smad2 и Smad3 в опухолевых тканях, по сравнению с окружающими нормальных тканей (рис. 5). Эти результаты указывают на то, что не только активированный Smad2, но и экспрессию мРНК общего Smad2 снижается в желудочном канцерогенезе.
Обсуждение
<р> В колоректального аденокарциномы и ГЦК, сдвиг в фосфорилирования с карбокси-концом линкерные регионы было предложено в качестве важного события, связанного с переключателем TGF-бета от супрессор рака к онкогенного фактора [8], [18], [19], [20], [21], [22]. В настоящем исследовании мы рассмотрели эту потенциальную ассоциацию при раке желудка. Мы не обнаружили значительные уровни P-Smad2L и P-Smad3L в 130 больных раком желудка. 112 из 130 больных не показали Р-Smad2L или Р-Smad3L окрашивание в желудочном раковых клеток, что свидетельствует о том, что предлагаемый сдвиг в фосфорилированием R-Smad не может внести свой вклад в TGF-бета-опосредованного канцерогенеза в этом типе рака. В отличие от P-Smad2 /3L, как P-Smad2C и P-Smad3C положительное окрашивание был обнаружен у большинства пациентов с раком желудка. Kendall-тау корреляции рангов анализ показал, что P-Smad2C IHC оценка обратно коррелирует с глубиной опухоли (Т) и дифференцировки рака (G).
<Р> Роль Smad2 при формировании и прогрессировании различных типов рака остается спорным , В соответствии с текущим выводом, предыдущие исследования по пищеводу плоскоклеточного рака, рака молочной железы и колоректального рака показали, что потеря экспрессии Smad2 коррелирует с развитием опухоли и неблагоприятным прогнозом [23], [24], [25], [26]. В последнее время, Хут и его коллеги обнаружили, что Smad2, но не Smad3, часто теряется у 83 пациентов с кожей плоскоклеточного рака. Кроме того, у мышей с кератиноцитов конкретных Smad2 удаления отображается ускоренное формирование и злокачественную прогрессию химически индуцированных опухолей кожи мышей по сравнению с мышами дикого типа [27]. Тем не менее, в исследовании 52 пациентов с глиомы, положительная оценка Р-Smad2 ВВК сообщалось, коррелируют с распространением глиом и плохим прогнозом [28]. До настоящего исследования, синтоизм и его коллеги измеряли P-Smad2C окрашивания у 135 больных раком желудка. Они обнаружили, что уровни P-Smad2C были выше в слабо дифференцированной рака по сравнению с хорошо дифференцированные из них [29]. Это пока не ясно, почему существуют диаметрально противоположные результаты при раке желудка.
<Р> В канонической передачи сигналов TGF-бета, активированный TGF-βRI обычно индуцирует карбокси-концевой фосфорилирования и Smad2 и Smad3. Активированный Smad2 и Smad3 играют различные роли в росте клеток, дифференциации и других биологических функций [30]. В печени Smad2 имеет решающее значение в опосредовании роста гепатоцитов и дифференциации, в то время как Smad3 играет ключевую эффект в морфологической и функциональной зрелости звездчатых клеток печени [31], [32]. При раке, это спорно, способствует ли разрушение гена Smad3 в сторону онкогенеза. Чжу сообщил, что Smad3-дефицитных мышей развиваются рак толстой кишки [33]. Тем не менее, другие исследования с использованием Smad3-дефицитных мышей предположил, что потеря Smad3 сама по себе не достаточно, чтобы инициировать онкогенеза [34], [35], [36], [37]. При раке желудка, Хан обнаружил низкий уровень Smad3 в 3 из 8 пациентов и в девяти желудочных линиях раковых клеток человека [38]. Введение вектора Smad3 в желудочном клеточные линии восстановили TGF-, отзывчивость. Кроме того, инъекции Smad3-экспрессирующих клетках желудка голым мышам показали задержка туморогенез по сравнению с контрольной группой, что указывает на корреляцию потери Smad3 с канцерогенеза [38]. В настоящем исследовании мы не нашли значимой корреляции между P-Smad3C окрашивания клеток рака желудка и рака вторжения, дифференцировки и стадии. В отличие от P-Smad2C, который экспрессируется только в ядрах клеток, P-Smad3C положительное окрашивание обнаруживается в ядре, на мембране и в цитоплазме клеток рака желудка. Биологическая значимость различных моделей P-Smad3C окрашивания в раковых клетках, в настоящее время до сих пор неизвестно.
<Р> EMT раковых клеток является необходимым условием для прогрессирования до продвинутого метастатических опухолей [11]. Было признано, что TGF-β является крупным игроком в ЕМТ. Smad3, но не Smad2, является ключевым посредником в TGF-бета зависимого EMT [39]. Например, TGF-β не может индуцировать EMT в первичных эпителиальных клеток канальцев, полученных из почек Smad3-дефицитных мышей [40]. Подавление сигналов TGF-бета путем Ki26894, ингибитора TGF-βRI, снижение инвазии и ТЭИ скиррозных рака желудка в пробирке
[41]. Наши результаты показывают, что часть клеток рака желудка выразить маркеры EMT, например, Улитка, коллаген I и α-SMA. Совместной локализации Р-Smad3C с a-SMA /коллаген I обнаружен в значительном подгруппе пациентов. Кроме того, α-SMA положительное окрашивание в раковых клетках, имеет потенциальную корреляцию с Р-Smad3C IHC счет раковых клеток, но не окружающие ткани без рака. Эти результаты указывают на то, что P-Smad3C может играть определенную роль в EMT рака желудка.
<Р> В целом, данное исследование показывает, что Smad2 является важным медиатором, чтобы защитить клетки желудка от продвижения к слабо дифференцированным раком. Согласно нашим результатам, Smad3 не связана напрямую с характеристиками рака желудка, тем не менее, наши данные свидетельствуют о том, что он может играть определенную роль в возникновении рака, связанные фибробласты и ТЭИ клеток рака желудка.
Методы
<Н3> Пациенты
<р> Хирургические образцы обследовали у пациентов с первичным раком желудка на кафедре общей хирургии, первый филиал больницы, медицинская школа, университет Чжэцзян, Китай с 2003 по 2009 г. образец желудочный ткани собирали при операции рассекают Желудочный рак. Собранные ткани включали опухоль и окружающие не-опухолевые участки (ткани, по меньшей мере более чем на 5 см далеко от опухоли). Часть тканей фиксировали в 4% формальдегиде и заливали в парафин для гистологического исследования и измерения IHC. Остались свежие ткани были помещены в жидкий азот сразу для измерения мРНК. В общей сложности 130 спаренных желудка тканей, включая рак и окружающих тканей неопухолевыми были зачислены. Гистологический диагноз и классификации были оценены в соответствии с опухолью узла-метастаз (TNM) классификации пропагандируемой Международным союзом против рака (седьмое издание) [42]. Основные характеристики включенных в исследование пациентов приведены в таблице 4. Протокол исследования соответствовали этическим руководящим принципам Хельсинкской декларации (1975 г.). Исследование было одобрено этическим комитетом Первой филиал больницы, медицинской школы, Zhejiang University. Письменное информированное согласие было получено от всех участников, участвующих в исследовании.
Антитела
<р> кроличьи поликлональные антитела против P-Smad2C (сер 465/467), P-Smad3C (сер 423/425), P-Smad2L (сер 250/255), и P-Smad3L (сер 208/213) были описаны в предыдущих исследованиях [43], [44]. Мышиного антитела против человеческого α-SMA (M0851), поликлональные анти-УЛИТКА (AB-17732), и моноклональные анти-коллаген I (C2456) антитела были приобретены у Dako, Abcam и Sigma соответственно.
иммуногистохимии (IHC )
<р> После рассмотрения H &Amp; E-запачканные слайды из 130, зарегистрированных пациентов с раком желудка, представительные парафиновые блоки для каждого пациента были отобраны для секции. Срезы deparaffinised в ксилоле и повторно гидратируют в серии разведений градуированного этанола в дистиллированной воде. Антиген поиска проводили путем микроволновой обработки в буфере ЭДТА (1 ммоль, рН 8,0). Срезы затем обрабатывали 3% H <суб> 2O <подразделам> 2 в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания PBS три раза, предметные стекла инкубировали с кроличьей поликлональной антителом против Р-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (1:50), P-Smad3L (1:50 ), и α-SMA (1:200) соответственно при 4 ° С в течение ночи. На следующий день, слайды промывали PBS, трижды. После промывания их инкубировали с Энвисион пероксидазы (Dako), меченным анти-кроличий или антитело анти-мышь в течение 1 ч при комнатной температуре. Активность пероксидазы была обнаружена с диаминобензидино (DAB). Срезы контрастному окрашиванию гематоксилином. Иммунореактивности визуализировали при световой микроскопии
<р> Для полуколичественного анализа, окрашенные срезы ткани оценивали по 4-балльной шкале следующим образом: подсчет положительных клеток, классы 0-3 (0, никаких положительных клеток; 1, &л.; 25% положительных клеток, 2, 25% -50% положительных клеток; 3, > 50% положительных клеток); Интенсивность положительного окрашивания, 1-3 сортов (1, слабое положительное окрашивание, как правило, желтого, 2, сильное положительное окрашивание, как правило, коричневый, 3, очень сильное положительное окрашивание, как правило, темно-коричневого до черного). Окончательный счет иммунного окрашивания рассчитывали как количество × интенсивности.
Иммунофлуоресценции окрашивание
<р> Слайды были deparaffinised в ксилоле и регидратации в градуированной этаноле до дистиллированной воды. Затем антиген поиска проводили путем микроволновой обработки в буфере ЭДТА (1 ммоль, рН 8,0). Срезы затем обрабатывали 3% H <суб> 2O <подразделам> 2 в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания PBS, как первичными антителами, кроличьими анти-P-Smad3C /Snail и мыши анти-a-SMA /коллаген I, были применены при 4 ° С в течение ночи. Затем, вторичные антитела, Alexa633-кроличий анти-мышиного иммуноглобулина G и Alexa488-осла анти-кроличьим иммуноглобулином G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Германия), применялись в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы были смонтированы с использованием Dako-Cytomation Fluorescent гистологическая среда. Слайды были осмотрены и фотографии были сделаны на конфокальной микроскопии (Leica, Heidelberg). Разделы без первичных антител использовали в качестве отрицательного контроля.
ПЦР в реальном времени
<р> Общую РНК очищали от желудочных тканей с высокой чистоты набора для выделения РНК (Roche Диагностическое GmbH, Mannheim, Германия) в соответствии с протоколом производителя, а концентрация была измерена спектрофотометрически. кДНК синтезировали из 1 мкг РНК с Стрэнд кДНК синтеза набора Transcriptor First (Roche Diagnostics). Количественная ПЦР в реальном времени проводили с ABIPrism 7700 системы обнаружения последовательности (Applied Biosystems) с использованием TaqMan универсальный Master Mix ПЦР Нет AmpErase Ун (часть нет. 4324018). Были использованы следующие экспрессии генов анализы: Smad2 (вперед: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; обратное: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (вперед: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; обратное: GAAGGCGAACTCACACAGC) и peptidylprolyl изомеразы A (ген домашнего хозяйства, часть нет Mm02342429_g1..). Все реагенты были куплены у Applied Biosystems. Образцы в трех экземплярах при следующих условиях: начальная денатурация в течение 2 мин при 50 ° С и в течение 10 минут при 95 ° С с последующими 40 циклами по 15 с при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С. Уровни экспрессии генов в каждом образце определяли с помощью сравнительного порогового цикла методом.
Статистический анализ
<р> Чтобы оценить связь между выбранными иммуногистологических маркеров и параметров опухоли, Кендалла-тау ранговой корреляции анализ проводили с использованием SAS версии 9.2 (Cary, NC, USA). A р
&л;. 0,05 считалось статистически значимым
Крупное исследование показало, что вирусная нагрузка SARS-CoV-2 самая низкая у детей
Определение кислотонейтрализующей способности безрецептурных антацидов
Растительная диета может вылечить ревматоидный артрит
Лейкоциты и их роль в головном мозге
Микробиом легких предсказывает тяжесть заболевания COVID-19
Антиоксиданты в рационе могут повысить риск рака кишечника.
Новое исследование определяет связь между микробиомом кишечника и инсультами.
Недавнее исследование, проведенное в клинике Кливленда, демонстрирует влияние диеты с высоким содержанием холина, который часто содержится в большом количестве в красном мясе и яичных желтках, и триме
Ограничения COVID-19 привели к 86-процентному снижению числа норовирусных инфекций в США,
находит исследование Начало пандемии COVID-19 привело к введению нескольких нефармацевтических вмешательств (НПИ) по всему миру. В то время как граждане США недовольны советом носить маски в обществен
Сырой корм для домашних животных представляет опасность для людей и животных
В новом исследовании исследователи обнаружили, что домашние собаки и кошки, потребляющие сырое мясо, могут передавать людям штаммы устойчивых к антибиотикам бактерий. Их исследование под названием «Ди