PLoS ONE: Пространственное распределение LGR5 + клеток коррелируют с раком желудка Progression

Абстрактный

В этом исследовании мы тестировали распространенность, histoanatomical распределение и опухолевый биологическое значение целевого белка и маркера стволовых раковых клеток LGR5 Wnt в опухоли желудочно-кишечного тракта человека. Изучена Дифференциальная экспрессия LGR5 на транскрипционном (в режиме реального времени полимеразной цепной реакции) и уровня поступательные (иммуногистохимия) в злокачественных и соответствующих доброкачественных тканей 127 больных, включающий шесть различных участков первичной опухоли, то есть пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы, толстой кишки и прямую кишку. Изучено клинико-патологическая значение выражения LGR5 у 100 пациентов с желудочной карциномой (GC). Неопухолевых ткани обычно питали лишь очень немногие разбросанные LGR5 ^{+ клеток. Соответствующие карциномы пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы, толстой и прямой кишки показали значительно больше LGR5 + клеток, а также значительно более высокие уровни LGR5-мРНК по сравнению с соответствующим неопухолевых ткани. Двойные эксперименты окрашивания выявили коэкспрессия LGR5 с предполагаемыми маркеров стволовых клеток CD44, Musashi-1 и ADAM17. Далее мы проверили гипотезу о том, что последовательные изменения желудочного канцерогенеза, т.е. хронический атрофический гастрит, кишечная метаплазия и инвазивной карциномы, которые связаны с перераспределением в LGR5 + клеток. Интересно, что пространственное распределение LGR5 изменилось: в неопухолевых слизистой оболочки желудка, LGR5 + клетки были обнаружены преимущественно в области слизистой шеи; в кишечной метаплазии LGR5 + клетки были локализованы в крипт основания, и в GC LGR5 + клетки присутствуют на поверхности полостной, в центре опухоли и фронт вторжения. Выражение LGR5 в центре опухоли и инвазии перед ГХ достоверно коррелирует с ростом локальной опухоли (Т-категории) и узловой распространения (N-категории). Кроме того, у пациентов с LGR5 + ШС имели меньшую медианы выживаемости (28,0 ± 8,6 мес), чем у пациентов с LGR5 - ГКС (54,5 ± 6,3 месяца). Наши результаты показывают, что LGR5 дифференциально экспрессируется в желудочно-кишечных раковых заболеваний и что пространственное распределение histoanatomical LGR5 + клеток следует учитывать при их опухоли биологическое значение ищется
<р> Образец цитирования:. Simon E, Petke D, Böger C, Беренс HM, Warneke V, Эберт М., и др. (2012) Пространственное распределение LGR5 + клеток коррелируют с прогрессированием рака желудка. PLoS ONE 7 (4): e35486. DOI: 10.1371 /journal.pone.0035486
<р> Редактор: Ирина В. Лебедева, Enzo Life Sciences, Inc., Соединенные Штаты Америки
<р> Поступила 5 июля 2011 года; Принято: 16 марта 2012 года; Опубликовано: 18 апреля, 2012
<р> Copyright: © 2012 Simon и соавт. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются}

Финансирование:. Эти авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Желудочно-кишечные раки являются одними из наиболее распространенных злокачественных опухолей и ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1], [2]. Причины для бедных прогнозов являются сложными: многие виды рака желудочно-кишечного тракта диагностируется на поздних стадиях за исключением медицинского лечения, не существует надежных опухолевых маркеров, которые могут позволить ранней диагностики или скрининга групп высокого риска. Варианты лечения ограничены в местно-распространенным и метастатическим, и значительное число опухолей рецидивируют несмотря на первоначальный терапевтический ответ [3]. Предполагаемое объяснение неэффективной терапии является наличие раковых стволовых клеток (CSC). Гипотеза CSC постулирует, что опухоль представляет собой конгломерат популяций гетерогенных клеток. Только субпопуляции этого конгломерата сохраняет способность образования колоний, и, следовательно, рецидивов и метастазирования. ОКК более устойчивы к химиотерапии, что приводит к рецидиву опухоли, прогрессии и смерти, в конечном счете пациента [4], [5]. В то время как CSC-модель все более широкое признание, идентификация и подтверждение так называемых маркеров стволовых клеток в родной ткани человека трудно и в значительной степени отсутствует. В последнее время богатого лейцином, G-белком рецептор (GPCR), и ген-мишень Wnt LGR5
был идентифицирован как новый маркер стволовых клеток тонкой кишки, толстой кишки и в волосяных фолликулах мышей [6] , Выражение LGR5 в нескольких других органах указывает на то, что он может представлять собой глобальную маркер взрослых стволовых клеток. Тем не менее, мало известно о его экспрессии в печеночно-желудочно-кишечном тракте человека.
<Р> В этом исследовании мы стремились восполнить этот пробел информации и проверили гипотезу о том, что стволовые клетки рака маркер LGR5 имеет прогностическое и опухоли биологическая значение.

материалы и методы

Субъекты
<р> формалине фиксированной и парафин злокачественные и соответствующие незлокачественная ткани из 127 пациентов, включающий шесть анатомических расположение гепато-желудочно-кишечного тракта кишечного тракта (например, пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы, толстой и прямой кишки) были извлечены из архивов институтов патологии Христиана-Альбрехта-университета Киле и Шарите университетского госпиталя Берлин (оба Германия). Все пациенты были прооперированы в любом университетском госпитале Шлезвиг-Гольштейн (1997-2009) или Шарите университетской клиники Берлина (1995-2008; таблица 1). Незакрепленный свежемороженая ткань была доступна от 105 этих больных с восемью различными типами опухолей, т.е. аденокарциномы Барретта (9 пациентов) и плоскоклеточный рак (7) пищевода, кишечника (19) и диффузной (21) типа рака желудка, аденокарциному толстой кишки (19) и прямой кишки (20), гепатоцеллюлярной карциномы (HCC, 4), и холангиокарциномой (CC; 6). Характеристики пациентов приведены в таблице 1.
<р> Независимая серия 487 больных раком желудка было извлечено из архива Института патологии Христиана-Альбрехта-университета (таблица 2 и таблица 3). Эти пациенты подверглись либо полной или частичной резекции желудка для аденокарциномы желудка или oesophago-желудочного перехода. Каждый резекция образец подвергся гистологическое исследование с помощью обученных хирургических патологоанатомов. Время смерти пациента была получена из Эпидемиологическое Рак реестра
государства Шлезвиг-Гольштейн, Германия. Последующие данные пациентов все еще живы были извлечены из больничных записей и, обратившись к врачам общей практики.

Заявление по этике
<р> Все образцы ткани были получены как часть диагностической или терапевтической операции, проведенной после того, как пациент дали письменное информированное согласие. Пациенты, предлагающие образцы для исследования были Псевдонимные и проанализированы анонимно, так что никакие индивидуальные данные, относящиеся к не содержатся в базе данных. Исследование было одобрено местным этическим комитетом больницы университета в Киле, Германия (см. Номер D 453/10).

в режиме реального времени с использованием обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции
<р> Общая РНК выделяли из культивированных клеток и тканей с использованием криоконсервированных Isolation Kit Амбион в Mirvana микроРНК (Applied Biosystems, Дармштадт, Германия) с последующей обработкой ДНКазой с Turbo ДНК свободного набора (Ambion). Качество РНК оценивали в 1,5% -ном агарозном геле. Для синтеза кДНК, 2 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием Transcriptor первой цепи синтеза кДНК Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Гено-специфические праймеры были синтезированы Biomers.net (Ульм, Германия) (Таблица S1). В режиме реального времени обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (в режиме реального времени ОТ-ПЦР) проводили с использованием LightCyler® 480 Зонды Master (Roche) и системы LightCycler® 480 (Roche). Сравнительные значения Ct были нормализованы к тому, что из трех генов домашнего хозяйства: гомо сапиенс сукцинатдегидрогеназа комплекс, субъединица А, флавопротеида (Fp) (SDHA), гомо сапиенс калпаина 2 (CAPN2)
и циклофилин C ( CYCC)
. Нет контроля шаблонов (без кДНК с помощью ПЦР) не проводили для каждого гена для выявления неспецифической или геномной амплификации и праймера димеризации. Все эксперименты проводились в двух экземплярах.

Генерация и очистка анти-LGR5-антител
<р> Поликлональные антисыворотки генерироваться против карбоксиконцевого хвоста рецептора LGR5 человека. Кролики были иммунизированы с тремя различными пептидами идентичности SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (так называемый Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (так называемый 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (так называемый 12) Пинеда-abservice (Берлин, Германия). Моноспецифичны IgG очищают с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов с системой ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) с использованием белка A-колонки (GE Healthcare). Для всех последующих анализов, т.е. иммунофлюоресценции, иммуноцитохимия, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии моноспецифичными IgG-фракцию аффинно очищают против иммунизирующих пептидов в Пинеда-abservice. В дот-блоттинга и иммуногистохимические исследования, то моноспецифичными IgG анти-LGR5-11b антител отображается высокое сродство наряду с сильной и специфической иммунной окраски. Таким образом, это антитело было использовано в данном исследовании. Реакционная способность и специфичность антител моноспецифичной характеризовался вестерн-блоттинга; иммунофлюоресценции и иммуноцитохимической анализы.

плазмидной конструкции
<р> Выражение для построения LGR5 был создан путем амплификации всей кодирующей последовательности человеческого LGR5
(NM_003667.2) с помощью ПЦР (таблица S1 ). Для облегчения субклонирования амплифицированного фрагмента в вектор экспрессии пкДНК3.1 (-), прямой праймер содержал адаптер сайта рестрикции NheI и обратный праймер содержал сайт BamHI и метку с-Мус для проверки успешной трансфекции. ПЦР-фрагменты и pcDNA3.1 (-) вектор экспрессии, переваривали отдельно с помощью NheI и BamHI перед тем лигирования Т4-лигазы (Roche). Плазмида была проверена путем гидролиза с помощью NheI и BamHI и секвенирования ДНК с использованием ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction комплекты, версия 2.0 (PE Applied Biosystems, Ланген, Германия).

Культура клеток и трансфекция

желудка человека линии клеток рака MKN74 была получена из японского здравоохранения Science Research Resource Bank (Осака, Япония), и MKN45 из немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Брауншвейг, Германия). Клетки HEK293 EBNA были приобретены Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). Клетки выращивали в среде RPMI 1640 (MKN74, MKN45) или Дульбекко в модификации Дульбекко (НЕК293), дополненной 10% (MKN74, HEK293) или 20% (MKN45) эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицин (РАА Laboratories GmbH, Pasching, Австрия). ДНК-трансфекции HEK293 EBNA, MKN74 и MKN45 клеток проводили с использованием Липофектамин LTX реагента (Invitrogen) в соответствии с инструкцией изготовителя. В кратком изложении, клетки культивировали в шесть-луночных планшетах. Стабильная трансфекция MKN74 и MKN45 с плазмидами экспрессии проводили, как описано ранее [7]. Для временной трансфекции клеток НЕК293 1 мкг плазмидной ДНК и 5 мкл Липофектамин LTX реагента разводили в 500 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко без сыворотки, соответственно. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, смесь добавляли к НЕК293. Через сорок восемь часов после трансфекции трансфицированные клетки собирали и РНК или белки были выделены. Клетки, трансфицированные вектором пкДНК3.1 (-) в покое и нетрансфицированные клетки служили в качестве отрицательного контроля

Иммунофлуоресценции
<р> Через двадцать четыре часа после посева на CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Бельгия),. клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором, фиксируется в 7:3 acetone:methanol (20 минут, 20 ° C), а затем делают проницаемыми с 0,1% Triton-X (5 минут, при комнатной температуре). Срезы затем инкубировали с с-Мус мышиного моноклонального антитела (Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния, США) в течение ночи при 5 ° С во влажной камере, после чего анти-мышь Alexa Fluor 555 конъюгированного вторичного антитела (Invitrogen). Для обнаружения успешной трансфекции LGR5, клетки инкубировали с анти-LGR5-антителом с последующим анти-кроличьего вторичного антитела, конъюгированного с Alexa Fluor 488 (Invitrogen), каждый в течение одного часа при комнатной температуре. Упущение первичных антител на LGR5 трансфицировали HEK293 EBNA клетки служили в качестве отрицательного контроля. Монтаж и counterstaining было сделано с Vectashield Hard-Set включая DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Иммуноцитохимическая
<р> Иммуноцитохимическая окрашивание проводили на фиксированных формалином, paraffin- встроенный MKN45 клеток рака желудка. Для этой цели клетки MKN45 были встроены в маленьких бусинок агарозы, как описано ранее [8]. Дальнейшая обработка и иммунное окрашивание с анти-LGR5-антителом (разведение 1:1000) проводили в соответствии с иммуногистохимического анализа срезов тканей человека (смотри ниже). Пропуски первичного антитела на LGR5 трансфицируют MKN45 клетки служили в качестве отрицательного контроля, в то время как специфичность окрашивания анти-LGR5-антител была подтверждена путем инкубирования антитела с иммунизационный блокирующий пептид.

вестерн-блоттинга
<р> Белковые лизаты были получены путем инкубирования желудка ткани человека и культивировали клетки желудка с ProteoJET ™ млекопитающим для лизиса клеток (Fermentas реактивом, Санкт-Leon-Rot, Германия) и ингибиторов протеаз (полный ЭДТА-бесплатно, Roche). Образцы белка денатурированный в буфере Лэммли (60 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2% додецилсульфата натрия, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего) путем нагревания при 95 ° С в течение десяти минут, и впоследствии были загружены на 4% до 16,5% SDS полиакриламидном геле и визуализировали окрашиванием кумасси синим. После разделения белков на неокрашенных полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, Фрайбург, Германия), иммуноблоттинг с анти-LGR5-антителом (разбавление 1:20,000) и анти-бета-актин-антителом (1:10,000; клонировать AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), чтобы обеспечить равные количества загрузки. Мембраносвязанными HRP меченых вторичных антител (DakoCytomation, Glostrup, Дания) были обнаружены усиленной хемилюминесценции с использованием системы ECL (Amersham). Пропуски первичного антитела служили в качестве отрицательного контроля, в то время как специфичность окрашивания анти-LGR5-антител была подтверждена путем инкубирования антитела с иммунизационный блокирующий пептид.

гистологии
<р> Для гистологического анализа, ткань образцы фиксировали в 10% формалине нейтрализованного и заливали в парафин. Депарафинировали срезы окрашивали с использованием гематоксилином и эозином (H &Amp; E). Желудочный рак был классифицирован в соответствии с классификацией ВОЗ [9]. Стадия pTNM была определена в соответствии с 7 е издание Международного союза по борьбе с раком [10].

Tissue микро массив строительство
<р> фиксированные формалином и залитые парафином образцы ткани используется для генерации ткани микро массивов, как описано ранее [11]. Четыре микрометр участки полученного опухолевой ткани блока микро массива были вырезаны для дальнейшего анализа. Успешная передача опухолевой ткани была подтверждена микроскопически с помощью H &усилителя;. E-окрашенные срезы

Immunohistochemistry

Для иммуногистохимии, использовались фиксированные формалином и парафином секции. Иммунологическое проводили с анти-LGR5-антителом (разбавление 1:1000), моноклональное антитело, направленное против CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Ньюкасл, GB) и коммерческие поликлональные антитела, направленные против LGR5 (LGR5 ^{ком , 1:400; Abcam, Inc., Кембридж, Массачусетс, США), ADAM17 (разведение 1:50; Sigma-Aldrich) и Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). После 20 минут, блокирующие с перекисью водорода блок (Thermo Scientific, Waltham, MA, США), 5 минут обработки Ultra V Block (Thermo Scientific) и инкубацию с первичными антителами было сделано во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. Слайды были промыты между стадиями с трис-буферном солевом растворе (TBS). Immunoreactions визуализировали с п-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Токио, Япония) и ДАБ (Linaris, Вертхайм-Беттинген, Германия). Для получения двойного окрашивания LGR5 с CD44, ADAM17 и Musashi-1, свободные сайты связывания блокировали с помощью мышиной IgG и контроль кроличий IgG (Abcam), разбавленный в разбавителе антитела (ZYTOMED Systems, Берлин, Германия) после того, как DAB-обработки. Образцы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. Пропуски первичного антитела служили в качестве отрицательного контроля. Неопухолевых желудка человека (CD44) и ткани мозга (LGR5 ком, LGR5 и Musashi-1) служил в качестве положительного контроля.}

Оценка иммунным окрашиванием
<р> Иммуноокрашивание неопухолевых эпителия и опухолевые клетки оценивали путем применения системы иммунореактивности подсчета очков (IRS). Вкратце, категория документированная интенсивность иммуноокрашиванием как 0 (нет иммуноокрашивания), 1 (слабый), 2 (умеренная) и 3 (сильный). Категория B зафиксировали процент иммунореактивных клеток в качестве 0 (отрицательные), 1 (рассеянных положительных клеток; ≤1%), 2 (2-10% положительных клеток), 3 (11-50%), 4 (51-80%) и 5 (> 80%). Добавление категории А и В привело к IRS в пределах от 0 до 8 для каждого конкретного случая. Распределительные изменения LGR5 + клеток в 100 целых секций бугра рака желудка кишечного типа оценивали следующим образом: количество иммунореактивных клеток был отнесен к категории 0 (отрицательный), 1 (&л; 10 положительных клеток), 2 (10 -50 положительных клеток) и 3 (&GТ; 50 положительных клеток) по отдельности для полостную поверхность, опухоль центра и фронт вторжения

статистический анализ
<р> Статистический анализ проводили с использованием PASW Statistics 18. статистический пакет (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Сравнения между группами были протестированы с использованием точного критерия Фишера. Корреляция экспрессии LGR5 в пределах одной группы была установлена ​​корреляция тау ранга порядка Кендалла. Кривые выживаемости были установлены с помощью метода Каплана-Мейера и различий в выживаемости оцененных с помощью теста журнала ранга. Значимость корреляций экспрессии LGR5 в первичных опухолях и соответствующего доброкачественной ткани оценивали с помощью теста Вилкоксона. В режиме реального времени данные ОТ-ПЦР, которые были оценены с сопряженным двухсторонним т-тест, получили logarithmized получить приблизительно нормально распределенных данных. P-значения &л;. 0,05 рассматривались как статистически значимые

Результаты

LGR5-мРНК дифференцированно выражается в печеночно-желудочно-кишечные карциномы
<р> LGR5 был, как сообщается, выраженных в мышиных стволовых клеток криптах кишечника [12] и часто избыточно экспрессируется в линиях клеток рака толстой кишки [13]. Для того, чтобы исследовать его экспрессию в неопухолевых и опухолевой ткани человека, мы оценивали транскрипционную экспрессию LGR5 в клинических образцах человека, состоящих из широкого спектра гепато-желудочно-кишечного рака. В режиме реального времени ОТ-ПЦР анализ проводили на серии из 105 пациентов, содержащих злокачественные и соответствующее незлокачественная ткани, полученные из одних и тех же пациентов, из восьми различных типов опухолей: пищевод [аденокарциномы Барретта (9 больных) и плоскоклеточный рак ( 7)], желудка [кишечные (19) и диффузного типа (21), желудка карцинома], печени [ЖСК (4), СЦ (6)], толстой кишки (19) и прямую кишку (20; таблица 1)
<. р> LGR5-мРНК значительно дифференцированно выражены в аденокарциномы пищевода (р = 0,007), желудка [кишечного типа (р = 0,006) и диффузного типа (р = 0,013)], печени [СЦ (р = 0,022)], толстой кишки (р &л; 0,001), а также прямой кишке (р = 0,002) по сравнению с совпадающей неопухолевых ткани. Однако ни дифференциальное выражение не было найдено в плоскоклеточного рака пищевода (р = 0,503) и ЖСК по сравнению с соответствующими неопухолевых тканей (р = 0,545; рис 1).

Поликлональное анти-LGR5- антитело обнаруживает человеческую LGR5 трансфицировали в HEK293 и MKN45 клеток

для дальнейшего изучения histoanatomical распределение LGR5 в тканях человека и исследовать его клинико-патологическая значение, антитело LGR5 конкретных был поднят, так как коммерчески доступные антитела сделал не отвечают нашим требованиям (Рисунок 2А). Чтобы исключить перекрестное реактивность вновь сгенерированном антитела с наиболее структурно подобны LGRs, LGR4 и LGR6, мы выполнили выравнивание последовательности с Национальный центр биотехнологической информации
инструмент выравнивания заранее (данные не показаны). Ни одна последовательность гомологии не было обнаружено с LGR4 или LGR6 в области пептида LGR5 мы использовали для иммунизации. Для отбора весьма специфического антитела против LGR5, клонировали полноразмерную кДНК трансфицировали в клетки НЕК293 EBNA и использовали в качестве положительного целевой исполняющей иммунофлюоресценции. LGR5 кДНК непосредственно с тегом Мус-эпитопу, что позволило оценить трансфекции с анти-Myc антитела тега. С помощью иммунофлюоресценции, связывание анти-Myc антител обнаружен тег после инкубации с клетками LGR5 /НЕК293, но не в пустых вектор-трансфицированных клеток (вектор /HEK293), нетрансфецированной НЕК293, или в отрицательном контроле клетки LGR5 /HEK293 инкубировали с антителом разбавителя вместо первичного антитела. Тот же результат был получен, когда мы использовали анти-LGR5-антитело (рисунок 3), демонстрируя определенную маркировку LGR5.
<Р> специфичность LGR5-immunolabelling была дополнительно подтверждена с использованием фиксированных формалином и залитых парафином MKN45 желудка раковые клетки. Клетки подготавливали и окрашивают таким образом, который параллелен обработку клинических образцов тканей человека. Иммуноцитохимическая анализы на парафиновые срезы показывают положительное окрашивание анти-LGR5-антитело на MKN45 клетках, стабильно трансфицированных кДНК LGR5 (LGR5 /MKN45). Вместо пустой вектор трансфицируют MKN45 клетки (вектор /MKN45), а также в качестве отрицательного контроля (пропуск первичного антитела), и контрольный пептид (предварительная инкубация антитела с его иммунизирующему блокирующего пептида) клеток LGR5 /MKN45 показал не связывание антитела (рис S1).

LGR5 белок специально не обнаруживается анти-LGR5-антител у человека трансфицируют MKN74 клеточные

желудочных линии раковых клеток человека MKN74, как известно, обладают выражение умеренной LGR5-мРНК (данные не показаны) и человеческий неопухолевых желудка, которые обладают очень низкой экспрессией LGR5 (рисунок 1) были выбраны для характеристики реакционной способности и специфичность анти-LGR5-антител на уровне белка.
<р> В Вестерн-блоттинга, LGR5 белок был признан конкретно по моноспецифичной анти-LGR5-антитела при разведении 1:20,000. Она определила одну полосу с кажущейся молекулярной массой 100 кДа в лизатов MKN74 клеток (рисунок 4), что соответствует молекулярной массе, рассчитанное для белка LGR5. В отличие от этого, ни одна группа не была обнаружена в лизатов человеческой неопухолевых ткани желудка, что исключает перекрестную реактивность анти-LGR5-антитела с клеточными белками. В соответствии с данным экспрессии мРНК, наблюдалось сильное экспрессия белка LGR5 в MKN74 клетках, стабильно трансфицированных кДНК LGR5, по сравнению с контрольными клетками MKN74, трансфицированных пустым вектором. экспрессия белка LGR5 в неопухолевых слизистой оболочки желудка человека было выше предела обнаружения Вестерн-блоттинга, не показывая никакой группы. Пропуски анти-LGR5-антитело или предыдущей инкубации антитела с его Иммунизирующий не блокирует пептид, не будут отображаться полосы белка, соответственно. Обнаружение бета-актина белка (около 43 кДа, рисунок 4) служил в качестве контроля загрузки и подтверженному равномерную нагрузку количества белка во всех дорожках

LGR5 выражается в неопухолевых и опухолевой ткани гепато-желудочно-кишечного тракта. кишечного тракта
<р> выражение и histoanatomical распределение LGR5 впоследствии методом иммуногистохимии в серии из 127 слайдов тканей, полученных из соответствующих неопухолевых и опухолевой ткани гепато-желудочно-кишечного тракта, включающий пищевод (14 пациентов), желудок (32), печени (24), поджелудочной железы (17), толстой кишки (20), и прямой кишке (20; таблица 1). Из этой когорты неопластических и соответствующих образцов неопухолевых тканей из 105 больных были изучены также на уровне транскрипции (см. Выше)
<р> LGR5 выражением общей когорте был положительным в 65 случаях (51%) всех незлокачественных тканей и 103 случаев (81%) всех раковых тканей. Локализация экспрессии LGR5 наблюдалось в основном цитоплазматический, а также имели место спорадические мембрану или ядро ​​акцентирована выражение мембраны. LGR5-иммунореактивность была обнаружена во всех компонентах ткани, т.е. стромы клетки, эндотелиальные клетки, клетки в неопухолевых эпителия и в раковых клетках (рисунок 5). LGR5-иммунореактивности в стромальных клетках наблюдалась у 49 (39%) всех доброкачественных тканей и в 80 случаях (63%) всех раковых тканей. Культивируемые эндотелиальные иммунореактивности LGR5 наблюдалась в 42 случаях (33%) всех тканей.
<Р> В доброкачественной эпителия, LGR5 обычно находится в нескольких разбросанных клеток, близких к базальной мембране желудочного блока через слизистую оболочку, панкреатических протоков и колоректального крипты. LGR5 не был найден в чешуйчатый эпителий пищевода, внутрипеченочных желчных протоков, и гепатоцитов (рисунок 6). Для всех типов тканей отдельно от пищеводного ткани среднее значение IRS была значительно выше опухолевой ткани по отношению к совпавшего доброкачественной ткани, подтверждает наши выводы относительно транскрипционном уровне (таблица 1).

LGR5 присутствует в разбросанные клетки нормальной слизистой оболочки желудка
<р> существование мультипотентных стволовых клеток в мышином желудке была продемонстрирована клоновых маркировки исследований. Окончательное определение этих клеток до сих пор не удалось из-за недоступность специфических эндогенных маркеров [14]. С помощью серийных срезов, полученных из рукава резекция образца, который обычно получают для лечения избыточной массы тела, и не показывали гистологические признаки рака желудка или хроническим гастритом, мы искали LGR5 + эпителиальных клеток. Интересно, что рассеянные LGR5 + клетки были обнаружены в слизистой области шеи между foveolae и желез (рисунок 7).

LGR5 является коэкспрессируются с другими потенциальными стволовых клеток или клеток-предшественников маркеров желудка
<р> Стволовые клетки неопухолевых ткани и ОКК обычно идентифицированы и проверены с помощью экспрессии более чем одного маркера стволовых клеток [15]. С помощью иммуногистохимии, мы в следующий раз проанализировали коэкспрессия LGR5 с другими предполагаемыми маркеров CSC, т.е. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 был выбран, так как предыдущие исследования определили ADAM17 в качестве мнимого стволовых клеток маркера желудка [8]. Иммунологическое (либо двойное окрашивание или окрашивание серийных срезов) проводили на желудочную образце рака и на здоровых uninflammed слизистой оболочки желудка, полученного рукава гастрэктомии. В общем случае лишь несколько разбросанных клеток показали положительную иммуногистохимическое одной и /или другой предполагаемому стволовых клеток маркера. Интересно отметить, что неопухолевых слизистой оболочки желудка таит в себе клетки, каждый из которых ADAM17 + /LGR5 + (что составляет примерно одну треть всех иммунореактивных клеток) и ADAM17 + /LGR5 - (две трети) и ADAM17 - /LGR5 + (несколько разрозненных ячеек; Рисунок 2C-E)

Musashi-1 (МШ-1) был описан как мнимого маркера стволовых клеток в кишечнике мыши. и человеческий желудок [18], [22] и в качестве маркера CSC в опухолях [23]. В опухолевых и неопухолевых желудка ткани положительных окрашенных клеток, состоящих преимущественно из MSH-1 ^{+ /LGR5 - (примерно две трети всех иммунореактивных клеток), в меньшей степени MSH-1 + /LGR5 + (одна треть), и лишь немногие MSH-1 - /LGR5 + клеток (рис 2F-H). Наконец поверхностный маркер колоректальных и желудочных раковых стволовых клеток CD44 [21], [24] показали, распределение, сравнимое с МШ-1 (рис 2I, J). В совокупности эти данные подтверждают гипотезу о том, что наши анти-LGR5-антитело обнаруживает клетки с паттерном экспрессии стволовых клеток в слизистой оболочке желудка человека.}

Пространственное распределение LGR5 + клеток изменяется во время tumourigenesis
<р> последовательные изменения в слизистой оболочке желудка, которые предшествуют развитию инвазивного рака известны как «предраковое каскада», впервые была описана в 1975 году, где нормальная слизистая оболочка желудка трансформируется хронический атрофический гастрит и развивается мультифокальной атрофии и кишечной метаплазии, а затем появление дисплазии и, наконец, инвазивной карциномы [25]. Далее мы проверили гипотезу о том, что вышеупомянутые гистологические изменения слизистой оболочки желудка связаны с перераспределением в LGR5 + предполагаемыми стволовых клеток. Мы систематически исследовали histoanatomical распределение LGR5 + клеток у 100 пациентов с раком желудка кишечного типа. Целые секции монтирования ткани были использованы, которые заключены неопухолевых, метапластического и опухолевой ткани рака. Было очевидно, что histoanatomical распределение LGR5 + клеток изменяется (рисунок 7): в неопухолевых и слизистую оболочку, не метапластического желудка, несколько разрозненных LGR5 + клетки были обнаружены в области слизистой шеи (рис 7А, Е). В кишечной метаплазией, незначительное увеличение числа LGR5 + клетки были локализованы в нижней части метапластических крипт (фиг.7В, F). Тем не менее, в кишечном рака желудка типа локализации и количество LGR5 + клеток разительно изменился. При раке желудка, LGR5 + клетки присутствуют на поверхности полостной (фиг.7С, G), в центре опухоли (между поверхностью просвету и инвазии спереди) и на фронт вторжения (рис 7D). Самое интересное, что распределение LGR5 + клеток рака желудка показали отличительные закономерности: LGR5 + клетки имели место в липких пятнах переменного числа опухолевых клеток в пределах от &л; 10, 10-50 и даже &GТ; 50 опухолевые клетки, часто образуют градиенты уменьшения интенсивности окрашивания. Общее распределение этих LGR5 + пластырей опухолевых клеток был неравномерным и неоднородным. Все вместе, мы наблюдали увеличение числа и интенсивности LGR5 + клеток от неопухолевых эпителии до рака желудка, поддерживающей наш реальном времени RT-PCR и иммуногистохимии данные соответствуют (неопухолевых по сравнению с опухолевое) случаях пациента (см Таблица 1). Наши выводы измененную картину распределения LGR5 + клеток согласуется с тем, что описаны Takeda и соавт. для рака толстой кишки [26].

Выражение LGR5 при раке желудка кишечного типа коррелирует с ростом локальной опухоли и узловой спреда
<р> Он постулировал, что ЦОК влияние прогноза пациента по их способности образовывать опухоли клеточные колонии, необходимым предварительным условием для метастазирования и рецидива заболевания. Для дальнейшего изучения значимости LGR5 для рака желудка, мы сопоставили экспрессию LGR5 в кишечном рака желудка типа с различными клинико-патологических особенностей пациента.

• PLoS ONE: пониженные уровни активного SMAD2 коррелируют с плохим прогнозом рака желудка
• PLoS ONE: Glyoxalase-I является новым Прогноз фактор, связанный с раком желудка Progression