Imunizácia s imunodominantní Helicobacter ureázy suis podjednotky B indukuje čiastočnú ochranu proti H. suis infekcii u myší model

imunizácia s imunodominantní Helicobacter ureázy suis
podjednotky B indukuje čiastočnú ochranu proti H. suis
infekcie na myšom modeli
abstraktné
Helicobacter
(H.
) suis
je prasacej a ľudskej žalúdočnej patogén. Predchádzajúce štúdie na myšiach ukázali, že H. suis
infekcie nevedie k ochrannej imunity, zatiaľ čo imunizácia H. suis
celej bunkového lyzátu (lyzátu) chráni proti následnej experimentálnej infekcii. Z tohto dôvodu, dvojrozmerná gélová elektroforéza H. suis
proteínov bola vykonaná následne imunoblotováním s zhromaždených sér od H. suis štáty - infikovaných myší alebo myší imunizovaných s lyzáty. Slabá reaktivita proti H. suis
proteínov bola pozorovaná po infekcii séra. Séra z myší imunizovaných lyzátu sa však ukázalo, imunoreaktivitu proti celkom 19 proteínových škvŕn, ktoré boli identifikované pomocou LC-MS /MS. H. suis
Ureáza podjednotka B (UreB) ukázala najvýraznejšie reaktivitu v porovnaní so sérami myší imunizovaných lyzátu a nebola detekovaná so sérom od infikovaných myší. Žiadny zo zhromaždených sér zistená H. suis
neutrofily aktivujúci proteín A (Napa). Ochranná účinnosť intranazálne vakcinácia myší Balb /c s H. suis
UreB a Napa, a to ako s rekombinantnou DNA exprimovaný v Escherichia coli (
rUreB a rNapA, v uvedenom poradí), bol v porovnaní s H. suis
lyzát. Všetky vakcíny obsahovali choleratoxínu ako adjuvans. Imunizácia myší s rUreB a lyzátu indukovaných významné zníženie H. suis
kolonizáciu v porovnaní s neočkované H. suis
-infected ovládacie prvky, zatiaľ čo rNapA nemal žiadny významný ochranný účinok. Pravdepodobne, kombinácia miestnych reakcií Th1 a Th17, doplnené protilátkovej odpovede hrajú úlohu v ochrannej imunity proti H. suis
infekcií.
Úvod
Helicobacter
(H.
) suis
je svetovo rozšírená patogén, kolonizovať hlavne ošípané. Infekcia s týmto gramnegatívne baktérie bolo spojené s vredmi žalúdočnej sliznici bez žliaz [1, 2], a spôsobí, gastritída a zníženie denný nárast hmotnosti [3] u ošípaných. H. suis
je najviac prevláda non-Helicobacter pylori, Helicobacter
druhy u ľudí, ktorí trpia žalúdočnými poruchami [2], a ošípané môžu slúžiť ako zdroj H. suis
infekcie pre človeka [2, 4 ]. Kontrola H. suis
infekcií terapia antibiotikami na báze čiastočne sa neodporúča vzhľadom na zvýšené riziko rozvoja získal antimikrobiálnej rezistencie v H. suis
kmeňov a baktérií, ktoré patria do normálnej mikrobiálnej flóry ošípaných [5]. Očkovanie proti H. suis
preto môže predstavovať cennú alternatívu. Až doteraz sa však vo väčšine štúdií sa zaoberalo očkovanie proti tejto ošípaných a zoonotické patogénu.
Predchádzajúce štúdie na myšiam modeli ukázali, že H. suis
infekcie nevedie k ochrannej imunity, zatiaľ čo očkovanie založené na homológny (H. suis
) alebo heterológnej (H. bizzozeronii
alebo H. cynogastricus
) celej lyzát buniek vyvolané zníženie alebo dokonca k úplnému vymiznutiu žalúdočnej kolonizácie H. suis
[6]. Avšak, použitie tohto typu vakcíny má nevýhody, vrátane pracné in vitro kultúre H. suis
, čo má za následok ťažkosti, k výraznému poklesu antigén. Tiež celá-fragmenty buniek môžu obsahovať oba ochranné antigény a antigény pre potlačenie ochranu [7]. Účinná vakcína podjednotky môže byť užitočnou alternatívou pre kontrolu H. suis
infekcií. Immunoproteomics je vhodným prostriedkom pre rýchlu identifikáciu kandidátnych proteínov pre vakcináciu, a bola použitá k štúdiu a rozvíjať podjednotky vakcíny pre široké spektrum patogénov [8].
To bolo cieľom tejto štúdie pre výber H. suis
proteíny, ktoré by mohli vyvolať ochrannú imunitu voči H. suis
infekcie. Z tohto dôvodu, H. suis
proteíny rozpoznávané sérom myší imunizovaných H. suis
celej bunkového lyzátu a chránené proti infekcii boli identifikované pomocou dvojrozmerného (2D), gélovej elektroforézy a následne imuno-blottingom a LC-MS /PANI. Séra H. suis štáty - infikovaných myší boli tiež zahrnuté, pretože infekcia nevedie k ochrane. Na základe tejto analýzy je imunoreaktívnych H. suis
Ureáza podjednotka B (UreB), bol vybraný pre ďalší testovanie in vivo. Ako kontrola sme zahŕňali H. suis
neutrofily aktivujúci proteín A (Napa), ktorý bol predtým opísaný ako možný virulencie [9], faktor, ale nebol rozpoznaný sérom myší imunizovaných celej bunkového lyzátu. Následne sa protektívny účinnosť proti H. suis
infekcie oboch podjednotkových vakcín bola hodnotená a v porovnaní s tým, H. suis
lyzátu v normalizovanom myšiam modeli.
Materiály a metódy
bakteriálne kmeň
Vo všetkých experimentoch, H. suis
kmeň 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) bola použitá. Tento kmeň bol izolovaný z žalúdočnej sliznice prasaťa v súlade s metódou opísanou Baele a spol. [10].
Zvieratá
Jeden týždeň pred začiatkom pokusov, päť týždňov staré špecifický-patogén -zdarma samica Balb /c myší boli získané od autorizovaného chovateľa (HARLAN, Horst, Holandsko). Zvieratá bola umiestnená na sterilizovaných hoblín vo filtri top klietkach. Ktoré boli kŕmené s autoklávovaného obchodným stravy (Teklad 2018S, HARLAN) a prijaté v autokláve vodu podľa ľubovôle
. Všetky experimenty laboratórne zvieratách boli schválené Výborom pre Animal Care a etika Fakulty veterinárneho lekárstva, Univerzita v Gente.
Immunoproteomics H. suis
Dvojrozmerná gélová elektroforéza (2D-PAGE)
HS5 sa pestuje, ako bolo opísané skôr [11]. Baktérie boli zozbierané centrifugáciou (5000 g
, 4 ° C po dobu 10 minút) a štyrikrát premyté vyváženým roztokom Hankovým soli (HBSS). Celkové proteíny (rozpustné a nerozpustné proteíny) boli získané v dvoch krokoch s použitím ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Aby sa dosiahlo dobré výsledky 2D-stránku, Homogenát boli ošetrené vhodnými prísadami (5 mg inhibítora proteázy koktail, 1 ul DNázy I, 1 ul RNázy A, 10 ul inhibítory fosfatázy PP2 a PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemecko) ). Konečne, koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou RC jednosmerné
Protein Assay (Bio-Rad) a proteíny boli skladované pri -70 ° C až do ďalšieho použitia. Celkom 100 ug HS5 proteínov boli rehydratované v 200 ul pufru (7M rehydratačný urèuje, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% nosná amfolytu pH3-4, 100 mM dithiothreitolu (DTT) a brómfenolovej modro). Vzorky boli pasívne absorbované do ReadyStrip (11 cm, PH3 na pH 10, Bio-Rad) a izoelektrickým zameraním sa vykonáva v Protean IEF komory (Bio-Rad), ako bolo opísané skôr [12]. Po izoelektrickým zameraním, boli prúžky do rovnováhy počas 15 minút v 1,5% DTT v ekvilibračním pufrom (50 mM TrisHCI, pH 8,8 6M močoviny, 20% glycerol, 2% SDS), nasleduje ďalšie rovnováhy v 4% jodacetamidu v rovnovážnom pufri. Gélová elektroforéza bola vykonaná na 10% SDS-PAGE TrisHCI za použitia 150 V po dobu 30 minút, a následne 200 V po dobu 1 hodiny. Dva gély boli vykonávané súbežne: jeden bol zafarbený Sypro® Ruby Protein Gel farbenie (Bio-Rad), zatiaľ čo druhá bola použitá pre imunoblotování (pozri Western blotting je popísané nižšie). Pred farbením, gély boli fixované v 10% MeOH, 7% kyseliny octovej. Po zafarbení, H. suis
proteíny boli vizualizované za použitia VersaDoc zobrazovacieho systému (Bio-Rad)
sér
Tri pooly myšieho séra boli použité v tejto štúdii :.

Séra myší imunizovaných H. suis
celej bunkového lyzátu (ďalej len "lyzátu-imunizovaných myší") (n = 10
). Tieto zvieratá boli vrúbľovať intranazálne dvakrát trojtýždňové interval s 100 ug lyzátu HS5 + 5 ug cholera toxín (CT) (Zoznam Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lyzát sa pripravil ako je opísané vyššie, ale bez finálnej filtráciu supernatantu [6]. Tri týždne po poslednej imunizácii bola odobratá krv a sérum boli spojené. Tento imunizačný protokol bolo preukázané, že je (čiastočne) protektívny proti H. suis
výzvu [6], a ochranný účinok bol tu potvrdzuje, že v predbežnom pokuse (dáta nie sú uvedené).

Sera od H. suis
-infected myši (ďalej len "infikovaných myší") (n = 10
). Tieto zvieratá bola očkujú do žalúdka s 200 ul Brucella bujóne pri pH 5, ktorý obsahuje 10 ^{8 čerstvo pripravené H. suis
baktérie [11]. Štyri týždne po infekcii, bola odobratá krv a sérum boli spojené.}

Séra z negatívnych kontrolných myší (n = 10
). Tieto zvieratá dostávala HBSS intranazálne dvakrát s intervalom tri týždne s následným žalúdočnej naočkovanie 200 ul Brucella bujóne pri pH 5 (4 týždne po poslednej imunizácii placebo). Po štyroch týždňoch bola odobratá krv a sérum boli spojené.
Všetky séra boli skladované pri -70 ° C až do ďalšieho použitia.
Western blotting
Proteíny boli electrotransferred z gélov na nitrocelulózové membrány (Bio-Rad), ako je popísané na inom mieste [12]. Membrány boli blokované v 5% odstredené mlieko vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) (blokovacie pufor), inkubované cez noc (ON) zriedenou myšieho séra (1/100 v blokujúcom pufri) pri teplote miestnosti (RT), opláchnuté v PBS s 0,3% Tween-20 (premývací pufer) a inkubovaná po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti s stabilizovaný kozí anti-myší imunoglobulín G (IgG) s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou (1/1000 v blokovacom pufri, Pierce, Rockford, IL, USA). Po premytí v premývacom pufri, imunodetekce proteínov bola vykonaná zvýšenú detekcia chemiluminiscencie pomocou SuperSignal West Dura predĺženú dobu substrátu (Pierce). Proteínové vzory boli skenované a digitalizované pomocou VersaDoc zobrazovacieho systému. Všetky experimenty boli vykonávané v triplikátech.
Trávenie a identifikáciu In-gél proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie Br &-gelu bola vykonaná štiepenie proteínov, ako je popísané v Cheung et al. [13]. Pred hmotnostnej spektrometrie izolované peptidy boli separované na U3000 nano-vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), ako bolo opísané skôr [14].
Identifikácia peptidov bola vykonaná s použitím elektrosprejová ionizácie kvadrupol time-of-flight hmotnostná spektrometria (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA), ako bolo opísané skôr [14]. Analýza dát bola vykonaná proti Helicobacter
databázy proteínov z NCBI (146 612 záznamov) pomocou in-house vyhľadávača maskot Daemon (2.3, Matrix Science, Londýn, Veľká Británia). Chyba tolerantné vyhľadávania bola vykonaná s carbamidomethyl (C) ako pevnej modifikácie. Carbamidomethyl (N-koniec) a oxidácia (M) bola stanovená v rôzne modifikácie. Hmotnosť peptidu tolerancie a hmotnostný fragment tolerancia bola nastavená na 0,35 a 0,45 Da Da, v uvedenom poradí. Maximálne dve miscleavages boli povolené. Proteíny boli považované iba správne komentovaný, kedy význam nižšia ako 0,05 (p
menšie ako 0,05) a aspoň jeden peptid prešiel požadované kritériá tučné červené z Mascot démon, čo naznačuje, že aspoň jeden peptid mal číslo 1 a významu pod úroveň 0,05.
jednorozmerný gélovej elektroforézy (1D-PAGE) a Western blotting rUreB
1D-PAGE 10 ug rekombinantnej H. suis
Ureáza podjednotky B (rUreB) bola vykonaná ako je popísané Van Steendam a spol. [12]. Príprava séra a Western blot analýzy boli vykonané ako je popísané vyššie.
Účinnosť ochrany rekombinantného H. suis
proteínov na myšom modeli
Príprava rekombinantného UreB
fragment kódujúci H. suis
UreB sekvencie (GenBank lokus tag HSUHS5_0285) bola amplifikovaná pomocou PCR s použitím PWO polymerázy s korektúry aktivitou (Roche, Mannheim, Nemecko) z DNA HS5 (dopredný primer: 5'-ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 ', reverzné primer: 5'-CTA GTG GTG ATG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3') a klonovaný do proteín expresného vektora PET-24d. RUreB bol exprimovaný v E. coli kmeňa BL21
(DE3). Bunky boli Lyžovanie sonikací (5 x 30 s) v pufri obsahujúcom 50 mM Na.PO 4 pH7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 a 1 mM PMSF. Po centrifugácii (4 ° C, 20 000 g počas 30 minút
), rUreB bol purifikovaný z rozpustnej frakcie pomocou Ni-afinitnej chromatografie v pufri obsahujúcom 1M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidazolu a 10% glycerol (Jeho GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Švédsko) a následne gélovou filtráciou na Superdex ™ 200 HR 16/60 kolóna (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Po vyčistení rUreB bola analyzovaná pomocou SDS-PAGE a analýza Western blot s použitím anti-hexahistidine-tag myší monoklonálne protilátky (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estónsko). Detergent Triton X-100 bola odstránená z purifikovaného rUreB pomocou Pierce umývacích prostriedkov pre odstránenie Spin stĺpca (Pierce) nasledujúce inštrukcií výrobcu. Koncentrácia proteínu bola stanovená s RC DC
bielkoviny test (Bio-Rad).
Príprava rekombinantnej Napa
Proteín bol vyjadrený v E. coli
Expression System s Gateway® technológie (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nasledovne. Fragment kódujúci H. suis
neutrofily aktivujúci proteín A (Napa) sekvencie (GenBank lokus tag HSUHS5_0014) bola amplifikovaná pomocou PCR s použitím PWO polymerázy s korektúry aktivitou (Roche) z DNA HS5 (dopredný primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 ', reverzné primer: 5'-TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC-3') a klonovaný do ™ /TEV /D-TOPO® pentru a prenesené do cieľového vektora pDEST17 ™. Zvolená pDEST17-Napa plazmid bol transformovaný do BL21-AI ™ E. coli
a následne sa nechajú rásť pri 37 ° C na OD 600 0,6-1,0 v Luria Broth, doplnenom 50 ug /ml karbenicilín. Rekombinantný H. suis
Napa (rNapA) expresie sa indukuje prídavkom 0,2% L-arabinózy. Po 4 hodinách inkubácie pri teplote 37 ° C, boli bunky zozbierané a resuspendované v lyzačním pufri: 50 mM TrisHCI, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lyzozýmu, 20 ug /ml DNase, 1 mM inhibítora proteázy (Sigma) a 1 mM MgCl 2. Bunky boli Lyžovanie sonikací (5 krát po dobu 30 s). Zvyšky buniek tela a začlenenie boli izolované centrifugáciou pri 4 ° C (20 000 g počas 30 minút
). Inklúzne telieska bola následne premytá dvakrát na základe nasledujúceho protokolu: peleta sa resuspendujú v lyzačním pufri za studena, podrobí pôsobeniu ultrazvuku 5 krát počas 30 s následným odstreďovaním (4 ° C, 20 000 g počas 30 minút
). Tieto Premytá inklúzne telieska bola rozpustená vo väzobnom pufri, pH 8 (6 M guanidium HCl, 20 mM TrisHCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazolu, 1 mM β-mercaptomethanol) jemným otáčaním po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou pri vysokej rýchlosti 4 ° C (100 000 g počas 30 minút
). rNapA bola čistená z vyčíreného supernatantu na Ni-Sepharose kolónu (Jeho GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) podľa inštrukcií výrobcu. rNapA bol vylúhovaný elučným pufrom, pH 8 (8 M močovina, 20 mM TrisHCI, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazolu, a 1 mM p-mercaptoetanolu) a ON dialyzovaný proti PBS pri 4 ° C. Potom, rNapA bola analyzovaná pomocou SDS-PAGE a proteín koncentrácia bola stanovená pomocou RC jednosmerné
Protein Assay (Bio-Rad).
Imunizácia a infekcia experimenty
Experimentálne prevedenie je zhrnutý na obrázku 1. Päť skupín 10 myšiam bol intranazálne dvakrát zaočkované 3 týždne intervalu, zakaždým s 17,5 ul inokula. V skupinách 1, 2 a 3 sa inokulum sa skladala z HBSS s 5 ug CT, obsahujúca 30 ug rUreB, 30 ug a 100 ug rNapA HS5 lyzátu, v danom poradí. Skupiny 4 (falošne imunizované skupina) a 5 (negatívna kontrolná skupina) boli vrúbľovať HBSS. Tri týždne po druhej intranazálnej imunizácii bola odobratá krv z chvostovej krvácanie z piatich zvierat v skupine a o týždeň neskôr, všetky zvieratá, s výnimkou negatívnou kontrolou, sa naočkujú do žalúdka s 200 ul Brucella bujóne pri pH 5, ktorý obsahuje 10 8 životaschopných H. suis
baktérie [11]. Negatívne kontrolná skupina bola očkujú do žalúdka s 200 ul Brucella bujónu na pH 5. Štyri týždne po inokulácii intragastrického, boli myši usmrtené cervikálnou dislokáciou nasledujúcom izofluranom anestézie (IsoFlo, Abbott, IL, USA). Zo zvierat usmrtená, bola odobratá krv srdcovou punkciou sterilné, centrifugovány (1000 g
, 4 ° C, 10 min) a sérum sa zmrazí pri -70 ° C až do ďalšieho použitia. Žalúdky boli vyrezané a vyrezané pozdĺž veľkého zakrivenia. Jedna polovica z žalúdkov, vrátane antra a fundu, bol okamžite umiestni do 1 ml RNA neskôr (Ambion, Austin, TE, USA) a skladuje sa pri -70 ° C pre ďalšie RNA-DNA a extrakcii. Pozdĺžny pás žalúdočné tkaniva je rez od pažeráka do dvanástnika the pozdĺž veľkého zakrivenia pre histopatologické vyšetrenie. Obrázok 1 Experimentálne design očkovanie štúdia. Na skupinu 10 myší boli dvakrát imunizovaní intranazálne 3 týždne intervalu, zakaždým s 30 ug rUreB + 5 ug cholera toxín (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT a 100 ug HS5 lyzáty + 5 ug CT (skupiny 1, 2 a 3, v uvedenom poradí). Skupiny 4 (falošne imunizované skupina) a 5 (negatívna kontrolná skupina) boli vrúbľovať intranazálne HBSS. Tri týždne po druhej imunizácii, bola odobratá krv z 5 myší na skupinu a jeden týždeň neskôr sa myšiam zo skupiny 1, 2, 3 a 4 boli do žalúdka naočkovaného 108 životaschopných H. suis
baktérií. Skupina 5 bola do žalúdka naočkuje HBSS. Štyri týždne po žalúdočného výzve, myši usmrtia.
Kvantifikácia H. suis
v žalúdku
Po rozmrazení, žalúdočné tkaniva boli homogenizované (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Nemecko) v 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chémia, Amsterdam, Holandsko) a DNA bola extrahovaná z inter- a organickej fázy, v súlade s pokynmi Tri Reagent® RT výrobcu. Bakteriálna zaťaženie v žalúdku sa stanoví za použitia skôr opísanej H. suis
konkrétne kvantitatívne real-time PCR (qPCR) [5].
Analýza odpovede žalúdka cytokinové
expresných hladín IFN-y, IL-4, IL-10, IL-17 a TNF-α boli hodnotené pomocou qPCR použitie cDNA syntetizované z žalúdka tkaniva, ako bolo opísané skôr [15]. Prahová hodnota cyklus hodnoty (CT) boli normalizované na geometrický priemer CT-hodnôt z referenčných génov, po ktorom normalizačne mRNA boli vypočítané za použitia 2 -ΔΔCt metóda [16].
Meranie odpovedí protilátok v sére enzým-linked ImmunoSorbent assay (ELISA) proteínu
Detektor ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) sa na ohodnotenie rUreB-, rNapA- a HS5 lyzátu špecifické IgG v sére. V stručnosti, 96 jamkami s plochým dnom doštičky (Nunc Maxisorp, Nunc Nalge Int., Rochester, NY, USA) boli potiahnuté 2 ug /jamku vyčistenej rNapA, 1 ug /jamku vyčistenej rUreB, alebo 1 ug /jamku H. suis
celých buniek proteíny rozpustené v 100 ul krycieho pufra (24 hodín, 4 ° C). Po blokovaní pomocou 1% hovädzím sérovým albumínom v PBS, 100 ul nariedeného séra 1/400 bolo pridané do každej jamky. Po ďalšom premytí 100 ul HRP-značené anti-myší IgG bol pridaný (H + L) vo finálnej koncentrácii 50 ng na jamku. Päť minút po pridaní 2,2'-AZIN-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfónová kyselina) (ABTS) roztoku peroxidázový substrát, absorbancia bola odpočítaná pri 405 nm (OD 405 nm).
Histopatologické vyšetrenie
pozdĺžne pásy tkaniva žalúdka boli fixované v 4% fosfátom pufrovanom formaldehydu, spracované štandardnými postupmi a vložené do parafínu. Pre vyhodnotenie gastritídy, hematoxylínom - eosínu (HE) zafarbené rezy 5 um boli slepo ohodnotené podľa stupňa infiltrujúcich lymfocytov, plazmatických buniek a neutrofilov, pomocou vizuálnej analógovej stupnice podobný Aktualizovaný Sydney systému (na stupnici od 0- 3) [17] s nasledujúcimi parametrami pre každú gastritídu skóre: 0 = žiadna infiltrácia mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky; 1 = mierne difúzny infiltrácie mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky; 2 = stredná difúzna infiltráciu mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo za prítomnosti jedného alebo dvoch zápalových agregátov; 3 = výrazná difúzna infiltráciu mononukleárnych a /alebo polymorfonukleárne bunky a /alebo prítomnosť aspoň troch zápalových agregátov.
Štatistická analýza
normality a homogenity variance dáta boli analyzované s použitím D'Agostino-Pearsona a Shapiro- Wilk test normality. Významné rozdiely v H. suis
kolonizácie a mRNA expresie cytokínov medzi skupinami bola hodnotená vykonávaním jednosmernej ANOVA analýzy. Bonferroniho viacnásobného porovnávacieho testu bol použitý ako post-hoc, kedy boli hodnotené rovnaké odchýlky. Dunnettov T3 Test post-hoc bola použitá, keď boli hodnotené žiadne rovné odchýlky. OD úrovne 405 nm z ELISA a histologické zápalu skóre boli porovnané Kruskall-Wallis analýzy, po ktorom nasleduje Mann-Whitney U
testu. Korelácia medzi rôznymi premennými, bola vypočítaná Rho Spearmanův koeficient (ρ
). GraphPad Prism5 softvér (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) bol použitý pre všetky analýzy. Štatisticky významné rozdiely medzi skupinami boli považované za p Hotel < 0,05.
Výsledky
Immunoproteomics H. suis
H. suis
Proteíny boli separované na 2D-PAGE (obrázok 2a). Po 2D-imunoblotu s zhromaždených sér z lyzátu imunizovaných (2b) alebo H. suis
, boli vybrané -infected zvierat (2C), celkovo 19 imunoreaktívnych proteínových škvŕn. Tieto škvrny boli vyrovnané s proteínových spotov, ktoré by mohli byť videné v paralelnom 2D-PAGE (obrázok 2a). Malá reaktivita proti H. suis
proteínov bola pozorovaná po infekcii sére v porovnaní s vysokou reaktivitou v porovnaní so sérami myší imunizovaných lyzátu. Keď bol blot skúšaný s sér získané z negatívnych kontrolných myší, žiadna špecifická imunoreaktívnych proteínové škvrny boli zistené (dodatkový file1). Škvrny záujmu (n
= 19) boli vyrezané z gélu, rozštiepi a identifikované pomocou LC-MS /MS analýzu. Podrobné výsledky týchto proteínov sú zhrnuté v tabuľke 1. miesta s najvyššou reaktivitou (bodové 1 až 5), boli identifikované ako UreB. H. suis
chaperonin GroEL, znázornená ako škvrny 9 a 10 na obrázku 2a, ukázal tiež silnú hybridizácii s séra zo zvierat lyzátu-imunizuje. Navyše, séra z myší imunizovaných lyzátu vykazovali silnú reaktivitu proti proteínu ureázy príslušenstvo (Urehu) a Ureáza podjednotka A (močovina) (spoty 15 až 19), ktorý bol menej výrazný v infikovanej skupine. Slabá reaktivita voči hlavnej flagellin FlaA (spoty 11-13) bol prítomný v oboch škvrny. Obrázok 2 H. suis 2D-proteomu profil (A) a Western bloty duplikátu 2D-gélu do reakcie s zmesných sér lyzátu imunizovaných myší (B) alebo H. suis -infected myší (C). 100 ug celkového proteínu extraktu H. suis
sa oddelí 2D-elektroforézy s použitím lineárnej pH 3 až 10 gradientu v prvom rozmere a 10% TrisHCI SDS-PAGE v druhom rozmere. Separované proteíny boli detekované farbením SYPRO®Ruby proteín. Oblasti v rámčeku ukazujú, kde boli imunoreaktívnych antigény vyrezané z gélu a podrobený LC-MS /MS. Identifikované proteíny sú označené číslami na mieste uvedených v tabuľke 1. Krabice a čísla v červenej farbe boli identifikované ako UreB. Postavenie molekulovej hmotnosti (MW) je uvedená na pravej strane, a hodnota pH sú uvedené v dolnej časti.
Tabuľka 1 imunoreaktívnych proteíny H. suis identifikovať podľa LC-MS /MS
Spot č.1
Fotogaléria meno Proteín
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. prispôsobená peptidy
maskot score4
ČOV. (%) 5
1
Ureáza podjednotky B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
117
1589
72
2
Ureáza podjednotku B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
80
1042
58
threonyl-tRNA syntetázu
EFX41598
thrS
6,34
69,315
7
186
60 Sims 3
Ureáza podjednotka B
EFX42254
UreB

5,97
62,967
80
903
46
4
Ureáza podjednotky B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
4
103
6
5
Ureáza podjednotky B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
4
103
6
6
30S ribozomálnu proteín S1
EFX42427
rpsA
8,29
64,051
23
625
28
CHINÓNOVOU reaktívne Ni /fe hydrogenase, veľké podjednotky
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
ureázy H. heilmannii
AAA65722
8,86
25,844
8
258
26
7
metyl-prijímanie chemotaxie proteínu
EFX43528
7.1
48.907
35
905
50
8
Predĺženie faktor G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
Chaperonin groEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
Chaperonin groEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
Ureáza podjednotky B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
43
682
41
11
flagellin systémom
EFX41982
flaA
7.77
54,232
29
756
47
12
flagellin systémom
EFX41982
flaA
7,77
54,232
57
1294
62
13
flagellin systémom
EFX41982
flaA
7,77
54,232
46
1085
63
spúšťacieho faktora
EFX42378
tig

5,13
49,587
12
343
24
14
Hydrogenase expresia /tvorba proteínu
EFX41790
hypB
5,59
27,617
15
314
35
nikotinát-nukleotidov pyrofosforylázy
EFX42191
naDC
6,46
30,591
11
219
25
7-alfa-hydroxysteroiddehydrogenázou dehydrogenáza
EFX41880
6,62
28.246
6
186
24
Konzervované hypotetický vylučovaný proteín
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
Hypotetický proteín HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
Ureáza vedľajšej proteín
EFX42255
Urehu
6,79
30,447
4
106
13
16
Ureáza podjednotky systémom
EFX42255
urea
7,79
27,389
24
270
55
17
Ureáza podjednotky systémom
EFX42255
urea
7,79
27.389
28
112 45
18
Ureáza podjednotky systémom
EFX42255
urea
7,79
27,389
57
418
69
19
Ureáza podjednotky systémom
EFX42255
urea
7,79
27,389
75
568
73
1 Protein škvrna zodpovedajúcu pozíciu na gélu a škvrny ( pozri obrázok 2)
2NCBI
: .. National Center for Biotechnology Information Sims 3 Teoretické izoelektrický bod (pí) a molekulová hmotnosť (MW)
4 Helicobacter
dát, maskot skóre vyšší. ako 40 sú významné (p
≤ 0,05).
5% z proteínové sekvencie, ktoré zodpovedá peptidy identifikovanej.
Potvrdenie sérového reaktivitu proti rUreB predaj z 2D-analýzy ukázali, UreB zreteľnou reaktivitu so sérom od lyzátu imunizovaných myší, ktoré neboli pozorované v sére z neimunizovaných ale infikovaných myší. S cieľom potvrdiť tieto údaje, bola vykonaná 1D-PAGE naložené rUreB, nasleduje imunodetekcí so sérom od lyzátu imunizovaných a H. suis
-infected myšou. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Charakterizácia profilov génovej expresie pre rôzne typy mastocytov združených z myší žalúdočné podoblastí metódou amplifikácie RNA
• Klinicko-patologické charakteristiky a prognostická analýza Lauren zaradenie do adenokarcinómom žalúdka v Číne