PLoS ONE: daugiskaitos Atsparumas Susiję Rimta Ne kodavimo RNR išraiška Profilis Analizė skrandžio vėžio

Anotacija

chemoterapijos skrandžio vėžio (GC) poveikis išlieka labai prasta, nes atsparumo vaistams (MDR). Tačiau mechanizmus, sukeliančius MDR GC išlieka toli nuo visiškai suprantama. Šio tyrimo tikslas yra parodyti galimus mechanizmus GC MDR ne daugiausia laiko ne kodavimo RNR (lncRNA) lygiu. Šiame tyrime, GC ląstelių linija, SGC7901 ir du MDR sublines, SGC7901 /VCR ir SGC7901 /AGS buvo atliktas lncRNA mikrogardeliq analizė. buvo atlikta Bioinformatika ir tikrinimo eksperimentai ištirti galimą lncRNAs, dalyvaujantiems MDR plėtrai. Kelias analizė parodė, kad 15 keliai atitiko žemyn reguliuojama nuorašai ir 20 keliai atitiko iki reguliuojama nuorašai (p-reikšmė nutrūkimas 0,05). GO analizė parodė, kad aukščiausia praturtintas kilmės garantijos tiksliniai iki reguliuojamų nuorašai buvo "sistemos kūrimas" ir aukščiausios esenriched kilmės garantijos taikiniu žemyn reguliuojama nuorašai buvo "sterolio biosintezės procesas". Mūsų tyrimas yra pirmasis apklausti skirtingai išreikštas lncRNAs į žmogiškąjį GC ląstelių linijos ir MDR sublines ir rodo, kad lncRNAs yra verta toliau mokytis, kad būtų naujoviškas biologiniai žymenys kandidatas į klinikinę diagnozę MDR ir potencialiems taikiniams tolesniam gydymui.

nurodomoji dalis: Wang Y VU K Jonas Z Zhao K, ventiliatorius D Xu p et al., (2015) daugiskaitos Atsparumas Susiję Rimta Ne kodavimo RNR išraiška Profilis Analizė skrandžio vėžio. PLoS ONE 10 (8): e0135461. Doi: 10,1371 /journal.pone.0135461

redaktorius: Jin K. Cheng H.Lee Moffitt Vėžys centras "& Tyrimų institutas, JAV

Įstojo: Gruodžio 24, 2014; Priėmė: Lie 22, 2015 m Paskelbta rugpjūčio 20, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas: Visos žalias duomenų ir normalizuota duomenys buvo parodyta http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas nacionalinių programa Key pagrindinio tyrimo projekto ( "973" programa, Nr 2010CB529302, Nr 2010CB529305, Nr 2010CB529306); Nacionalinis gamtos mokslo fondas Kinijos (Nr 81.301.763); Henan provincijos pagrindinėse mokslo ir technologijų projektai (Nr 142.102.310.473); Pagrindiniai programa, Nacionalinis gamtos mokslo fondas Kinijos (Nr 81.030.044)

konkuruojančių interesų:.. Autoriai paskelbė, kad konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

naviko atsparumą daugeliui vaistų ( MDR) išlieka pagrindinė kliūtis chemoterapijos nepakankamumo skrandžio vėžio gydymui, kuris yra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirties visame pasaulyje. Keli naviko atsparumą daugeliui susijusių baltymų (SVV) [1] arba miRNAs [2], kad tarpininkauti MDR per įvairius mechanizmus anksčiau buvo identifikuoti. Tačiau mechanizmus, sukeliančius MDR GC išlieka toli nuo visiškai aiškus.

genomų sekos nurodė, kad eukariotinių genomai koduoti stebėtinai daug nekoduojamame nuorašai, palyginti su prokariotinių genomų. Tarp šių nekoduojamame nuorašai, daugelis ilgus kodavimo RNR (lncRNAs), kurios vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant iRNR transkripcija arba vertimą transkripcijos arba post-transkripcijos lygio. lncRNAs yra RNR, kad trūksta kodavimo potencialą, kurie yra > 200 bp ir sudaro ne mažiau kaip 80% nuo visos genomo [3] transkriptų. Kaupiamosios duomenys rodo, kad lncRNA vaidina svarbius vaidmenis mRNR reglamentą [4], Organelės Biogenesis [5] pavienių ląstelių tyri- mas prekyba molekulių [6], ir elementų kūrimas [7] [8].

LncRNA reguliacijos sutrikimas buvo įtrauktas į kelių tipų ligų, įskaitant vėžį ^{[ 4 9 10 ]. Būtent, lncRNAs gali vaidinti svarbų vaidmenį į Kancerogeninis ir metastazių ir invaziškumo daugelio piktybinių navikų per įtakos onkogeno išraiška. Pavyzdžiui, COX-2-lncRNA, PACER, gali veikti kaip naujų potencialių tikslo COX-2-moduliavimo uždegimas ir vėžio [11]; RNRi tarpininkaujant grandininį žemyn LINC01081 normaliomis vaisiaus plaučių fibroblastų parodė, kad ši lncRNA teigiamai reguliuoja FOXF1 stenogramą lygį, toliau nurodant, kad sumažėjo LINC01081 išraiškos gali prisidėti prie vystymosi alveolių kapiliarų displazija su nesutapimas plaučių venose [12]; lncRNA HOTAIR taip pat gali būti vertinga prognozuoti gaubtinės žarnos vėžio valdymo [13], ir MALAT1 gali būti laikoma potencialia prognostinį rodikliu, todėl gali būti taikiniu diagnostikos ir genų terapija kasos latakų adenokarcinoma [14]; Padidėjusi lncRNA H19 pagerina kancerogenezės ir metastazes skrandžio vėžio ir H19 poveikį GC yra sąlygotas tiesioginio ląstelę ISM1 ir netiesioginio slopinimo CALN1 išraiška per miR-675 [15]. Taigi, gauti išankstinį supratimą apie molekulinius mechanizmus MDR GC, mes studijavo lncRNA išraiška profilį GC MDR sublines.}

Čia mes studijavo diferencijuotai raiškos profilius lncRNAs ir mRNR tarp GC cellline SGC7901 ir MDR sublines SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR naudojant lncRNA mikrogardeliq analizę. Palyginimas skirtingai išreikštas nuorašai tarp sublines ir tėvų cellline atskleidė 15 kelius, kurios atitiktų žemyn reguliuojama nuorašai ir 20 kelius, kurios atitiktų iki reguliuojamų nuorašai (p reikšmė atjungimo buvo 0,05). Genų ontologija (GO) analizė parodė, kad labiausiai praturtino GO sąlygos up-reguliuojamas nuorašai buvo "sistemos kūrimas", "nukleosoma" ir "privalomas" ir labiausiai praturtino GO sąlygos žemyn reguliuojama nuorašai buvo "sterolio biosintezės procesas "," mobilųjį periferija "ir" steroidų dehidrogenazės aktyvumas ". Mūsų rezultatai parodė, kad lncRNA ir iRNR raiška profiliai reikšmingai skyrėsi tarp MDR sublines ir tėvų celline. Ši išvada rodo, kad neįprastų išraiškos lygiai lncRNAs gali prisidėti prie MDR GC plėtrai. Daugiau tyrimas iš lncRNA ekspresijos profilius skirtumai gali suteikti naujų potencialių metodus atbulinės eigos MDR fenotipas GC.

Rezultatai

skirtingai išreiškiama lncRNAs

highthroghput lncRNA mikrogardeliq duomenys parodė didelį iš viso 27,883 lncRNAs išreikštų skrandžio vėžio cellline, SGC7901 ir du daugiskaitos atsparumo sublines, SGC7901 /ADR reikalavimus ir SGC7901 /VCR (S1 lentelė). Daryti išvadą, jog tarp egzempliorių santykius, hierarchinė grupavimas analizė buvo naudojama pasirūpinti celllines į grupes pagal jų pasireiškimo lygius, pristatančią lncRNA raiškos režimais santykius celllines (Pav 1A ir 1B). Daugiau tyrimas šių duomenų eksponuojami nuo 1637 m vidutinis skirtingai išreiškiama lncRNA. Tarp jų 638 buvo nuosekliai iki reguliuojama ir 999 buvo nuosekliai žemyn reguliuojama (fold change≥2.0) (S2 lentelė). ASHG19A3A028863 (fold pasikeitima: 146.0139) buvo labiausiai up-reguliuojamas lncRNA ir ASHG19A3A007184 (fold pokytis: 58,7105) buvo labiausiai žemyn reguliuojama lncRNA. Be to, žemyn reguliuojamos lncRNAs buvo daugiau bendro, nei iki reguliuojama lncRNAs mūsų microarray duomenis (S2 lentelė).

skirtingai išreiškiama mRNR

buvo 19,644 mRNR nustatytos GC MDR sublines išnagrinėtų iRNR raiška profiliavimo duomenis naudojant mikrogardeliq analizę ir Hierarchinis grupavimo analizę pristatė tarp iRNR raiškos režimais, kurie buvo pateikti į GC MDR sublines ir jų tėvų celline (pav 2A ir 2B) (S3 lentelė) santykius. Tarp skirtingai išreikšta mRNR tarp SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR ir SGC7901, 730 buvo nuosekliai iki reguliuojama ir 650 buvo nuosekliai žemyn reguliuojama SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR celllines palyginti su SGC7901 (pav 2b). (S4 lentelė). NM_000735 (genų simbolis: CGA, susilanksto pokytis: 106,19) buvo labiausiai up-reguliuojamas iRNR ir NM_001136574 (genų simbolis: LANCL1, sulenkite pasikeitima: 25.43) buvo labiausiai žemyn reguliuojama iRNR (pav 2b)
eiti analizė

Norėdami nustatyti geną ir genų produktų atributų biologinių procesų, korinio komponentų ir molekulinės funkcijų, genų Ontologija (GO) analizė buvo atliekama iš dalies. Fišerio tikslusis testas daroma siekiant patikrinti, jei yra daugiau sutapimas DE sąrašo ir GO komentarų sąrašą nei būtų galima tikėtis atsitiktinai. P-reikšmė žymi GO terminų praturtėjimo reikšmę DE genuose. Kuo mažesnė P-reikšmė, tuo didesnis GO Terminas (p-reikšmė "< = 0,05 yra rekomenduojama). Jis parodė, kad aukščiausia praturtintas kilmės garantijos tiksliniai iki reguliuojama nuorašai buvo audinių homeostazę (GO: 0048731; ontologijos: biologinį procesą; p = 6.84E-08) (pav 3A), nukleosoma (GO: 0000786; ontologijos: ląstelių komponentas; p = 2.10E-07) (pav 3B) ir privalomas (GO: 0.005.488; ontologija: molekulinė funkcija; p = 0,001) (pav 3C) ir kad didžiausias praturtintas kilmės garantijos taikiniu žemyn reguliuojama nuorašai buvo sterolio biosintezės procesas (GO: 0016126; ontologija: biologinis procesas; p = 0,000) (pav 3D), ląstelių pakraštys (GO: 0071944; ontologijos: ląstelių komponentas; p = 3.80E-06) (pav 3E) steroidų dehidrogenazės aktyvumas (GO: 0016229; ontologijos: molekulinė funkcija; p = 0,001) (pav 3F) (S5 lentelė)

kelias analizė

šiame tyrime kelias analizė eksponuojami kad 20 būdai nuosekliai atitiko iki reguliuojama nuorašai ir kad labiausiai. praturtinti tinklas buvo "Alkoholizmas-homo sapiens (žmogus)" (Fišerio p-vertė = 3.66E-08), kurią sudaro 24 tikslinių genų (pav 4a); Be to, kelias analizė taip pat parodė, kad 15 būdai nuosekliai atitiko žemyn reguliuojama nuorašai ir kad labiausiai praturtintas tinklas buvo "Steroidų biosintezės-homo sapiens (žmogaus)" (Fišerio p reikšmė = 0,00044), kurią sudaro 5 tikslinių genų (pav 4B ) (P6 lentelė, The rekomenduojame p reikšmė atjungimo yra 0,05). Tarp šių būdų, genas kategorija "Paros ritmas" sutrikdymas buvo pranešta būti susijęs su įvairių vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [16], lėtinė mieloleukemija [17], galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinoma [18], kepenų ląstelių karcinoma [19 ], endometriumo karcinomos [20], ir krūties vėžys [21]. Genas kategorija "NOD-kaip receptorių signalizacijos kelias", kuris susideda iš NOD1, buvo nustatyta, kad NOD1 /CARD4 ir NOD2 /CARD15 genų polimorfizmas gali būti susijęs su pakitusiu rizika skrandžio [22], gaubtinės [23], plaučių [24 ], gerklų [25], tulžies pūslės [26], kasos [27], plonosios žarnos, inkstų [28], šlapimo pūslės vėžio [29], odos vėžys, limfoma [30] ir leukemija [31]. Čia mes toliau nagrinėjo išraišką ir funkcijos Arnt (arilo angliavandenilių receptorių atominės translocator) tarpininkaujant MDR1 (atsparumo daugeliui vaistų 1) iki didelio reguliavimo keliu. Buvo nustatyta, kad Arnt ir MDR1 buvo gerokai iki-reguliuojami SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR ląstelių linijų, palyginti su SGC7901, žymios iki reguliavimui MDR1 tarpininkaujant Arnt išraiška vektoriaus transfekciją poveikis buvo pažeista per SP1 siRNAs transfekciją. NL kolonija formavimas tyrimas parodė, kad SGC7901 /ADR ląstelių kolonijų susidarymo normos buvo remarably didesnis pARNT + /siSp1- grupė palyginti su pARNT + /siSp1 + grupės su adriamiciną (ADR) papildymo į kultūros Meida (p < 0,0001) (5 pav).

Realaus laiko kiekybine PGR patvirtinimas

Jei išnagrinėti mikrogardeliq duomenis, šeši iki reglamentuotas lncRNAs ir dešimt nepakankamai reguliuojamas lncRNAs buvo atsitiktinai atrinkti iš nuosekliai skirtingai išreikštas lncRNAs naudojant SGC7901 /ADR SGC7901 /VCR ir SGC7901 cellines ir KRL-PGR rezultatai ir mikrogardeliq duomenys yra nuoseklūs (pav 6A); toliau studijuoti raiškos lygius į šių lncRNAs narkotikų atsparus skrandžio audinių, dvidešimt vaistams atsparių skrandžio mėginius ir suporuotas ne vaistams atsparių audinių buvo išnagrinėti sintagmos lygio šių lncRNAs naudojant kiekybinį realaus laiko PGR (KRL-PGR) (pav 6B) .Sriegines rezultatai parodė, kad skrandžio gydomi ADR 5 dienas eksponuojami reikšmingo skirtumo saviraiškos lygius šių šešiolikos lncRNAs vėžio mėginiai afformentioned lyginant su kontrolinės grupės (pav 6c). Be to, koreliacinė analizė parodė, kad lncRNA NR_015379 ekspresijos lygis neigiamai koreliuoja su inhibavimo normos šių dvidešimt vaistams atsparių skrandžio mėginius (Pav 6D ir 6E, p < 0,01).

Diskusijos

Mūsų ankstesni tyrimai jau parodė, kad Pasaulis-21 gali skatinti atsparumą įvairių vėžio narkotikų [32]; LncRNA-MRUL skatina ABCB1 išraišką daugeliui vaistų atsparios skrandžio vėžio ląstelių sublines [33]; CUTL1 veikla yra atvirkščiai susijęs su atsparumo vaistams, todėl yra patraukli terapinis taikinys moduliuoti atsparumą daugeliui vaistų skrandžio vėžio [34]; skrandžio CSCS buvo nustatyti iš VCR-kondicionuojamas SGC7901 ląstelių linijos, pasižymi dideliu tumorogeniš- ir savęs atnaujinimo ir diferenciacijos [35] pajėgumus; MAD2 gali vaidinti svarbų vaidmenį žmogaus skrandžio vėžio vystymąsi, ir kad triukšmo slopinimo į MAD2 geną gali padėti kovoti su atsparumu skrandžio vėžio ląstelių [36] hipoksija-sukėlė MGr1-AG /37LRP išraiškos aktyvuoja HIF-1 priklauso vaistams apie ERK aktyvinimą. Šie įvykiai yra priklausomi nuo reaktyvių deguonies tarpinių produktų [37] .Tačiau atsparumas daugeliui vaistų mechanizmai GC yra kur kas labiau nušviečiama ir lncRNAs reguliacijos sutrikimas GC MDR sublines netirta dar.

Šiame tyrime GC ląstelių linija , SGC7901 ir du MDR sublines, SGC7901 /VCR ir SGC7901 /AGS buvo atliktas lncRNA mikrogardeliq analizė. buvo atlikta Bioinformatika ir tikrinimo eksperimentai ištirti galimą lncRNAs, dalyvaujantiems MDR plėtrai. Kelias analizė parodė, kad 15 keliai atitiko žemyn reguliuojama nuorašai ir 20 keliai atitiko iki reguliuojama nuorašai (p-reikšmė nutrūkimas 0,05). GO analizė parodė, kad aukščiausia praturtintas kilmės garantijos tiksliniai iki reguliuojama nuorašai buvo "sistemos kūrimas" ir aukščiausios esenriched kilmės garantijos taikiniu žemyn reguliuojama nuorašai buvo "sterolio biosintezės procesas".

daugėja įrodymų matyti, kad lncRNA ( seniai ne kodavimo RNR) galėtų atlikti svarbų vaidmenį kancerogenezėje ir naviko invazija ir metastazių [38]. Pavyzdžiui, Jonas [39] ir tt rodo, kad lncRNA PCGEM1
yra susijęs su prostatos vėžiu; transformuojant augimo faktoriaus β sukeltos lncRNA-Smad7 buvo nustatyta, kad slopina apoptozę pelės krūties vėžio JygMC (A) ląstelių ir tokiu būdu siūlome ED sudėtingą mechanizmą reguliavimo kovos su aprotoninis ir naviko-progresyvias aspektus TGF-beta signalizacijos [40]; lncRNA, prostatos vėžys susijęs stenograma 29 (PCAT29), buvo būdingas kartu su savo santykį su androgenų receptorių, veikė kaip androgenų reguliuojama naviko slopintuvas prostatos vėžio [41]; Juanių tt atrado romaną TGF-β-sukeltas lncRNA, lncRNA-ATB, kuris stimuliuoja EMT per suriša MIR-200S ir palengvino kolonizacijos stabilizuojant IL-11
iRNR, tokiu būdu skatinant tiek ankstyvos ir vėlyvos veiksmus vėžio metastazių [42].

buvo nustatyta, kad lncRNAs vaidina pagrindinį vaidmenį keičiant baltymų kodavimo genų per cis- arba trans-mechanizmų išraiška. Čia mes nustatėme, kad lncRNAs iki-reguliuojami SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR palyginti su SGC7901lncRNA pvz AF119893, kuris buvo intronic antiprasmiq į NRP2 (Neuropilin-2). Buvo pasiūlyta, kad NRP2 /VEGF-C ašis vaidina svarbų vaidmenį pūslės vėžio atsparumo terapijos ir VEGF-paxillin-NRP2 keliu galėtų atstovauti naują terapinį tikslą vėžio ir kitų angiogenezės susijusių ligų. lncRNA AF461897 buvo intronui jausmas-persidengimas ABCB9. Dong tt įrodė, kad Pasaulis-31 deda anti-Apoptozė poveikį greičiausiai per ABCB9 slopinimo ir taip sukurti naujovišką strategiją, įtraukiant į PPN-31 naudoti kaip potencialų taikinį NSLPV chemoterapija. lncRNA BC065904 buvo intronui jausmas-persidengimas CTBP2, vienas iš transkripcijos corepressors C-galinių surišančio baltymo (CtBP) šeimos, kuri veikė kaip E2F7 corepressor ir kaip DNR pažeidimai atsakas reguliatorius. lncRNA NR_026900 buvo Exon jausmas-persidengimas QSOX1, kuris buvo įrodyta, kad sumažinti dauginimosi, migracijos ir invazija krūties vėžio ląstelių in vitro ir sumažina naviko augimą in vivo.

Kita vertus, lncRNAs žemyn reguliuojama SGC7901 /ADR reikalavimus ir SGC7901 /VCR palyginti su SGC7901lncRNA pvz AF113689 buvo natūralus antiprasmiq į RRM1. Khatri tt, pranešė, kad iš anksto poveikis RRM1 siRNA sumažėjo IC50 vertės gemcitabino hidrochlorido 5 raukšlės A-549 ląstelių, palyginti su vien gemcitabino hidrochlorido, nurodant, kad RRM1 buvo potencialus onkogeno nuo plaučių vėžio. lncRNA uc010iyh buvo intronic Priešprasminis iš NAIP (neuronų Apoptozę slopinamąjį baltymo), kuris yra vienas iš TPA-šeima. Įrodyta, kad IAPS galėtų dalyvauti prostatos sutrikimas (GPH, PIN ir PC) plėtrą nuo gali būti išprovokuoti slopina apoptozę, o vėliau ląstelių proliferaciją. LncRNA uc003jsd buvo Exon jausmas-persidengimas PDE4D, t.y., cAMP specifinę 3 ', 5'-ciklinis fosfodiesterazės 4D. Lin tt parodė, kad PDE4D funkcijas, kaip naviko-faktoriaus, skatinti ir yra unikalus prieinamas orientacijos fermentą vėžio ląsteles. LncRNA NR_002332 buvo Exon jausmas-persidengimas ST7, slopintuvas ir tumorogeniš- 7, kuri buvo siūloma tapti vėžinių slopintuvas geno chromosomos regionas 7q31.1-q31.2.

Kelias analizė atskleidė galimą kelius dalyvauja atsparumo vaistams (MDR) skrandžio vėžio vystymąsi. Arnt buvo vienas iš 20 būdų nuosekliai atitiko iki reguliuojama nuorašai ir buvo pranešta, turi būti įtrauktas į atsparumo daugeliui vaistų raidos keliais piktybinių navikų [43], įskaitant daugine mieloma [44], ir ŪML (ūmi mieloleukemija) [45] , MDR1 koduoja P-glikoproteino, kuris yra energijos priklauso nuo išsiurbimo siurblį, kad galėtų eksportuoti plokščių hidrofobinių molekulių įskaitant kai chemoterapiniais narkotikų, tokių kaip adriamicino, cisplatinos, taksolio ir pan iš ląstelės [46, 47]. Čia, mes nustatėme, kad Arnt ir MDR1 buvo gerokai iki-reguliuojami SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR ląstelių linijų compacared į SGC7901, kad gerokai iki reguliavimui MDR1 tarpininkaujant Arnt išraiška vektoriaus transfekciją poveikis buvo pažeista per SP1 siRNAs transfekciją, kuris nurodyta, kad Arnt-MDR1pathway vaidmenį MDR fenotipo skrandžio vėžio.

Daugiau tyrimas parodė, kad kai kurie baltymai kodavimo genai, dalyvaujantys narkotikų atsparumo fenotipo ir plėtojimo piktybinių navikų gal buvo cis-reguliuojami koreliuotiems lncRNAs , Pavyzdžiui, ABCB1 (ATP privalomas kasetė, pošeimis B (MDR /TAP), narys 1, P-glikoproteino (P-gp) kodavimo genas), įsikūrusi 400KB aukštyn nuo lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-susiję ir aukštyn reglamentuoja lncRNA), buvo gerokai iki reguliuojama per didinimo potencialą panašaus vaidmens MRUL ir skatinamas narkotikas atsparumo fenotipas SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR ląstelių [33]; ADAM22, kandidatas genas piktybinę transformaciją kiaušidžių endometriozė [48], buvo susietas su lncRNA AL133090 į Exon prasme-sutapimo būdu; PLCG1 koreliavo su lncRNA AK021471 į introno prasme-sutapimo būdu ir pasikartojantys mutacijos PLCG1 buvo nustatytas angiosarcomas [49]; FYN koreliavo su lncRNA AK AK090692 A intronui jausmas-sutapimo būdas ir antagomir-1290 slopina CD133 (+) ląstelių nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžio nukreipiant Fyn susijusių Scr šeimos tirozino kinazės [50], ir tt

Šis tyrimas parodė, kad dereguliavimas lncRNAs dalyvavo su daugiskaitos atsparumo phynotype skrandžio vėžio vystymąsi. Tolesnė šių lncRNAs ir susijusių kelius gali suteikti įžvalgų į chemoterapijos atsparumo skrandžio vėžio narkotikų mechanizmų ir pateikti naujus kryptis priešinga naviko atsparumą daugeliui phynotype.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimo

Visi eksperimentinių procedūrų buvo patvirtinti pagal institucinius ekspertizės valdyba ketvirtosios karo medicinos universitete. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas visų pacientų mėginių.

Mobilaus ryšio linijų ir ląstelių kultūros

žmogaus GC ląstelių linija SGC7901 buvo gauta iš Karo medicinos mokslų akademijos (Pekinas, Kinija). Du vaistams atsparios sublines, SGC7901 /VCR ir SGC7901 /ADR, buvo sukurta mūsų laboratorijoje [51]. SGC7901 /VCR SGC7901 /ADR reikalavimus ir SGC7901 buvo auginami RPMI1640 terpės (Thermo Scientific Co, JAV), kuris buvo papildytas 10% serumas iš veršiuko embriono (FCS) (Thermo Scientific Co, JAV) drėgnoje inkubatoriuje su 5% CO2 37 ° C temperatūroje. Vaizdo grotuvas (1,0 mikrogramų /ml) arba ADR (0,5 mikrogramų /ml) buvo pridėta į mitybinės terpės atitinkamų ląstelių išlaikyti vaistams atsparių fenotipą.

RNR išskyrimas, ženklinimo ir matrica hibridizacija

viso RNR buvo nuimta nuo SGC7901, SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR naudojant TRIzol reagento (INVITROGEN, CA, JAV) ir RNeasy komplektas (Qiagen Co, Vokietija) pagal gamintojo nurodymus, įskaitant dezoksiribonukleazė virškinimo žingsnio. Iš viso RNR iš kiekvienos cellline buvo įvertintas naudojant NanoDrop ND-1000 (OT 260 nm NanoDrop Wilmington, DE), RNR vientisumas buvo įvertintas naudojant standartinės denatūravimo agarozės gelio elektroforezės ir grynumas buvo vertinami pagal absorbcijos koeficiento 260 nm 280 nm (A260 /A280). Dvigrandės kDNR (DS-kDNR) buvo susintetintas naudojant 5 mikrogramų bendrą RNR kurį Invitrogen Superscript DS-kDNR sintezės komplektą į 100 pmol oligo DT pradmens. Tada, DS-kDNR buvo paženklintas ir atliekama hibridizacija kaip buvo aprašyta anksčiau [52]. RNR ženklinimo ir Mikrogardelė hibridizacija atliko KangChen Bio-Tech, Šanchajus, Kinija.

Highthroughput lncRNA išraiška aprašymą analizė

Kvalifikuoti RNR buvo naudojama sintetinti dukart per dideles kDNR naudojant Viršutinis dvigubo dideles kDNR sintezė Kit (Invitrogen Co, JAV). Dukart per dideles kDNR buvo paženklintas ir kryžminosi žmogaus LncRNA mikrogardeliq V2.0 (Arraystar Co JAV). Mikrogardelė V2.0 yra apie 33.000 lncRNAs surinktų iš autoritetingų duomenų šaltiniais, įskaitant NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs iš literatūros ir UCRs. Sekos buvo pasirinktas su patentuotais strategijas. Pakartokite sekas ir ncRNAs trumpesnis nei 200 BP buvo ištrintas. Norėdami padidinti statistinio patikimumo, kiekvienas žmogus lncRNA masyvas sudarytas iš 60,302 skirtingų zondai (60 MERS) ir kiekvienas stenograma atstovavo 1-5 daviklių. Kiekvienas stenograma atstovavo tam tikrą Exon arba sandūros sandūros zondo tiksliai nustatyti atskirus protokolus. Mikrogardeliq hibridization ir bioinformatikos analizė buvo atliekama KangChen Bio-Tech, Šanchajus, Kinija. Pirminiai intensyvumo duomenys ir normalizuotos duomenys buvo parodyta genų ekspresijos Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Kiekybiniai realaus laiko PGR (KRL-PGR)

iš viso RNR SGC7901, SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR buvo izoliuotas naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, CA, JAV) ir po to buvo realizuojamas transkripcija naudojant PrimeScript RT reagentų rinkinys su gDNA Eraser (Puikiai realiu laiku) (TAKARA, Dalian Kinija) pagal gamintojo structions. Aštuonių iki reguliuojamų lncRNAs ir šešių žemyn reguliuojamų lncRNAs išraiška buvo matuojamas KRL-PGR naudojant SYBRGreen tyrimai (TAKARA, Dalian, Kinija) ir GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Pradmenys yra išvardyti 1 lentelėje Sąvoka lygis kiekvienoje lncRNA buvo atstovavo kartų kaita naudojant 2- △△ Ct metodus. Sąvoka lygis lncRNAs skirtingai išreikšta tarp SGC7901 ir MDR sublines SGC7901 /ADR ir SGC7901 /VCR buvo analizuojami naudojant Stjudento t-testą su SPSS (versija 17.0 SPSS LNC). A p <vertės; 0,05 buvo laikomas reikšmingu.

Histoculture Narkotikų reagavimo Analizės (HDRA) Šviežia GC naviko audinio buvo paruošta iš kiekvienos chirurginiu rezekcijos pavyzdį ir įdedamas į 24 šulinėlių plokštelės. Kubai kolageno gelio kempine (1 cm ^{3) buvo panardintas į 1 ml RPMI 1640 papildant 20% vaisiaus galvijų kraujo serume. Navikų audiniuose, buvo dedamas ant kolageno kempinės po ADR buvo pridėta, kurio galutinė koncentracija 6 mikrogramai /ml ir jie buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje su 5% CO2. Navikų audiniuose, gydomiems fiziologinio tirpalo (N.S) be ADR buvo naudojami kaip kontrolės. Vertinimo ir skaičiavimo metodai yra tokie, kaip aprašyta anksčiau [53]. Slopinimo koeficientas (IR) bet kokių naviko augimo = (1-vidutinis optinis tankis gydytų šulinių viename grame naviko /vidutinio optinis tankis kontrolinių duobučių viename grame naviko) × 100. Šiame tyrime, IR ribinė vertė lygi arba didesnė nei 30% (IR30) buvo apibrėžtas kaip chemosensitivity pagal preliminarios studijos rezultatas [54]. Tiesiog, kaip nurodyta, kad klinikoje patologinis informaciją apie vėžinių audinių šaltinio naudojama HDRA turėtų būti skiriamas atitinkamai buvo pateiktos 2 lentelėje}

Mobilaus ryšio linijas ir auginimo sąlygos

žmogaus GC ląstelių linijos SGC7901 buvo gauti iš karinės medicinos mokslų akademijos (Pekinas, Kinija). Vaistams atsparios sublines SGC7901 /VCR ir SGC7901 /AGS buvo sukurta mūsų laboratorijoje. SGC7901 /VCR SGC7901 /ADR ir SGC7901 buvo auginamos RPMI 1640 vidutinio (Thermo Scientific, JAV) papildytas 10% serumas iš veršiuko embriono (FCS) (ThermoScientific) į 5% CO2 drėkinama inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje. Vinkristino (VCR; Sigma, Inc, St. Louis, MO; 1,0 mikrogramų /ml) ir ADR (Sigma, Inc, St. Louis, MO; 0,5 mikrogramai /ml) buvo pridėta į kultūros terpėje tinkamą ląstelių sublines į išlaikyti vaistams atsparios fenotipą

Statybos pcDNA3.1 (+) -. Arnt plazmidės

Jei per aiškaus Arnt, pcDNA3.1 (+) - Arnt plazmidės buvo pastatytas. Žmogaus Arnt kDNR ekspresijos vektorius (pcDNA3.1 (+) - Arnt) buvo apskaičiuota CW Biotech Co. Ltd, Pekinas, Kinija. Trumpai, plazmidė pcDNA3.1 (+) - Arnt buvo gaunama remiantis kDNR seka iš GenBank. Arnt genas buvo sukurtas PGR. Plazmidė pcDNA3.1 (+) buvo ekstrahuojamas per Maxi paruošimas Rinkinys (Omega, Georgia, JAV). PGR produktas buvo subklonuotas į BamHI (TAKARA, Mountain View, JAV) ir Hindlll (Takara) vietų pcDNA3.1 plazmidės T4 ligaze (TAKARA, Mountain View, JAV). PcDNA3.1 (+) -. Arnt konstruktas buvo patikrintas DNR sekos (Invitrogen, Grand Island, JAV) (duomenys nerodomas)

generavimas Arnt stabili ląstelių linijų

SGC7901 /ADR ląstelių buvo auginamos 12-duobučių lėkštelėse su 1,0 × 10 ^{5 ląstelių kiekvieną šulinėlį, inkubatoriuje su nuolatinį tiekimą 5% CO2, esant 37 ° C temperatūroje. Vidutinės buvo pakeistas 24 val vėliau su skirtingų koncentracijų G418 antibiotikams G418 (600 mikrogramų /ml) ir keičiami kas 3 dienas 14 dienų po ląstelių kultūroje. Tėvų ląstelės buvo pernešta su pcDNA3.1 (+) - Arnt plazmidės naudojant Lipofectamine 2000 pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelių tankis buvo 2 × 10 5 ląstelės per gerai šešių duobučių lėkštelėse. Monokloninis ląstelių kolonija su atsparumu G418 buvo generuojami naudojant ribiniam skiedimo metodą kultivuojant vieną ląstelę 100 pL terpės 96-duobučių lėkštelėse 24 h. Monokloniniai ląstelių kolonijos buvo suardomas 15 dienų tolesniam amplifikacijos kultūra ląstelių, sergantiems stabilia Arnt raiškos 24-duobučių lėkštelėse. Ląstelės buvo perkelta į ląstelių kultūros kolbą, kol buvo maždaug 90% susiliejantis. Į Arnt per išreikštą ląstelių linijos Transfekuoti iki pcDNA3.1 (+) - Arnt buvo vadinamas SGC7901 /ADR Arnt}

Mažas trukdžių RNR (siRNR) transfekcija

Jei triuškinantis Arnt iRNR raiška. , buvo atliktas siRNR transfekcija. Dėl transfekcija, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) ir 50 nm siRNR (Genų Pharma Co, Šanchajus, Kinija) buvo naudojami pagal gamintojo rekomendacijas, kaip aprašyta anksčiau [55]. SiRNR sekas, yra: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'

imunoblotingu

Iš viso ląstelių baltymų buvo lizuojamos naudojant lizės buferiniame tirpale, papildyta su fenilmetilsulfonilfluoridą (1 mM. ) ant ledo. Tada, baltymų elektroforeze per 12% SDS poliakrilamido gelyje ir perkelti į PVDF membrana (Millipore ", Massachusetts, JAV). 5% neriebalinės pieno milteliai buvo naudojamas siekiant užkirsti kelią membranas kambario temperatūroje 1 valandą, o, o pirminiai antikūnai buvo inkubuojami per naktį. Kitą, Membranos buvo inkubuojami su antrinių antikūnų, ant kurių HRP 1 val kambario temperatūroje po tris 10-min plauna į trietanolamino buferinis fiziologinio tirpalo su Tween (TBS-T). Pagaliau, signalai buvo aptinkami naudojant ECL rinkinį (Pierce Biotech., Rokfordas, IL, JAV) ir membranos buvo nuskaitomi ir analizuojami naudojant a ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, JAV) vaizdo sistema su vaizdavimo programinės įrangos (versija 1.0) , Tubulino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Spectra daugiaspalvis plataus diapazono baltymų kopėčios (Beyotime, Jiangsu, Kinija) buvo naudojamas kaip molekulinės persekiotoją. Naudojami į Imunoblotingo tyrimo antikūnai gali būti vertinama atsižvelgiant į 3 lentelėje

NL kolonija formavimas tyrimas

Prisijungti fazių ląstelės buvo nuimta, padengtą į šešias-duobučių lėkštelėse (1 × 10 ^{4 ląstelės /duobutėje), ir chemoterapinių vaistų buvo pridėta į mitybinės terpės antrą dieną. Gauti kolonijos buvo tamsintas su Coomassie briliantinis mėlynasis (Sigma, Inc., St Louis, MO, JAV) ir matomas kolonijos buvo skaičiuojami po 2 savaičių.}

Duomenų analizė

tai tyrimas, informacinė duomenų analizė buvo atliekama KangChen Biotech (Šanchajus, Kinija) .Visi skaidres buvo nuskaitomi 5 lm /pikselių rezoliucija naudojate Aksonas GenePix 4000B skaitytuvas (molekulinė prietaisai Corporation) runed iki GenePix Pro 6.0 programinės įrangos (AXON). Nuskaitytus vaizdus (JPEG formato), tada buvo atlikta tinklelis lygiavimo ir išraiška duomenų analizę naudojant NimbleScan programinę įrangą (versija 2.5). Expression duomenys buvo normalizuotas per Tvirtas Daugialustis Vidutinis (RMA) algoritmą įtrauktų į NimbleScan programinės įrangos. Be to, zondas lygio failus ir iRNR lygio failai buvo sukurtas po normalizavimo. Visi genų lygio failai buvo importuoti į "Agilent GeneSpring GX programinės įrangos (versija 11.5.1) ir normalizavosi Kvantas metodą; tada, kovoti su programinės įrangos buvo naudojamas reguliuoti normalizuotą intensyvumą pašalinti partijos poveikį. Žymiai skirtingai išreikšti lncRNAs ir mRNR buvo nustatyti per ugnikalnio Sklypo filtravimas. Hierarchinis grupavimas buvo atliekama naudojant "Agilent GeneSpring GX programinę įrangą (versija 11.5.1) [56]. Duomenys buvo išreikštas reiškia ± standartinis nuokrypis (SD). Linijinis koreliacinė analizė buvo atliekama naudojant Pearson metodą SPSS, versija 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Skirtumai buvo laikomi reikšmingas P vertės < 0,05.

Pagalbinė informacija
S1 lentelę. Į lncRNA ekspresijos duomenys
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s001
(XLS)
S2 stalo. Nuosekliai iki reguliuojama ir žemyn reguliuojama lncRNAs tarp SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR ir SGC7901
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s002
(xls)
S3 lentelė. MRNR ekspresijos duomenis
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s003
(xls)
S4 "lentelė. Nuosekliai iki reguliuojama ir žemyn reguliuojama mRNR tarp SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR ir SGC7901
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s004
(xls)
S5 lentelė. Genų Ontologija (GO) analizė
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s005
(XLSX)
S6 lentelė.

• PLoS ONE: Serumas HER2 yra potencialus pakaitalas audinių HER2 būklės skrandžio vėžiu: sisteminė apžvalga ir meta-Analysis
• PLoS ONE: HIF-1α Skatina naviko atsparumą daugeliui skrandžio vėžio ląsteles, sukeldami MIR-27a