Plos ONE: multiplo Odpornost Related Long nekodiranih Analiza RNA Izražanje Profil želodčnega raka

Povzetek

Učinek kemoterapiji raka želodca (GC) je še vedno zelo slaba zaradi odpornosti proti več (MDR). Vendar pa mehanizmi, povezane z MDR v GC še zdaleč ni povsem jasen. Namen te študije je prikazati možne mehanizme MDR GC na glavnem nivoju dolgo nekodiran RNA (lncRNA). V tej študiji so celične linije GC, SGC7901 in dva MDR sublines, SGC7901 /VCR in SGC7901 /ADR tem v analizo na lncRNA mikromrež. Bioinformatika in poskusi preverjanja so bile izvedene, da razišče morebitne lncRNAs, ki sodelujejo pri razvoju MDR. Analiza pot je pokazala, da 15 poti sovpadala navzdol regulirane transkriptov in 20 poti sovpadala up-urejena transkriptov (p-vrednost cut-off je 0,05). GO analiza je pokazala, da so bile najvišje obogatene GOS usmerjeni tudi do reguliranih transkriptov "razvoj sistema" in najvišje esenriched GOS Ciljne navzdol urejeno transkriptov bili "sterol proces biosintezne". Naša raziskava je prva, ki zasliševali diferencialno izraženih lncRNAs v GC človeške celične linije in MDR sublines in kaže, da so lncRNAs koristno za nadaljnje študije, da bi se nove kandidatke biomarkerjev za klinično diagnozo MDR in potencialnih ciljev za nadaljnje zdravljenje.

Navedba: Wang Y, Wu K, Yang Z Zhao Q Fan D Xu P, et al. (2015) multiplo Odpornost Related Long nekodiranih RNA Expression Profil Analiza želodca raka. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461

Urednik: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, UNITED STATES

Prejeto: 24. december 2014; Sprejeto: 22. julij 2015; Objavljeno: 20. avgust 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga: Vse surovo podatkov in normalizirana podatki so prikazani v http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Financiranje:. To delo je bilo podprto z nacionalno Program na Key Temeljni raziskovalni projekt ( "973" Program, št 2010CB529302, št 2010CB529305, št 2010CB529306); National Natural Science Foundation of China (št 81301763); Henan pokrajinski ključnih znanstvenih in tehnoloških projektov (št 142102310473); Key Program, National Natural Science Foundation of China (št 81030044)

Konkurenčni interesi:.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rezistenco ( MDR) ostaja velika ovira za neuspeh kemoterapije pri zdravljenju raka želodca, ki je vodilni vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu. Več pojavom proteinov, povezanih z odpornostjo (MRP) [1] ali miRNAs [2], ki posreduje MDR skozi so bili različni mehanizmi predhodno ugotovljene. Vendar pa mehanizmi, povezane z MDR v GC še zdaleč ni popolnoma jasno.

genomov zaporedja pokazala, da Evkarionti genome kodirajo presenetljivo veliko število nekodirano prepisov v primerjavi z prokariontski genomov. Med temi nekodirano transkriptov, mnogi so dolge nekodiranih RNA (lncRNAs), ki igrajo pomembno vlogo pri urejanju mRNA transkripcijo ali prevod na transkripcijskih ali po transkripcijskih ravni. lncRNAs so RNA, ki nimajo možnosti kodiranja, ki so > 200 bp in račun za vsaj 80% transkriptov celotnega genoma [3]. Kopičijo podatki kažejo, da lncRNA igra pomembno vlogo pri regulaciji mRNA [4], organelle BIOGENESIS [5] subceličnih trgovina molekul [6], in razvoj celic [7] [8].

LncRNA disregulacijo je bil vpleten v več vrst bolezni, vključno z rakom ^{[ 4 , 9 , 10 ]. Namreč, lahko lncRNAs igrajo pomembno vlogo v rakotvornost, metastaz in invazivnosti večkratnih malignih tumorjev skozi vplivalo onkogensko izraz. Na primer, COX-2-lncRNA, PACER, delujejo kot novi potencialni cilj za COX-2-modulacije pri vnetju in raku [11]; -RNAi posredovano knock-down od LINC01081 v normalnih fetalnih pljučnih fibroblastov je pokazala, da lncRNA to pozitivno uravnava raven FOXF1 prepis, nadalje kaže, da je upad LINC01081 izražanja lahko prispeva k razvoju alveolarne kapilarne displazija s neusklajenosti pljučnih žilah [12]; lncRNA HotAir lahko tudi dragoceno napovednik za obvladovanje raka debelega črevesa [13] in MALAT1 lahko šteje kot potencialni prognostični kazalec in je lahko tarča za diagnozo in genske terapije za trebušne slinavke lepilnim adenokarcinom [14]; čezmernim lncRNA H19 povečuje kancerogenosti in metastaze raka želodca in učinek H19 v GC se posreduje neposredno uravnavanjem ISM1 in posredno zatiranje CALN1 izražanja prek miR-675 [15]. Zato, da se predhodno vpogled v molekularnih mehanizmov MDR GC, smo raziskovali lncRNA izraz profil GC MDR sublines.}

Tukaj smo raziskovali je različno izražanja profile lncRNAs in mRNK med GC cellline SGC7901 in MDR sublines SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR uporabo lncRNA analize mikromrež. Primerjava različno izraženih transkriptov med sublines in starševsko cellline pokazala 15 poti, ki so ustrezala navzdol urejeno transkriptov in 20 poti, ki so ustrezala do reguliranih transkriptov (p vrednost cut-off je 0,05). Gene ontologijo (GO) Analiza je pokazala, da so najbolj obogatene GO pogoji za up-urejena transkriptov "razvoj sistema", "nukleosomom" in "zavezujoč" in najbolj obogatene GO pogoji za navzdol urejeno transkriptov bili "sterol biosintezne proces "," celična periferija "in" steroidno dehidrogenaze ". Naši rezultati so pokazali, da so lncRNA in mRNA izraz profili bistveno razlikovale med MDR sublines in starševsko celline. Ta ugotovitev kaže, da bi se neobičajne ekspresijski nivoji lncRNAs prispevajo k razvoju MDR GC. Nadaljnje preučevanje razlik v lncRNA izraznih profilov lahko zagotovijo nove potencialne metode za vzvratno MDR fenotip GC.

Rezultati

različno izražena lncRNAs

podatki mikromrež highthroghput lncRNA pokazali skupno 27,883 lncRNAs izraženih v želodcu cellline raka, SGC7901 in dva multiplo odpornost sublines, SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR (S1 tabela). Izpeljati odnose med osebki, je hierarhična analiza povezovanje uporablja urediti celllines v skupine glede na njihovo raven izražanja, ki predstavljajo odnose načinov izražanja lncRNA med celllines (Slika 1A in 1B). Nadaljnja raziskava teh podatkov razstavljena v povprečju 1637 različno izražena lncRNA. Med njimi je 638 so bile ves up-urejena in 999 so bile dosledno navzdol urejeno (raztegljiv change≥2.0) (S2 tabela). ASHG19A3A028863 (raztegljiv spremembe: 146.0139) je najbolj (sprememba krat: 58,7105) reguliran lncRNA in ASHG19A3A007184 je najbolj navzdol urejeno lncRNA. Poleg tega so bile navzdol regulirane lncRNAs bolj pogosti kot reguliran lncRNAs v naših mikromrež podatkov (S2 tabela).

različno izražena mRNA

je bilo 19,644 mRNA, opredeljeni v sublines GC MDR analizirane mRNA izraz profiliranje podatkov z uporabo analize mikromrež in hierarhično analizo grozdenje predstavil odnose med načini mRNA izražanja, ki so bile prisotne v sublines GC MDR in starševske celline (slika 2A in 2B) (S3 tabele). Med različno izražena mRNA med SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR in SGC7901, 730 je bilo vedno up-urejena in 650 je bila vseskozi navzdol urejeno v SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR celllines primerjavi s SGC7901 (slika 2B). (S4 tabelo). NM_000735 (gen simbol: CGA, kratna sprememba: 106.19), je bila najbolj up-urejena mRNA in NM_001136574 (gen simbol: LANCL1, raztegljiv sprememba: 25.43) je bil najbolj navzdol urejeno mRNA (slika 2B)

GO analiza

Za določitev gen in genski produkt atributov v bioloških procesih, celičnih komponent in molekularnih funkcij, je bila analiza Gene Ontologija (GO) opraviti s tem. Fisherjev test, ki je narejeno za test, če je bolj prekrivata seznama DE in seznam pripisa GO, kot bi pričakovali po naključju. P-vrednost označuje pomen GO pogoji obogatitve v genih DE. Nižja kot je p-vrednost, tem bolj pomemben GO Term (vrednost p < = 0.05 je priporočljivo). Izkazalo se je, da so bile najvišje obogatene GOS zastavljene s up-urejena transkriptov tkivo homeostaze (GO: 0048731; ontologijo: biološki proces; p = 6.84E-08) (slika 3A), nukleosomom (GO: 0000786; ontologijo: mobilno komponento; p = 2.10E-07) (slika 3B) in zavezujoča (GO: 0005488; ontologija: molekularna funkcija; p = 0,001) (slika 3C), in da so bile najvišje obogatene GOS Ciljne navzdol urejeno transkriptov sterol proces biosintezne (GO: 0016126, ontologija: biološki proces; p = 0,000) (slika 3D), celica periferije (GO: 0071944; ontologijo: mobilno komponento; p = 3.80E-06) (slika 3E) steroid dehidrogenaze (GO: 0016229; ontologijo: molekularna funkcija; p = 0,001) (Slika 3F) (S5 Table)

Pathway analiza

V tej študiji, analiza pot razstavljene, da se 20 poti dosledno sovpadala up-urejena transkriptov in da je najbolj. obogatena mreža je bila "alkoholizem-Homo sapiens (človek)" (Fisher-P vrednost = 3.66E-08), v sestavi 24 ciljnih genov (slika 4A); Poleg tega je analiza pot tudi pokazala, da 15 poti dosledno sovpadala navzdol regulirane transkriptov in da je najbolj obogatena omrežje je "steroidov biosinteze-Homo sapiens (človekovih)" (Fisher-P vrednost = 0,00044) v sestavi 5 ciljnih genov (slika 4B ) (S6 Tabela se priporočam p-vrednost cut-off je 0,05). Med temi poti, so poročali gen kategorija "cirkadiani ritem" motnje, da je povezana z različnimi vrstami raka, vključno z rakom želodca [16], kronične mieloične levkemije [17], glave in vratu skvamoznega karcinoma [18], karcinomom jetrnih celic [19 ], endometrija, karcinoma [20] in rak dojke [21]. Kategorija gen "NOD podobnih signalizacija receptor pot", ki je sestavljena iz NOD1, je pokazala, da NOD1 /CARD4 in NOD2 /CARD15 polimorfizmi je lahko povezana s spremenjenim tveganjem želodčne [22], kolorektalnega [23], pljuč [24 ] grla [25], žolčnika [26], trebušne [27], tankega črevesa, ledvic [28], urinske rak mehurja [29], kožni rak, limfom [30] in levkemija [31]. Tukaj smo podrobneje proučiti izražanje in funkcijo Arnt (aril ogljikovodikov receptor jedrska translocator) posredovano MDR1 (rezistenco 1) do regulacije poti. Ugotovljeno je bilo, da so EKBL in MDR1 precej up-urejena v SGC7901 /ADR in SGC7901 celičnih linij /VCR primerjavi z SGC7901, je bil učinek večjega up-regulacijo MDR1 posredovane s Arnt izraz vektor transfekciji ogrožena preko Sp1 siRNAs transfekciji. Plate kolonija oblikovanje testa so pokazali, da so bile cene za sestavo celične kolonije SGC7901 /ARS remarably višje v pARNT + /siSp1- skupina v primerjavi z pARNT + /siSp1 + skupini z adriamicin (ADR) dodatka v kulturi Meida (p < 0,0001) (slika 5).

realnem času kvantitativne PCR potrditev

Da bi preučili podatke mikromrež, šest up-urejena lncRNAs in deset premalo urejena lncRNAs so naključno izbranih iz dosledno različno izraženih lncRNAs uporabljajo SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR in SGC7901 cellines in QRT-PCR rezultati in podatki mikromrež so skladni (slika 6A); nadalje preuči nivoje izražanja teh lncRNAs v želodčnih tkivih drog odporna dvajset drog odporen na želodčni vzorci in paru vsaki rezistenten proti tkiva so bili pregledani za nivo ekspresije teh lncRNAs pomočjo kvantitativne PCR v realnem času (QRT-PCR) (slika 6B) .The rezultati pokazali, da afformentioned vzorci želodca z rakom, zdravljenih s ADR 5 dni razstavljena pomembne razlike v stopnjah izražanja v teh šestnajstih lncRNAs v primerjavi s kontrolno skupino (slika 6c). Poleg tega je analiza korelacije je pokazala, da so bile stopnje izraženosti lncRNA NR_015379 negativno povezana s stopnjami inhibicije teh dvajsetih želodcu vzorcev zdravila odpornih (slika 6D in 6E, p < 0,01).

Pogovor

Naše predhodne raziskave so že ugotovili, da lahko miR-21 spodbujajo odpornost na zdravila različnih vrst raka [32]; LncRNA-MRUL spodbuja ABCB1 izraza v pojavom odporna na želodcu sublines rakavih celic [33]; CUTL1 dejavnost obratno povezana z odpornosti na zdravila, zato je privlačna terapevtski cilj, da se spremeni upor mnogovrstnimi z rakom želodca [34]; želodčne CSCS so bile ugotovljene-VCR kondicionirati SGC7901 celične linije, značilna visoka tumorjev in sposobnost samo-obnove in diferenciacije [35]; MAD2 lahko igrajo pomembno vlogo pri razvoju raka človeške želodčne in da lahko utišanje gena MAD2 pomaga, da se ukvarjajo s odpornosti proti več želodčnih rakavih celic [36] in, hipoksija vzbudil MGr1-Ag /37LRP izražanja, ki jo aktivira HIF-1 odvisna o aktiviranju ERK. Ti dogodki so odvisne od reaktivnih kisikovih intermediatov [37] .Vendar, mehanizmi odpornosti proti več o GC so veliko bolj pojasniti in lncRNAs disregulacijo GC MDR sublines še niso bili raziskani.

V tej študiji, GC celične linije , SGC7901 in dve MDR sublines, SGC7901 /VCR in SGC7901 /ADR so bili opravljeni analizi za lncRNA mikromrež. Bioinformatika in poskusi preverjanja so bile izvedene, da razišče morebitne lncRNAs, ki sodelujejo pri razvoju MDR. Analiza pot je pokazala, da 15 poti sovpadala navzdol regulirane transkriptov in 20 poti sovpadala up-urejena transkriptov (p-vrednost cut-off je 0,05). GO analiza je pokazala, da so bile najvišje obogatene GOS zastavljene s up-urejena transkriptov "razvoj sistema" in najvišje esenriched GOS Ciljne navzdol urejeno transkriptov bili "sterol proces biosintezne".

Povečanje dokazi pokazali, da lncRNA ( dolgo nekodiran RNA) bi lahko imel pomembno vlogo pri kancerogenosti in tumorske invazije in metastaz [38]. Na primer, John [39] itd pokazali, da lncRNA PCGEM1
je povezana z rakom na prostati; preoblikovanje rastni faktor-β-inducirano lncRNA-Smad7 je bilo ugotovljeno, da inhibira apoptozo rakavih celic miši dojke JygMC (A) in s tem predlagamo ed kompleksen mehanizem za urejanje anti-apoptotični in tumorsko progresivne vidike TGF-P signalizacije [40]; lncRNA, prostate, rak povezan Prepis 29 (PCAT29), je zaznamovalo skupaj z njeno razmerje do androgene receptorje, delovala kot-androgene urejeno zaviralnih pri raku prostate [41]; Yuan itd odkrili novo TGF-β-inducirano lncRNA, lncRNA-ATB, ki je spodbudil EMT z zaplembo MIR-200S in olajšano kolonizacijo s stabilizacijo IL-11
mRNA, s čimer se spodbuja tako zgodnje in pozne faze raka metastaze [42].

Prav tako je bilo ugotovljeno, da lncRNAs igrajo osrednje vloge pri spreminjanju ekspresije kodiranja proteinskih genov preko cis- ali trans mehanizmov. Tu smo ugotovili, da lncRNAs up-urejena v SGC7901 /ADR in SGC7901 /videorekorder v primerjavi z SGC7901lncRNA kot AF119893, ki je bil intronskih nezaznavnih za NRP2 (nevropilin-2). Predlagano je bilo, da ima NRP2 /VEGF-C os vlogo pri raku mehurja odpornosti terapijo in VEGF-paxillin-NRP2 poti lahko predstavljajo nov terapevtski cilj za raka in druge bolezni, povezane z angiogenezo. lncRNA AF461897 je intron občutek, prekrivanje ABCB9. Dong etc je pokazala, da miR-31, ki deluje anti-apoptotske učinek najverjetneje z inhibicijo ABCB9 in tako zagotoviti novo strategijo, ki vključuje uporabo miR-31 kot potencialne tarče v pljuč kemoterapijo. lncRNA BC065904 je intron občutek, prekrivanje CTBP2, eden od transkripcijskih corepressors v C-terminalnem vezavni protein (CtBP) družine, ki je deloval kot corepressor za E2F7 in kot regulator odgovor poškodbe DNA. lncRNA NR_026900 je ekson občutek-Prekrivanje QSOX1, ki je bilo dokazano, da se zmanjša proliferacijo, migracijo in vdor celic raka dojke in vitro in zmanjšuje rast tumorja in vivo.

Po drugi strani pa lncRNAs navzdol regulirano v SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR primerjavi z SGC7901lncRNA kot AF113689 je naravno antisense do RRM1. Khatri itd so poročali, da predhodno izpostavljenost RRM1 siRNA zmanjšala IC50 vrednost gemcitabin hidroklorida 5 gube v A-549 celic v primerjavi s samim gemcitabinijev klorid, kar kaže, da je bil RRM1 potencialni onkogena pljučnega raka. lncRNA uc010iyh je intronskih protismiseln od NAIP (nevronov Apoptoza Zaviralni beljakovin), ki je eden od IAP-družino. Dokazano je, da je mogoče IAPs vpleten v motnjo prostate (BPH, PIN in PC) razvoja, saj lahko povzročijo inhibicijo apoptoze in posledično celično proliferacijo. LncRNA uc003jsd je ekson občutek-prekrivanja PDE4D, t.j., cAMP specifično 3 ', 5'-cikličen fosfodiesteraze 4D. Lin itd pokazala, da PDE4D funkcije kot tumorsko spodbujanje dejavnik in predstavlja edinstveno ciljati encim rakavih celic. LncRNA NR_002332 je ekson občutek, prekrivanja ST7, supresor tumorjev 7, ki je bila predlagana, da je zaviralnih genov na kromosom regiji 7q31.1-q31.2.

analiza Pathway pokazala možne poti, ki sodelujejo pri razvoja odpornosti proti več zdravilom (MDR), raka želodca. EKBL je bil eden izmed 20 poti dosledno ustrezalo up-urejena transkriptov in so poročali, da sodelujejo pri razvoju odpornosti proti več zdravilom večkratnih malignih tumorjev [43], vključno z diseminiranim plazmocitomom [44], in AML (akutna mieloična levkemija) [45] . MDR1 kodira P-glikoprotein, ki je energetsko odvisna iztočni črpalka, ki lahko izvažajo ravninski hidrofobne molekule, vključno z nekaterimi citostatikov, kot adriamicin, cisplatin, taksola in tako naprej iz celice [46, 47]. Tukaj smo ugotovili, da so bili EKBL in MDR1 precej up-urejena v SGC7901 /ADR in SGC7901 celičnih linij /VCR compacared na SGC7901, učinek večjega up-regulacijo MDR1 posredovane s Arnt izraz vektor transfekciji bila ogrožena preko Sp1 siRNAs transfekciji, ki poudarja vlogo EKBL-MDR1pathway v MDR fenotip raka želodca.

Nadaljnja preiskava je pokazala, da je morda bilo nekaj kodiranja beljakovin geni vključeni v fenotip odpornosti za zdravila in razvoj malignih tumorjev cis-ureja soodvisnih lncRNAs . Na primer, ABCB1 (ATP-vezavna kaseta, sub-družina B (MDR /TAP), član 1, P-glikoproteina (P-gp), ki kodira gen), ki se nahaja 400Kb gorvodno od lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-povezane in navzgor urejeno lncRNA), je bila precej up-urejena z morebitno dodatno opremo, kot so vloge, ki jo MRUL igral in napredoval drog odpornost fenotip SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR celic [33]; ADAM22, kandidat gen za maligno transformacijo endometrioze jajčnika [48], je bila povezana z lncRNA AL133090 v eksonu-sense prekrivajo način; PLCG1 bila povezana z lncRNA AK021471 v intron-občutek prekrivajo način in ponavljajoče se mutacije v PLCG1 je opredeljena v angiosarkomov [49]; FYN bila povezana z lncRNA AK AK090692 je z intron občutek prekrivanja način in antagomir-1290 zatira CD133 (+) celice v nedrobnoceličnim rakom pljuč z usmerjanjem v zvezi z Fyn Src družina tirozin kinaze [50], itd

Ta študija je pokazala, da je bila deregulacija lncRNAs ukvarja z razvojem multidrug odpornosti phynotype raka želodca. Nadaljnja analiza teh lncRNAs in sorodnih poti lahko zagotovi vpogled v mehanizme kemoterapije odpornosti na zdravila za raka na želodcu in zagotoviti nove smernice za povratne rezistenco phynotype.

izjava Etika materiale in metode

Vse poskuse je odobril revizijski odbor institucionalne četrtega vojaške Medical University. Pisna privolitev je bila pridobljena na vseh vzorcih bolnikov.

Celične linije in celična kultura

GC celično linijo človeških SGC7901 je bila pridobljena na Akademiji za vojaške medicinske vede (Peking, Kitajska). Dve rezistenten proti sublines, SGC7901 /VCR in SGC7901 /ADR, so razvili v našem laboratoriju [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR in SGC7901 gojimo v RPMI1640 mediju (Thermo Scientific Co., ZDA), ki je bila dopolnjena z serumu 10% fetalni telečji (FCS) (Thermo znanstvene Co., ZDA) v vlažnem inkubatorju s 5% CO2 pri 37 ° C. Videorekorder (1,0 mg /ml) ali ADR (0,5 mg /ml) dodamo v gojitvenem mediju ustreznih celic vzdrževati fenotip drog odporni.

RNA izolacija, označevanje in nizi hibridizacija

Total RNA je pridelano iz SGC7901, SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen, CA, ZDA) in RNeasy Kit (Qiagen Co., Nemčija), v skladu z navodili proizvajalca, vključno koraku DNaze prebavo. Skupno RNK iz vsakega cellline smo kvantificirali z uporabo NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), integriteto RNA je bila ocenjena z uporabo standardnih denaturaciji elektroforezo na agaroznem gelu in čistost je bila ocenjena z razmerjem absorbance pri 260 nm do 280 nm (A260 /A280). Double-verižni cDNA (ds-cDNA) smo sintetizirali z uporabo 5 ug celotne RNA z Invitrogen nadpisano ds-cDNA sinteze kit v prisotnosti 100 pmol oligo dT primerji. Nato smo se ds-cDNA označeni in izvedemo hibridizacijo, kot je prej opisano [52]. Označevanje RNA in mikromrež hibridizacija je opravila KangChen Bio-tech, Shanghai, PR China.

Highthroughput lncRNA izraz profil analiza

kvalificirana RNA je bila uporabljena za sintetiziranje dvojno vijačnico cDNA z uporabo Nadpisano dvojno nasedli cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., ZDA). Dvojno vijačnico cDNA smo označili in hibridizirali za človeško LncRNA mikromrež V2.0 (Arraystar Co. ZDA). mikromrež V2.0 vsebuje približno 33000 lncRNAs zbrane iz verodostojnih virov podatkov, vključno z NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs iz književnosti in UCRs. Sekvence so bile izbrane z lastniškimi strategij. Ponovite zaporedja in ncRNAs krajše od 200 bp je bilo izbrisanih. Za izboljšanje statističnega zaupanja, je vsak človek lncRNA paleto sestavljajo 60,302 različnih sond (60 Mers) in vsak prepis je zastopal 1-5 sondami. Vsak prepis je zastopal specifično sondo križišča EXON ali spoja za identifikacijo posameznih prepisov natančno. Mikromrežno hibridization in genske analize smo izvedli s KangChen Bio-tech, Šanghaju, LR Kitajska. Neobdelani podatki intenzivnosti in normalizirani podatki so prikazani v Gene Expression Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Kvantitativna PCR v realnem času (QRT-PCR)

skupno RNA SGC7901, SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR smo izolirali s pomočjo TRIzola reagenta (Invitrogen, CA, ZDA) in nato reverzno transkripcijo uporabo PrimeScript RT reagenta Kit z gDNA Eraser (Popolna realnem času) (Takara, Dalian Kitajska) po konstrukcij proizvajalca. Izraz osmih do reguliranih lncRNAs in šest navzdol reguliranih lncRNAs je bila izmerjena s QRT-PCR z uporabo SYBRGreen teste (Takara, Dalian, Kitajska), in GAPDH je bila uporabljena kot notranji nadzor. Primerji so navedene v tabeli 1. nivo izražanja vsakega lncRNA je bila predstavljena kot kratna sprememba z uporabo 2- △△ ct metod. Stopnja izraz lncRNAs različno izražena med SGC7901 in MDR sublines SGC7901 /ADR in SGC7901 /VCR smo analizirali z uporabo t-test z SPSS (različica 17,0 SPSS LNC). Vrednost p < 0.05 je zdelo pomembno.

Histoculture Drug Response Vsebnost (HDRA) Sveže GC tumorsko tkivo je bilo pridelano iz vsake kirurško odstranjenimi vzorcem in postavi v 24 vdolbinami. Kocke kolagen gel gobo (1 cm ^{3) potopimo v 1 ml RPMI 1640 dopolnjevanjem z 20% fetalnega govejega seruma. Tumorske tkiva smo dali na kolagenske gobice dodamo ARS pri končni koncentraciji od 6 ug /ml in jih inkubirali pri 37 ° C s 5% CO2 sledi. Tumor tkiva s fiziološke raztopine (N.S) brez ADR so bili uporabljeni kot kontrolo. Vrednotenja in računske metode, kot je opisano prej [53]. Stopnja inhibicije (IR) rasti tumorja = (1-srednja absorpcijo zdravljenih vdolbinic na gram tumorja /pomeni absorbanco kontrolne vdolbinice na gram tumorja) x 100. V tej študiji je bila IR cut-off vrednost enaka ali večja od 30% (IR30), opredeljen kot chemosensitivity glede na predhodno rezultata študije [54]. Tako kot naročeno, naj bi klinika patološko informacije vira tumorskega tkiva uporabile za HDRA dati oziroma so bili predstavljeni v tabeli 2.}

celičnih linij in Kultura vpliva

GC celične linije človeške SGC7901 je pridobljeno iz akademije vojaških medicinskih znanosti (Peking, Kitajska). Rezistenten proti sublines SGC7901 /VCR in SGC7901 /ADR so razvili v našem laboratoriju. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, in SGC7901 smo kultivirali v RPMI 1640 medija (Thermo znanstvenega, ZDA), dopolnjena z 10% fetalni telečji serum (FCS) (ThermoScientific) v 5% CO2 navlažen inkubatorju pri 37 ° C. Vinkristin (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO, 1,0 mg /ml) in ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO, 0,5 mg /ml) dodamo v gojišče ustreznih sublines celic do ohraniti fenotip drog odporna

Gradnja pcDNA3.1 (+) -. EKBL plazmida

za prekomerno hitre Arnt, pcDNA3.1 (+) - EKBL plazmid je bil zgrajen. Človeško EKBL cDNA izražanje vektor (pcDNA3.1 (+) - EKBL) je bila zgrajena CW Biotech Co Ltd, Peking, Kitajska. Na kratko, plazmid pcDNA3.1 (+) - smo EKBL nastane po cDNA sekvenco iz GenBank. Gen EKBL je bil ustvarjen s PCR. Plazmid pcDNA3.1 (+) je bila vzeta s kompletom Maxi Priprava (Omega, Georgia, ZDA). Produkt PCR subkloniramo v BamHI (Takara, Mountain View, ZDA) in Hindlll (Takara) straneh pcDNA3.1 plazmida s T4 ligaze (Takara, Mountain View, ZDA). PcDNA3.1 (+) -. EKBL konstrukt je preverila DNK sekvenciranja (Invitrogen, Grand Island, ZDA) (podatki niso prikazani)

generacija Arnt stabilna celičnih linij

SGC7901 /ADR celico smo kultivirali pri 12 vdolbinami pri 1,0 x 10 ^{5 celicah v vsako vdolbino, v inkubatorju s konstantno dobavo 5% CO2 pri 37 ° C. Gojišče smo spremenili 24 ur kasneje z različnimi koncentracijami G418 antibiotika G418 (600 mg /ml) in zamenjati vsakih 3 dni 14 dni po celične kulture. Starševski celice smo transfektirali z pcDNA3.1 (+) - Arnt plazmidov uporabo Lipofectamine 2000 v skladu z navodili proizvajalca. Gostota celic je 2 x 10 5 celic na jamico v šestih vdolbinami. Monoklonsko celica kolonija z odpornostjo G418 je bila pripravljena po metodi, ki omejuje redčenja z gojenjem enotno celico 100 ml medija pri 96 vdolbinami 24 h. kolonije monoklonskih celic so razgradili 15 dni za nadaljnjo ojačanje do kulture celic s stabilno Arnt izražanja v 24 vdolbinami. Celice smo prenesli v celični kulturi bučke dokler ni bila približno 90% konfluentne. V Arnt preveč izražene celične linije, ki jih pcDNA3.1 transfektirane (+) - EKBL so bili imenovani kot SGC7901 /ADR Arnt}

Mali interference RNA (siRNA) transfekciji

Za rasklapanje EKBL mRNA izraz. smo opravili siRNA transfekciji. Za transfekcije so Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in 50 nM siRNA (Gene Pharma Co., Šanghaj, Kitajska) se uporablja v skladu s priporočili proizvajalca kot prej [55] opisano. Je siRNA sekvence, ki se uporabljajo, so: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'

Western blotting

Skupno celični protein smo lizirali z uporabo lizni pufer, dopolnjen z fenilmetilsulfonil fluorid (1 mM. ) na ledu. Nato smo proteinski elektroforezi z 12% SDS poliakrilamidnem gelu in prenesli na PVDF membrano (Millipore, Massachusetts, ZDA). 5% nemastnega mleka v prahu je bila uporabljena za blokiranje membran pri sobni temperaturi 1 uro in primarna protitelesa inkubiramo preko noči. Naslednji smo membrane inkubirali s sekundarnimi protitelesi označena s HO 1 uro pri sobni temperaturi po treh 10-min opere v trietanolamin pufrani fiziološki raztopini s Tween (TBS-T). Končno so zaznali signale z uporabo ECL komplet (Pierce Biotech., Rockford, IL, ZDA) in membrane skenirane in jih analizirali z ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, ZDA) slikanje sistem s programsko opremo za preslikovanje (različica 1.0) . Tubulin smo uporabili kot notranje kontrole. Spectra multicolor široko paleto protein lestev (Beyotime, Jiangsu, Kitajska), je bila uporabljena kot molekularni označevalec. Protitelesa, ki se uporabljajo v zahodni blot test je razvidno iz tabele 3.

Plate kolonija oblikovanje testa

log-fazne celice so bile pridelane, zasadili na šest vdolbinami (1 × 10 ^{4 celic /vdolbinico), in kemoterapevtske droge dodamo v medij kulture na drugi dan. Dobljene kolonije smo obarvali s Coomassie Brilliant Blue (Sigma, Inc., St. Louis, MO, ZDA), ter vidne kolonije so bili prešteti po 2 tednih.}

Analiza podatkov

V tem študija, ki so informacijskimi analiza podatkov izvaja KangChen Biotech (Šanghaj, PR Kitajska) .Vse od diapozitivov so skenirane pri 5 lm /ločljivost uporabo Axon GenePix 4000B skener (Molecular Devices Corporation), ki ga GenePix Pro 6,0 programske opreme (Axon) runed. Skenirane slike (formata JPEG) smo nato izvedli omrežje poravnavo in podatkov izraz analizo s pomočjo NimbleScan programske opreme (različica 2.5). Podatki Expression smo normalizirali s Robustna Veććipno povprečje (RMA) algoritem vključen v programsko opremo NimbleScan. Poleg tega so bile datoteke ravni sondo in datoteke na ravni mRNA ustvarjeni po normalizaciji. Vse datoteke na ravni genov je bilo uvoženo v Agilent GeneSpring GX programske opreme (različica 11.5.1) in normaliziran s strani kvantil metodo; Nato je bil boj programska oprema za prilagoditev normalizirano intenzivnost odstraniti paketnih učinke. Znatno so bile ugotovljene različno izražene lncRNAs in mRNA s filtriranjem Volcano Plot. Hierarhično grozdenje je bila izvedena s pomočjo Agilent GeneSpring GX programske opreme (različica 11.5.1) [56]. Podatki so bili izraženi kot sredstvo ± standardni odklon (SD). Linearna korelacijska analiza je bila opravljena z metodo Pearson v SPSS, verzija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Razlike so bile upoštevane pomembno pri vrednosti P o < 0.05.

Podpora Informacije
S1 tabelo. V lncRNA izraz profiliranje podatkov
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s001
(XLS)
S2 tabele. Dosledna up-urejena in navzdol regulirano lncRNAs med SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR in SGC7901
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s002
(XLS)
S3 tabeli. MRNA izraz profiliranje podatkov
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s003
(XLS)
S4 tabeli. Dosledna up-urejena in navzdol regulirano mRNK med SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR in SGC7901
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s004
(XLS)
S5 tabeli. Gene Ontologija (GO) analiza
doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s005
(XLSX)
S6 tabeli.

• Plos ONE: Serum HER2 je potencialni nadomestek za tkiva status HER2 želodčnega raka: sistematični pregled in Meta-Analysis
• Plos ONE: HIF-1α inducira rezistenco v želodcu raka celic, ki jih indukcijo MIR-27a