PLoS ONE: sumažėjęs Active SMAD2 koreliuoja su blogos prognozės skrandžio Cancer

Anotacija

Fonas

TGF-β vaidina dvigubą vaidmenį žmogaus vėžio progresavimą. Per ankstyvosiose stadijose Kancerogeninis, TGF-beta funkcijų kaip naviko slopintuvas. Per etapus auglių vystymuisi, tačiau, TGF-β gali skatinti naviko augimą ir metastazes. A Smad2 /3 fosforilinimo perėjimas nuo karboksi galo į LINKER svetainių yra svarbiausias įvykis nustatant biologinius funkciją TGF-beta gaubtinės ir tiesiosios žarnų ir kepenų ląstelių karcinoma. Šioje studijoje, mes ištirti galimą vaidmenį diferencinę Smad2 /3 fosforilinimo skrandžio adenokarcinoma.

Metodologija

imunohistocheminį dažymo su anti-P-Smad2 /3C ir P-Smad2 /3L antikūnų buvo atlikta 130 parafino įterptųjų skrandžio adenokarcinoma egzempliorių. buvo analizuojami tarp P-Smad2 /3C ir P-Smad2 /3L imunohistocheminio balo ir clinicopathologic charakteristikas pacientų santykiai. Realaus laiko PGR buvo naudojamas matuoti iRNR išraišką Smad2 ir Smad3 vėžį ir aplinkinių ne naviko audinį.

pagrindinis išvados

Ne reikšmingas P Smad2L ir /arba P-Smad3L teigiamas dažymo buvo aptikta egzempliorių balsų dauguma (teigiamas dažymo ir 18/130 mėginių). Teigiamas P Smad2 /3L dažymo nebuvo susijęs su į carboxyterminal fosforilinimo dažymo sumažėjimas. Praradimas P-Smad2C nepaprastai koreliuoja su gylio naviko infiltracijos ir prastos diferenciacijos vėžinių ląstelių pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Nėra koreliacijos buvo aptikti tarp P-Smad3C ir clinicopathologic charakteristikas skrandžio adenokarcinoma. Tačiau bendrai dažymo analizė atskleidė, kad P-Smad3C bendrai lokalizuota su alfa-SMA ir kolageno I skrandžio vėžio ląsteles, o tai rodo galimą ryšį tarp P-Smad3C ir epitelinės-to-mezenchimos perėjimo vėžio. Realaus laiko PGR parodė sumažėjusį iRNR išraišką Smad2 skrandžio vėžiu, lyginant su aplinkinėmis ne naviko audinio 15/16 pacientams.

Išvados

praradimas P-Smad2C sandariai koreliuoja su vėžio invazijos ir prasta diferenciacija skrandžio vėžio. Priešingai žarnos ir kepenų ląstelių karcinoma, kanoninės karboksi-terminalas fosforilinimo, bet ne LINKER fosforilinimas, iš Smad2 yra labai svarbus skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Vu Y Li Klausimas Zhou X, J. J Mu Y Munker S, ir kt. (2012) sumažėjęs Active SMAD2 koreliuoja su blogos prognozės skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (4): e35684. Doi: 10,1371 /journal.pone.0035684

redaktorius: Javier S. Castresana, Navaros universitetas, Ispanija

Įstojo: Vasaris 6, 2011 m Priėmė: Kovo 20, 2012 m Paskelbta: Balandžio 23, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 VU et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. The tyrimą parėmė sveikatos biuras, Zhejiang Province, Kinija, 2009A065 (YJW); Kita-Kröner Fresenius (H.L.W., Š.D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L "Virtualus kepenų" ir "ląstelių terapija" 01GN0987 (Š.D.); "Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (Š.D.) ir LA997 /5-1 (Š.D.); ir Dietmaras Hopp Stiftung GmbH "(Š.D.). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių pasaulyje, reitingą sekundę vyrams ir ketvirtas moterims dažnis [1]. Skrandžio vėžio patogenezę yra susijęs su daugeliu veiksnių. Tarp jų reguliacijos sutrikimas signalizacijos būdus, susijusius su vystymosi procesams, įskaitant transformuojantis augimo faktorius-ß (TGF-beta), WNT /β-kateninai, ežys ir Notch signalizacijos, vaidina pagrindinį vaidmenį plėtojant ir progresavimo šio [2] vėžiu.

TGF-β šeimos molekulių, įskaitant TGF- izoformų, activins ir kaulų morfogenezės baltymai (BMP), turi svarbias funkcijas įvairių fiziologinių ir patofiziologinių procesų, pvz embriono vystymasis, autoimuninės ligos, fibrozės ir vėžys [3], [4]. TGF-β transduces savo signalus skatinant susidarymo heteromerinio kompleksų TGF- I tipo (TGF-βRI) ir II tipo diabetą (TGF-βRII) serino /treonino kinazės receptorių. Aktyvuotas TGF-βRI propaguoja signalizacijos iki įdarbinimo ir fosforilinimo receptorių reguliuojama-Smads (R-Smads, įskaitant Smad2 ir Smad3). Fosforilinimo C-galinių serino likučių R Smads yra esminis žingsnis kanoninės TGF- signalizacijos. Dvi labiausiai, C-terminalų serino likučius serino 465/467 in Smad2 ir serino 423/425 in Smad3 fosforilinarai kartu su trečiąja ne fosforilinto serino liekana, sudaro evoliuciškai konservatyvius SSXS motyvas visose R Smads [5], [6]. Be to, C-galinių fosforilinimo Smad2 /3 (P-Smad2C ir P-Smad3C) iki TGF-βRI, kitų kinazės, pavyzdžiui, c-Birželio N-terminalas kinazės (JNK) ir RAS-susijusios kinazės, priežastis fosforilinimas R Smads ne saistyklės svetainių visame serino 249/254 į Smad2 ir serino 208/213 į Smad3 (P-Smad2L ir P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforilinamos R-Smads sudaro kompleksą su bendru SMAD (CO-SMAD; Smad4 žinduolių) ir maršrutinis autobusas į branduolį už taikinio geno transkripcijos [3]. Be to R-SMAD ir bendradarbiavimo SMAD, trečiasis tipo SMAD baltymų yra inhibitorių SMAD (I-SMAD; Smad6 ir Smad7). I-Smads yra transkripciškai sukeltas TGF-beta, o tai rodo neigiamą grįžtamojo ryšio mechanizmas šio signalinio kelio [4].

TGF-β vaidina dvigubą vaidmenį žmogaus vėžio progresavimo [9], [10] , Į ankstyvosiose stadijose vėžio, TGF-beta veikia kaip naviko slopintuvas, slopindamas ląstelių proliferaciją arba skatinant ląstelių apoptozę. Tačiau vėlesniuose etapuose, TGF-β palaiko naviko progresavimą, pavyzdžiui, vėžinių ląstelių invaziją, sklaidos ir imuninės slėpimu [9]. Be to, TGF-β yra gerai pripažintas epitelio-to-mezenchimos perėjimo (EMT) tarpininko vėžio [11]. Nors pasipiktinimas TGF-β /SMAD signalizacijos yra pagrindinis kancerogenezėje daugelyje organų, jo naviko skatinti rezultatus yra labai konteksto priklauso. Pavyzdžiui, TGF-β signalizacijos yra lemiama vėžio kamieninių ląstelių savęs atnaujinimo ir tumorogeniškas veiklos glioma ir leukemija priežiūros, o TGF-beta signalizacijos poveikis krūties vėžio kamieninių ląstelių yra prieštaringas [12]. Vienas tyrimas parodė, kad blokuoja TGF- kelią per dominuojančia neigiamas TGF-βRII padidina krūties kamieninių ląstelių dydį ir skatina tumorigenezei, nurodant krūties kancerogenezėje šio citokino [13] kritimą. Priešingai, Mani ir jo kolegos nustatė, kad TGF- kelią mums kritiškai krūties vėžio kamieninių ląstelių kaip savybių ir tumorogeniškas veiklos priežiūrą per skatinančius EMT [14].

skrandžio vėžio, vieno nukleotido polimorfizmas ( SNP) TGF-beta yra susijęs su jautrumu I etapas ir skrandžio vėžio [15] II etapo [16]. buvo pranešta, kad serume TGF-beta gerokai koreliuoja su venų invazijos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu [17]. Tačiau išsamios mechanizmai TGF-beta signaliniai skrandžio vėžio progresavimo vis dar nežinoma. Be to, lieka neaišku, kada ir kaip TGF-β transformuoja iš naviko slopintuvas į naviko promotoriaus kancerogenezėje metu.

Neseniai į fosforilinimo Smad2 /3 perėjimas nuo C terminalo saistyklės svetainių buvo įrodyta, svarbus įvykis nustatant biologinius funkciją TGF-beta vėžiu [18], [19], [20]. Ankstesni tyrimai remiantis 12 metų tolesnių parodė, kad lėtinio HBV /HCV pacientams, sergantiems P-Smad2 /3L kepenų audiniuose turėjo didesnę riziką Sparčiai kepenų ląstelių karcinoma (HCC), nei su P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Būti suderinami su HCC išvadas, panašūs stebėjimai buvo atlikti storosios žarnos vėžio [7], [22].

Jei išnagrinėti diferencinę SMAD fosforilinimo link kancerogenezėje skrandžio vėžio indėlį, mes ištirti P Smad2 /3C ir P-Smad2 /3L lygiai 130 pacientams, sergantiems skrandžio adenokarcinoma imunohistocheminiu (IHC). Tyrėme potencialius koreliacijas tarp skirtingų vietų fosforilinimo R-Smads ir invazija, limfmazgių metastazių, diferenciacija, ir stadijos skrandžio vėžio.

Rezultatai

saistyklės fosforilinimas Smad2 /3 nėra susijęs su skrandžio vėžio

priešingai nei ankstesnių tyrimų išvadas iš tiesiosios žarnos vėžiu ir HCC [7], [8], [21], [22], mes neaptiko reikšmingas P Smad2L ir /arba P-Smad3L teigiamas dažymo skrandžio audinių pacientų, sergančių skrandžio vėžiu. Tik 18 iš 130 pacientų parodė, p Smad3L teigiamą dažymo daugiausia ne vėžinių ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad jungtį fosforilinimo serino svetainėse Smad2 /3 nėra kritinė skrandžio vėžio.

Įvairios funkcijos P-Smad2C ir P-Smad3C lygių skrandžio vėžio

118 iš 130 skrandžio audiniai parodė P-Smad2C teigiamas dažymo, ir 91 iš 130 skrandžio audiniai buvo teigiami P Smad3C dažymo atitinkamai. Skirtingai nuo P-Smad2C teigiamą dažymo, kuris buvo vaizduojamas tik normaliomis ir vėžinių ląstelių branduoliuose (1A pav.), Kad P-Smad3C teigiamas dažymo buvo įrodytas branduolio (59/130, 1B pav.), Tuo membraną ir /arba citoplazmoje (73/130, pav. 1c) skrandžio vėžio ląsteles. Be to, kad P-Smad3C buvo matyti teigiamą dažymo ir fibroblastų aplinkinių vėžinės ląstelės (81/130 ir 91/130, pav. 1D).

Sumažintas P Smad2C nepaprastai koreliuoja su naviko gylis (T) ir diferenciacijos vėžio (G), pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu

matuojamas p Smad2C IHC dažymo ne tik naviko, bet ir aplinkinių ne navikų audiniuose iš 130 pacientų, sergančių skrandžio vėžiu. P-Smad2C teigiamas dažymo vienu vėžio ar normalios ląstelės atvirkščiai koreliuoja su diferenciacijos skrandžio vėžiu (tiek p
< 0,0001 1 lentelę). Be to, sumažėjo P-Smad2C IHC rezultatą į vėžio ląsteles tarpusavyje susijusių su naviko gylio ( P
< 0,05, 1 lentelė). P-Smad2C lygiai normalaus audinio taip pat parodė galimą atvirkštinė koreliacija su vėžio invazijos šių pacientų ( P
= 0,07, 1 lentelė). P-Smad2C IHC rezultatas buvo žymiai sumažėjo vėžinių audinių, palyginti su ne vėžinių audinių 77 iš 130 pacientų, sergančių skrandžio vėžiu. Be to, per navikų audiniuose, vėžinės ląstelės su blogai atipijos parodė sumažėjo P Smad2C dažymo, lyginant su gerai diferencijuotų tie (2 pav.). Kendall-tau koreliacinė analizė atskleidė galimą ryšį tarp mažinimo P Smad2C dažymo ir perėjimo nuo normalu vėžinių ląstelių skrandžio vėžys ( P
= 0,05, 2 lentelė), o tai rodo, kad Smad2 signalizacijos aktyvavimas yra kritiškai slopintuvas navikų susidarymo ir progresavimą.

p-Smad3C dažnai randamas vėžiu susijęs fibroblastų

p-Smad3C IHC rezultatas neparodė reikšmingos koreliacijos su T /N /g /S skrandžio vėžio mėginiai (1 lentelė). Tačiau, kad P-Smad3C teigiamas dažymo dažnai pasireiškė fibroblastų aplinkinių vėžines ląsteles pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu (1 pav.).

Vėžio ląstelės yra epitelio kilmės ir nereikia išreikšti mezenchiminių žymekliai, pvz alfa-SMA ir kolageno I. Jei vėžinės ląstelės išreiškia mezenchiminių žymekliai, tai galvoti apie epitelio-to-mezenchimos perėjimo (EMT) [11]. Šioje studijoje, mes nustatėme, α-SMA teigiamą dažymo vėžiu ląstelių 54 130 pacientų, sergančių skrandžio vėžiu (3 pvz pacientas-1 pav.). Norėdami išsiaiškinti galimą ryšį tarp p-Smad3C ir EMT, mes ištirti ryšį tarp p Smad3C dažymo (vėžio ir aplinkinių ne vėžio audinyje) ir α-SMA teigiamą dažymo koreliaciją į vėžines ląsteles. Kendall-tau rangas koreliacijos koeficientai tarp p Smad3C IHC balai vėžio /aplinkiniai ne vėžys audinių ir α-SMA IHC balai vėžio 0,14 ( P
= 0,08) ir -0,09 ( P
= 0.99), atitinkamai (3 lentelė). Norėdami patvirtinti EMT šiems pacientams, mes atliekame bendradarbiavimą dažymas, sraigė, kita konkretaus žymens EMT ir kolageno I /α-SMA skrandžio audinius. Confocal mikroskopija parodė, bendro-lokalizacijos sraigė ir kolageno I (4A pav.) /Α-SMA (4B pav.) Kai kuriais skrandžio vėžio ląsteles. Šie α-SMA teigiami skrandžio vėžio ląstelės, taip pat rodomas p-Smad3C teigiamą dažymo (4C pav.). Be bendradarbiavimo lokalizavimo su α-SMA teigiamų skrandžio vėžio ląsteles, Confocal mikroskopija parodė, kad P-Smad3C bendrai lokalizuota su kolageno I skrandžio vėžio ląstelių (pav. 4d). Be to, P-Smad3C teigiamas dažymo bendrai lokalizuota su alfa-SMA ir kolageno I ne tik vėžinių ląstelių, bet taip pat ir fibroblastų (pav. 4C-4d). Šie rezultatai rodo, kad P-Smad3C gali prisidėti prie EMT skrandžio vėžio kai kuriems pacientams.

netekimas viso Smad2 ir Smad3 išraiškos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu

Be matavimo P-Smad2 skrandžio vėžio mes naudojome realaus laiko PGR aptikti iRNR išraišką Smad2 ir Smad3 skrandžio vėžio ir aplinkinių ne navikų audiniuose iš 16 pacientų. 15 ir 12 pacientų, atitinkamai įrodyta, sumažėjo iRNR išraiška Smad2 ir Smad3 vėžiu audinių, kai, palyginti su normalių aplinkinių audinių (5 pav.). Šie rezultatai rodo, kad ne tik aktyvuota Smad2 bet ir iRNR raiška viso Smad2 sumažėja per skrandžio kancerogenezėje.

Diskusijos

tiesiosios žarnos adenokarcinoma ir HCC, A fosforilinimo perėjimas nuo karboksi-gale į jungiančios regionai buvo pasiūlyta kaip kritinės įvykio, susijusio su TGF-beta perėjimas nuo vėžio slopintuvas į onkogeninių faktorius [8], [18], [19], [20], [21], [22]. Šiame tyrime mes išnagrinėjo šį galimą asociaciją skrandžio vėžio. Neaptikome reikšmingų P Smad2L ir P-Smad3L lygiai 130 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. 112 iš 130 pacientų, neparodė P-Smad2L arba P-Smad3L dažymo skrandžio vėžio ląstelių, tai rodo, kad siūlomas poslinkis fosforilinimo R-SMAD negali prisidėti prie TGF- medijuojamos kancerogenezės į šios vėžio rūšies. Skirtingai P-Smad2 /3L, tiek P-Smad2C ir P-Smad3C teigiamas dažymo buvo aptiktas Daugumai pacientų su skrandžio vėžiu. Kendall-tau rangas koreliacinė analizė atskleidė, kad P-Smad2C IHC rezultatas atvirkščiai koreliuoja su gylio naviko (T) ir diferenciacijos vėžiu (G).

iš Smad2 vaidmuo formuojant ir progresavimo skirtingų vėžio rūšies metu išlieka kontraversiškas , Atitinka dabartinę išvada, ankstesni tyrimai stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma, krūties vėžio ir storosios žarnos vėžio parodė, kad nuostoliai Smad2 išraiškos koreliuoja su naviko vystymąsi ir blogos prognozės [23], [24], [25], [26]. Neseniai Hoot ir jo kolegos nustatė, kad Smad2, bet ne Smad3, buvo dažnai prarado 83 pacientai, sergantys odos plokščiųjų ląstelių karcinoma. Be to, pelės, kurių keratinocitų konkrečių Smad2 ištrynimą rodomas skubos formavimas ir piktybinių progresavimą chemiškai sukeltų pelės odos navikų, palyginti su laukinio tipo pelių [27]. Tačiau iš 52 pacientų, sergančių glioma tyrime teigiama P Smad2 IHC rezultatas buvo pranešta, kad jie koreliuoja su dauginimusi gliomose ir blogos prognozės [28]. Prieš šio tyrimo Sintoistas ir kolegos matuojamas P Smad2C dažymą 135 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Jie nustatė, kad P-Smad2C lygis buvo didesnis blogai diferencijuotas vėžys, lyginant su gerai diferencijuotų tie [29]. Tai dar neaišku, kodėl yra visiškai priešingi rezultatai skrandžio vėžio.

kanoninės TGF- signalizacijos, aktyvuotos TGF-βRI paprastai sukelia karboksi-terminalas fosforilinimo tiek Smad2 ir Smad3. Aktyvuotas Smad2 ir Smad3 žaisti skirtingus vaidmenis ląstelių augimo, diferenciacijos ir kitų biologinių funkcijų [30]. Kepenyse, Smad2 yra kritinė tarpininkavimo hepatocitų augimo ir diferenciacijos, o Smad3 vaidina svarbų poveikį morfologinės ir funkcinės brendimo kepenų Žvaigždėtasis ląstelių [31], [32]. Be vėžio, tai prieštaringas ar sutrikdymas iš Smad3 geno prisideda prie Tumorigenesis. Zhu pranešė, kad Smad3 trūkumas pelių plėtoti storosios žarnos karcinoma [33]. Tačiau kiti tyrimai, naudojant Smad3 trūkumas pelėms pasiūlė, kad Smad3 nuostoliai vien nepakanka inicijuoti tumorigenezei [34], [35], [36], [37]. Skrandžio vėžio, Han rasti žemą Smad3 3 iš 8 pacientams ir devynių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų [38]. Įvedimas Smad3 vektorių į skrandžio ląstelių linijų atkurta TGF- reaguoti. Be to, injekcijos Smad3 ekspresija skrandžio ląsteles į nuogas pelėmis parodė atidėtas tumorigenezei lyginant su kontroline grupe, nurodant praradimo Smad3 koreliaciją su kancerogeninio poveikio [38]. Šioje studijoje neradome reikšmingą koreliaciją tarp P Smad3C dažymo skrandžio vėžio ląsteles ir vėžio invazijos, diferenciacijos ir stadijos. Skiriasi nuo P-Smad2C, kuri yra tik išreikštą branduolyje ląstelių, P-Smad3C teigiamas dažymo yra aptinkama branduolio, tuo membranos ir skrandžio vėžio ląstelių citoplazmoje. Biologinis aktualumas skirtingų modelių P-Smad3C dažymo ir vėžinių ląstelių šiuo metu dar nežinoma.

EMT vėžinių ląstelių yra būtina vyksta pažangių metastazavusiu navikų [11]. Buvo pripažinta, kad TGF-β yra pagrindinis žaidėjas EMT. Smad3, bet ne Smad2, yra pagrindinis tarpininkas TGF-beta priklausomo EMT [39]. Pavyzdžiui, TGF-β nepavyksta sukelti EMT pradinėse kanalėlių epitelio ląstelių, gautų iš inkstuose Smad3-stokojančių pelių [40]. Slopinimas TGF- signalizacijos iki Ki26894, TGF-βRI inhibitorių, sumažėjo invazija ir EMT iš Tarpikliai skrandžio vėžio in vitro
[41]. Mūsų rezultatai rodo, kad dalis skrandžio vėžio ląstelių išreikšti EMT žymekliai, pavyzdžiui, Sraigė, aš kolageno ir α-SMA. Bendras lokalizacija P-Smad3C su alfa-SMA /kolageno I randama didelėje pogrupyje pacientų. Be to, α-SMA teigiamas dažymo vėžiu ląstelių turi galimą koreliaciją su P-Smad3C IHC rezultatas vėžinių ląstelių, bet ne aplinkinių ne tik vėžio audiniuose. Šie rezultatai rodo, kad P-Smad3C gali vaidinti svarbų vaidmenį EMT skrandžio vėžio.

Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kad Smad2 yra svarbus tarpininkas ginti skrandžio ląsteles nuo pereitų prie prastai diferencijuotas vėžys. Pagal mūsų rezultatus, Smad3 nėra tiesiogiai susijusi su charakteristikomis skrandžio vėžiu, tačiau, mūsų duomenys rodo, kad jis gali vaidinti svarbų vaidmenį vėžio susijęs fibroblastų ir EMT skrandžio vėžio ląsteles.

Metodai

pacientai

Chirurginiai egzemplioriai buvo tiriami nuo pacientams, sergantiems pirmine skrandžio vėžiu generalinio chirurgijos skyrius, Pirmasis Susijusi ligoninė, medicinos mokykla, Zhejiang universiteto, Kinija nuo 2003 iki 2009. skrandžio audinio egzempliorius buvo renkami, kai operacijos išpjaustytų skrandžio vėžys. Surinkti audiniai įtraukti auglį ir aplinkinių ne auglio sritis (audiniai bent jau daugiau nei 5 cm toli nuo naviko). Iš audinių dalis fiksuota 4% formaldehido ir įdėta į parafino už histologiją ir IHC matavimo. Liko švieži audiniai buvo nedelsiant įdėti į skysto azoto iRNR matavimo. Nuo 130 suporuotas skrandžio audinių, įskaitant vėžį ir aplinkinių ne navikų audiniuose viso dalyvavo. Patologinė diagnozė ir klasifikacijas buvo apskaičiuota atsižvelgiant į naviko mazgas metastazės (TNM) klasifikaciją pasisakė Tarptautinės Sąjungos prieš vėžį (septintoji laida) [42]. Pagrindinės charakteristikos pacientu yra parodyta 4 lentelėje Tyrimo protokolas atitiko etikos gairių Helsinkio deklaracijoje (1975). Tyrimas patvirtino etikos komitetui pirmasis filialas ligoninė, medicinos mokyklos, Zhejiang universiteto. Rašytiniai informuoti sutikimai gauti iš visų tyrime dalyvavusių dalyvių.

Antikūnai

Triušis polikloniniai antikūnai prieš P-Smad2C (ser 465/467) P-Smad3C (SER 423/425) P-Smad2L (SER 250/255) ir P-Smad3L (SER 208/213) buvo aprašyta ankstesniuose tyrimuose [43], [44]. Pelės anti-žmogaus α-SMA (M0851), polikloninis kovos su SRAIGĖ (AB-17732) ir monokloninis anti-kolageno I (C2456) antikūnai buvo įsigytas iš DAKO, Abcam ir Sigma atitinkamai.

imunohistocheminis (IHC )

Po peržiūros H & E-tamsintas skaidres iš 130 dalyvavusių pacientų, sergančių skrandžio vėžiu, atstovaujančios parafino blokus kiekvienam pacientui buvo atrinkti skyriuje. Skaidrės buvo deparaffinised į ksileno ir rehidrataciją skiedimo serijos rūšiavo etanolio distiliuotu vandeniu. Antigenas paieška buvo atlikta pagal mikrobangų gydymui EDTA buferinio tirpalo (1 mmol, pH 8,0). tada skaidres buvo gydomi 3% H _{2O 2 30 min kambario temperatūroje. Po plovimo su PBS tris kartus, skaidres buvo inkubuojamos su triušio polikloninio antikūno prieš P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (1:50 ), ir α-SMA (1:200) atitinkamai, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Kitą dieną, skaidres buvo plaunamos PBS, tris kartus. Po plovimo, jie buvo inkubuojamos su EnVision peroksidazės (Dako) žymėto anti-triušiai arba anti-pelės antikūno 1 h kambario temperatūroje. Peroksidazės aktyvumas buvo aptiktas su diaminobenzidinu (DAB). Skaidrės buvo counterstained hematoksilinu. Reaktyvumas buvo ryškinamos pagal šviesos mikroskopijos}

pusiau kiekybiniai testo analizę, tamsintas audinio skyriai buvo vertinami ne 4 balų skalę taip: teigiamų ląstelių skaičius, 0-3 rūšių (0, jokių teigiamų ląstelių; 1, <.; 25% teigiamos ląstelės; 2, 25% -50% teigiamos ląstelės; 3, > 50% teigiamos ląstelės); intensyvumas teigiamą dažymo, rūšių 1-3 (1, silpnas teigiamas dažymo, paprastai geltonos spalvos; 2, stiprus teigiamas dažymo, paprastai rudi; 3, labai stiprus teigiamas dažymo, paprastai giliai rudos iki juodos). Galutinis imuninė dažymo rezultatas buvo apskaičiuojamas skaičius × intensyvumo.

imunofluorescenciniam

skaidres buvo deparaffinised į ksileno ir rehidratuoti rūšiavo etanolio iki distiliuotu vandeniu. Tada, antigeno paieška buvo atlikta pagal mikrobangų gydymui EDTA buferinio tirpalo (1 mmol, pH 8,0). tada skaidres buvo gydomi 3% H _{2O 2 30 min kambario temperatūroje. Po plovimo su PBS, tiek pirminių antikūnų, triušių anti-P-Smad3C /sraigė ir pelės anti-alfa-SMA /kolageno I, buvo taikomi 4 ° C temperatūroje per naktį. Tada antriniai antikūnai, Alexa633-triušio prieš pelės imunoglobulino G ir Alexa488-asilas kovos su triušio imunoglobulino G (molekuliniai zondai /Invitrogen, Karlsruhe, Vokietija), buvo taikomos 30 min kambario temperatūroje. Mėginiai buvo montuojamas naudojant Dako-Cytomation Fluorescent montavimo Medium. Skaidrės buvo tikrinami ir fotografuota ant mikroskopas (Leica, Heidelbergas). Atkarpose be pirminių antikūnų buvo naudojami kaip neigiamos kontrolės.}

Realaus laiko PGR

RNR buvo išvalytas nuo skrandžio audinių su vyriausiąja Pure RNR išskyrimo rinkinys ( "Roche diagnostikos GmbH, Manheimas, Vokietija) pagal gamintojo protokolą, ir koncentracija buvo matuojamas spektrofotometru. kDNR buvo sintetinamas iš 1 mikrogramų RNR su Transcriptor First Strand kDNR sintezės Kit (Roche Diagnostics). Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama su ABIPrism 7700 seka aptikimo sistemos (Applied Biosystems) naudojant TaqMan universalus PGR pagrindinį mišinį Nėra AmpErase ung (dalis 4.324.018 Nr.). buvo naudojami šie genų ekspresijos tyrimai: Smad2 (pirmyn: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; Reversas: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (pirmyn: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; Reversas: GAAGGCGAACTCACACAGC) ir peptidylprolyl izomerazę A (namų ruošos genas, dalis ne Mm02342429_g1..). Visi reagentai buvo įsigytas iš "Applied Biosystems. Mėginiai buvo paleista tris kartus pagal šias sąlygas: pradinį denatūraciją 2 minutes 50 ° C ir 10 minučių 95 ° C temperatūroje ir po 95 ° C temperatūroje 40 ciklų 15 s ir 1 minutę, esant 60 ° C temperatūroje. Genų ekspresijos lygis kiekviename mėginyje buvo nustatyta su lyginamosios ciklas slenksčio metodu.

Statistinė analizė

Jei įvertinti ryšį tarp pasirinktų immunohistological žymekliai ir naviko parametrų, Kendall-tau rangas koreliacinė analizė buvo atlikta naudojant SAS versija 9.2 (Cary, NC, JAV). P
. ≪ 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

• PLoS ONE: Klinikinis potencialas DNR metilinimas skrandžio vėžiu: metaanalizė
• PLoS ONE: geografinį pasiskirstymą LGR5 + ląstelių koreliuoja su skrandžio vėžio progresavimo