PLoS ONE: više lijekova-Resistance Srodno Long nekodirajuće analiza RNA Izražavanje Profil želučane Cancer

Sažetak pregled

učinka kemoterapije želučanog karcinoma (GC) i dalje je vrlo slabo, zbog rezistencije na lijekove (MDR). Međutim, mehanizmi u podlozi MDR GC i dalje daleko od potpunosti razumio. Cilj ovog rada je ukazati na potencijalne mehanizme MDR GC na uglavnom na razini dugo nekodirajuće RNA (lncRNA). U ovom istraživanju, GC stanične linije, SGC7901 i dvije MDR podlinije, SGC7901 /VCR i SGC7901 /ADR podvrgnuti su analizi lncRNA microarray. Bioinformatike i eksperimenti potvrde su izvedeni istražiti potencijalne lncRNAs su uključeni u razvoj MDR. Put analiza je pokazala da 15 putevi odgovara podregulirani transkripata i to 20 putevi odgovara gore-regulirajuće transkripte (p-vrijednost cut off: 0,05). GO analiza pokazala je da su najviši obogaćeni GOS na meti up-regulirajuće transkripte bili "Razvoj sustava", a najviše su esenriched GOS na meti regulirano transkripata bili "sterol biosynthetic proces". Naša studija je prva koja je ispitati različito izražene lncRNAs u ljudskom GC stanične linije i MDR sublini i ukazuje na to da lncRNAs se isplati za daljnje studije kako bi se novi biomarkeri kandidati za kliničku dijagnozu MDR a potencijalne mete za daljnju terapiju. Pregled

Izvor: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu p, et al. (2015) na lijekove-Resistance Srodno Long NEKODIRAJUĆA RNK analizu ekspresije profil rak želuca. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10,1371 /journal.pone.0135461 pregled

Urednik: Jin P Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, SAD pregled

Primljeno: 24. prosinca 2014.; Prihvaćeno: 22. srpnja 2015; Objavljeno: 20. kolovoz 2015 pregled

Copyright: © 2015 Wang et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: Sve sirovo podataka i normalizirane su podaci prikazani u http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342) pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane nacionalnih Program o Key Basic Research Project ( "973" program, br 2010CB529302, br 2010CB529305, br 2010CB529306); Nacionalna zaklada Prirodne znanosti Kine (br 81301763); Henan pokrajinske ključ znanstvenih i tehnoloških projekata (br 142102310473); Ključ programa, Nacionalna zaklada prirodne znanosti Kine (br 81030044) pregled

suprotstavljenih interesa:.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

višestruke rezistencije na lijekove ( MDR) i dalje je glavna prepreka za kemoterapije neuspjeha u liječenju raka želuca, koji je vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu. Više višestruke rezistencije na lijekove povezane proteina (MRPs) [1] ili miRNAs [2] koji posreduju MDR kroz različite mehanizme prethodno identificirane. Međutim, mehanizmi u podlozi MDR GC i dalje daleko od potpuno jasan. Pregled

genoma sekvenciranje naznačeno da eukariota genomi kodirati iznenađujuće velik broj nekodirajuće transkripata u usporedbi s prokariotskih genoma. Među tim nekodirajuće transkripata, mnogi su dugo nisu kodiranje RNA (lncRNAs) koji igraju važnu ulogu u regulaciji mRNA transkripciju ili prijevod na transkripcijskih ili post-transkripcijskih razinama. lncRNAs su RNA koje nemaju kodiranja potencijal, koji su > 200 bp i iznosi najmanje 80% od transkripte genom [3]. Prikupljeni podaci pokazuju da lncRNA igra važnu ulogu u regulaciji mRNA [4], organele biogeneza [5], subćelijski trgovina molekula [6] i razvoj stanica [7] [8]. Pregled

LncRNA deregulacija bio uključen u više vrsta bolesti, uključujući rak ^{[ 4 , 9 , 10 ]. Naime, lncRNAs može igrati važnu ulogu u procesu karcinogeneze, metastazama i invazivnosti višestrukih malignih tumora kroz utječe ekspresija onkogena. Na primjer, COX-2-lncRNA, konj, mogu djelovati kao novi potencijalni cilj za COX-2-modulaciju u upala i raka [11]; RNAi posredovanog knock-down LINC01081 u normalnim fetalnih pluća fibroblaste pokazala da je ova lncRNA pozitivno regulira FOXF1 razinu prijepis, što dalje ukazuje da je pad LINC01081 izražavanja može doprinijeti razvoju alveolarne kapilarnog displazija uz neusklađenost plućnih vena [12]; lncRNA HOTAIR mogu također biti vrijedan prediktor za upravljanje raka debelog crijeva [13] i MALAT1 može se smatrati kao potencijalni prognostički pokazatelj i može biti meta za dijagnozu i gensku terapiju za ljepljive adenokarcinoma gušterače [14]; pojačanom ekspresijom lncRNA H19 poboljšava karcinogeneze i metastaziranja raka želuca i utjecaj H19 u GC je posredovano izravnom upregulation ISM1 i neizravnog suzbijanje CALN1 ekspresije preko Mir-675 [15]. Dakle, da bi dobili preliminarne uvid u molekularne mehanizme MDR GC, proučavali smo lncRNA izraz profil GC MDR sublini. Pregled}

Evo, proučavali smo različito profile ekspresije lncRNAs i mRNA između GC cellline SGC7901 i MDR podlinije SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekordera pomoću lncRNA analizu microarray. Usporedba različito izraženih transkripata između sublini i roditeljske cellline pokazala 15 staze koje korespondira podregulirani transkripata i 20 staze koje korespondira up-regulirajuće transkripte (p cut-off vrijednosti bio 0.05). Gene ontologije (GO) Analiza je pokazala da je većina visoko obogaćeni pojmovi ići za up-regulirana transkripata bili "Razvoj sustava", "nukleosoma" i "obvezujući", a većina visoko obogaćeni pojmovi ići za regulirano transkripata bili "sterol biosynthetic proces "," stanica periferije "i" steroid dehidrogenaze aktivnost ". Naši rezultati su pokazali da su lncRNA i mRNA profili značajno razlikovala između MDR sublini i roditeljske celline. Ovaj nalaz sugerira da su nenormalne razine ekspresije lncRNAs može doprinijeti razvoju MDR GC. Daljnje proučavanje razlika u lncRNA ekspresije profilima može pružiti nove potencijalne metode za promjenu smjera MDR fenotip GC.

Rezultati

različito izražena lncRNAs pregled

microarray Podaci highthroghput lncRNA pokazala ukupno 27,883 lncRNAs izraženim u želučanom cellline raka, SGC7901 i dva višestruko otpornosti podlinije, SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekorder (S1 Tablica). Zaključiti odnose među uzorcima, hijerarhijska analiza grupiranje je korišten dogovoriti celllines u skupine prema njihovim razinama ekspresije, predstavljajući odnose na lncRNA izraz načina između celllines (slika 1A i 1B). Daljnje proučavanje tih podataka izložena u prosjeku od 1637 različito izražena lncRNA. Među njima, 638 su bile uvijek regulira prema gore i 999 su stalno dolje regulirano (fold change≥2.0) (S2 Tablica). ASHG19A3A028863 (fold promjena: 146.0139) je najviše up-regulirana lncRNA i ASHG19A3A007184 (fold izmjena: 58,7105) je bio najveći dolje regulira lncRNA. Nadalje, dolje regulirani lncRNAs bili češći nego regulira prema gore lncRNAs u našim microarray podataka (S2 stol). Pregled

različito izražena mRNA pregled

Bilo je 19,644 mRNA u ovim GC MDR sublini analiziranim mRNA profiliranje podataka pomoću microarray analize a hijerarhijska analiza clustering predstavio odnosa između načina ekspresije mRNA koji su bili prisutni u GC MDR sublini i njihove roditeljske celline (slika 2A i 2B) (S3 tablicu). Među različito izražena mRNA između SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR i SGC7901, 730 je dosljedno regulira prema gore i 650 je dosljedno dolje regulirano SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR celllines usporedbi s SGC7901 (slika 2b). (S4 Tablica). NM_000735 (simbol gen: CGA, fold izmjena: 106,19) je najviše up-regulirana mRNA i NM_001136574 (simbol gen: LANCL1, preklopite promjena: 25,43) je bio najveći dolje regulira mRNA (slika 2b) pregled

GO analiza pregled

Da bi se odredila gena i gena osobina proizvoda u biološkim procesima, staničnih komponenti i molekularne funkcije, Gene Ontologija (GO) analiza provedena je ovime. Fisherov egzaktni test je učinjeno kako bi se ispitalo da li ima više preklapanja između popisa DE i GO popisu bilješki nego što bi se očekivalo slučajno. P-vrijednost označava značaj GO pojmovima obogaćivanja u DE gena. Što je manji p-vrijednost, značajnije GO Term (p-vrijednost < = 0.05 preporuča). Pokazalo se da su najviši obogaćeni GOS na meti regulira prema gore transkripata su tkiva homeostaza (GO: 0048731, ontologiju: biološki proces; p = 6.84E-08) (slika 3A), nukleosoma (GO: 0000786, ontologiju: stanične komponente; p = 2.10E-07) (Slika 3B) i vezivanje (GO: 0005488; ontologije: molekularna funkcija; p = 0,001) (slika 3c) i da su najviši obogaćeni GOS na meti regulirano transkripata su sterola proces biosynthetic (GO: 0016126; ontologije: biološki proces; p = 0,000) (slika 3D), stanica periferija (GO: 0071944, ontologiju: stanične komponente; p = 3.80E-06) (Sl 3E) steroid aktivnost dehidrogenaze (GO: 0016229, ontologiju: molekularni funkcija; p = 0,001) (slika 3F) (S5 tablica) pregled

put analiza pregled

U ovoj studiji, put analiza izlagao je 20 putovi stalno odgovarao regulira prema gore transkripata i to najviše. obogaćeni mreža bila "alkoholizam-Homo sapiens (ljudski)" (Fisher-P vrijednost = 3.66E-08) koji se sastoji od 24 ciljanih gena (Slika 4A); Nadalje, analiza put također je pokazala da 15 putevi dosljedno korespondira podregulirani transkripata te da je većina obogaćeni Mreža bio "Steroidni biosinteze-Homo sapiens (humani)" (Fisher-P vrijednost = 0,00044) koji se sastoji od 5 ciljanih gena (Slika 4B ) (S6 Tablica je preporučio p-vrijednost cut-off je 0,05). Među tim putovima, kategorija gen "ritma" Poremećaj je izvijestila da je povezan s različitim oblicima raka, uključujući i rakom želuca [16], kronične mijeloične leukemije [17], glave i vrata karcinom pločastih stanica [18], hepatocelularnog karcinoma [19 ], karcinoma endometrija [20] i rak dojke, [21]. Kategorija gen "NOD-like receptor signalizacija put", koji se sastoji od NOD1, je pokazao da NOD1 /CARD4 i NOD2 /CARD15 polimorfije gena mogu biti povezane s promijenjenom rizikom želučane [22], kolorektalni [23], pluća [24 ], grkljana [25], žučnog mjehura [26], gušterače [27], tankog crijeva, bubrega [28], karcinom mokraćnih [29], rak kože, limfom [30] i leukemija [31]. Ovdje ćemo dodatno ispitati ekspresiju i funkciju arnt (aril ugljikovodika receptor nuklearni translocator) posredovana MDR1 (višestruka otpornost 1) up-regulaciji puta. Utvrđeno je da arnt i MDR1 su značajno viša u SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR stanične linije u odnosu na SGC7901, učinak značajnog doreguliranjem MDR1 posredovanog arnt vektor ekspresije transfekcije bila ugrožena preko Sp1 siRNA transfekcije. Test formiranje ploča kolonija pokazalo je da SGC7901 /ADR stanične kolonije stopa formacije su remarably više u pARNT + /siSp1- usporedbi sa skupinom pARNT + /siSp1 + grupu s adriamicinom (ADR) dodatka u kulture Meida (p 0,0001) (Slika 5). pregled

u realnom vremenu kvantitativni PCR valjanosti pregled

Da bi se ispitala podatke microarray, šest regulira prema gore lncRNAs i deset ispod propisane lncRNAs su nasumično izabrane iz dosljedno različito izraženim lncRNAs koriste SGC7901 /ADR, SGC7901 /videorekordera i SGC7901 cellines i QRT-PCR rezultati i microarray podaci konzistentni (Slika 6A); za daljnje proučavanje razinu ekspresije ovih lncRNAs u rezistentnih na želučani tkiva dvadeset otporne na lijekove želučanih uzorci i upareni nisu multirezistentnog Tkiva su pregledana na razinu ekspresije ovih lncRNAs pomoću kvantitativne realnom vremenu PCR (QRT-PCR) (Slika 6B) .The rezultati pokazuju da uzorci želučani rak liječeni ADR 5 dana pokazali značajnu razliku u razini ekspresije ovih šesnaest lncRNAs prethodno navedenih u usporedbi s kontrolnim grupama (slika 6c). Štoviše, korelacija je analiza pokazala da lncRNA NR_015379 razinama su negativno povezane sa stopama inhibicijom ovih dvadeset uzoraka želuca otporne na lijekove (Slika 6D i 6E, p 0.01). Pregled

Rasprava pregled

Naša prethodna istraživanja već utvrdio da mir-21 može promicati rezistenciju od raznih vrsta raka [32]; LncRNA-MRUL potiče ekspresiju ABCB1 u multirezistentnog želučane stanice raka sublini [33]; CUTL1 aktivnost obrnuto je povezana s rezistencijom na lijekove i tako je zanimljiv terapeutski cilj za modulaciju rezistenciju u želučanom raka [34]; želučani eksplozivnim dizanjem utega su identificirani od SGC7901 stanične linije VCR-uvjetovano, kojeg karakterizira visoka torn smjeru i sposobnosti za samostalno obnovi i diferencijacije [35]; MAD2 može igrati važnu ulogu u razvoju ljudskog karcinoma želuca i to utišavanje gena MAD2 može pomoći da se bave rezistencije na lijekove želučanih stanica raka [36] i hipoksijom izazvao MGr1-Ag /37LRP izražavanja aktivira HIF-1 ovisi na aktivaciju ERK. Ovi događaji su ovisni reaktivnih međuprodukata kisika [37] .Međutim, rezistencije na više lijekova mehanizmi GC su daleko više razjašnjen i lncRNAs deregulacija GC MDR sublini još nisu istražena. Pregled

U ovoj studiji, GC stanične linije , SGC7901 i dvije MDR podlinije, SGC7901 /VCR i SGC7901 /ADR su podvrgnuti analizi lncRNA mikropolja. Bioinformatike i eksperimenti potvrde su izvedeni istražiti potencijalne lncRNAs su uključeni u razvoj MDR. Put analiza je pokazala da 15 putevi odgovara podregulirani transkripata i to 20 putevi odgovara gore-regulirajuće transkripte (p-vrijednost cut off: 0,05). GO analiza pokazala je da su najviši obogaćeni GOS na meti regulira prema gore transkripata bili "Razvoj sustava", a najviše su esenriched GOS na meti regulirano transkripata bili "sterol proces biosynthetic". Pregled

Sve više dokaza pokazali su da lncRNA ( dugo nekodirajuće RNA) mogu igrati važne uloge u karcinogeneze i invaziju tumora i metastaza [38]. Na primjer, John [39] su pokazali da itd lncRNA PCGEM1 pregled je povezan s rakom prostate; transformirajući faktor rasta-β inducirane lncRNA-Smad7 ustanovljeno je da inhibira apoptozu raka miša dojke JygMC stanice (A), a time i sugeriraju ed složeni mehanizam za regulaciju anti-apoptotskih i tumor-progresivne aspekte TGF-P signalno [40]; lncRNA, rakom prostate transkript 29 (PCAT29), je naznačen time, zajedno sa svojim odnosu na androgeni receptor, djeluje kao androgenu regulira tumor supresor kod raka prostate [41]; Yuan itd otkrili novu TGF-β-induciranu lncRNA, lncRNA-ATB, koji stimulira EMT kroz koji odvajaju Mir-200S i olakšati naseljavanje stabiliziranjem IL-11
mRNA, čime se promiče i rano i kasno korake metastaza raka [42]. pregled

pronađeno je da lncRNAs imaju ključne uloge u mijenjanju ekspresiju gena za kodiranje proteina preko cis- ili trans-mehanizmima. Ovdje smo otkrili da je lncRNAs regulira se in SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR odnosu SGC7901lncRNA kao AF119893, koji je intronske protusmisleni na NRP2 (Neuropilin-2). Sugerirano je da je NRP2 /VEGF-C os igra ulogu u raka mokraćnog mjehura otpora terapiju i VEGF-paxillin-NRP2 put može predstavljati novi terapijski cilj za rak i druge bolesti povezanih s angiogenezom. lncRNA AF461897 je introna osjećaj-preklapanje ABCB9. Dong itd pokazao je da Mir-31 djeluje anti-apoptotski učinak najvjerojatnije putem inhibicije ABCB9 i na taj način osigurati novu strategiju koja uključuje upotrebu Mir-31 kao potencijalni cilj u NSCLC kemoterapije. lncRNA BC065904 je introna osjećaj-preklapanje CTBP2, jedan od transkripcijskih corepressors C-terminalnog vezujući protein (CtBP) obitelji, koji je funkcionirao kao kosupresori od E2F7 i kao regulator oštećenja DNA odgovora. lncRNA NR_026900 bilo eksona osjećaj-preklapanje QSOX1, koji je pokazao da se smanji proliferaciju, migraciju i invaziju stanica raka dojke in vitro i smanjuje rast tumora in vivo. pregled

S druge strane, lncRNAs regulirani prema dolje u SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekorder u usporedbi s SGC7901lncRNA kao što AF113689 je prirodno antisens- na RRM1. Khatri itd su izvijestili da prethodno izlaganje RRM1 siRNA smanjio vrijednost IC50 gemcitabin hidroklorida 5 nabora u A-549 stanica u odnosu na samo gemcitabin hidroklorid, što ukazuje da RRM1 je potencijalni onkogena od raka pluća. lncRNA uc010iyh bio intronske antisense NAIP (apoptoze neurona inhibitorni protein), koji je jedan od IAP-obitelji. Pokazano je da se IAPs mogli biti uključeni u bolesti prostate (BPH, PIN i PC) razvoju od može se izazvati inhibiciju apoptoze i naknadno proliferacije stanica. LncRNA uc003jsd bilo eksona osjećaj preklapaju PDE4D, tj, cAMP-specifični 3 ', 5'-ciklički fosfodiesteraze 4D. Lin itd pokazala da PDE4 funkcije kao faktor tumora potiču i predstavlja jedinstven na ciljano mjesto enzima stanica raka. LncRNA NR_002332 bilo eksona osjećaj-preklapanje ST7, supresor tumorogenosti 7, za koju je pretpostavljeno da je tumor supresor gena u kromosomu 7q31.1-q31.2 regije. Pregled

Put analiza pokazala potencijalne putove koji su uključeni u razvoj rezistencije na mnoge lijekove (MDR), raka želuca. Arnt je bio jedan od 20 puteva konstantno odgovarali regulira prema gore transkripata te je izvijestio da se uključe u razvoj rezistencije na lijekove za više malignih tumora [43], uključujući i multiplog mijeloma [44], i AML (akutne mijeloidne leukemije) [45] , MDR1 kodira P-glikoprotein koji je energetski ovisna pumpom istjecanja koja može izvesti ravne hidrofobne molekule uključujući neke kemoterapijske lijekove, kao što su adriamicin, cisplatin, taksol itd iz stanice [46, 47]. Evo, našli smo da arnt i MDR1 bili su znatno viša u SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR staničnim linijama compacared na SGC7901, učinak značajan regulaciji MDR1 posredovanog arnt vektor ekspresije transfekcije bio ugrožen putem Sp1 siRNA transfekciju, koji pokazuje ulogu Amt-MDR1pathway na MDR fenotipa želuca. pregled

Daljnja istraživanja su pokazala da su neki gena za kodiranje proteina koji su uključeni u djelatnom otpornosti fenotipa i razvoja malignih tumora, možda su cis-regulirani korelirani lncRNAs , Na primjer, ABCB1 (veže za ATP, pod-obitelj B (MDR /TAP), član 1, P-glikoprotein (P-gp) kodiranje gena), koji se nalazi 400KB uzvodno od lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-povezane i nad- regulirano lncRNA), bio je znatno regulira se kroz potencijalnog poboljšanja, kao što su uloge koju MRUL i promovirao otpornost na lijek fenotip SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR stanica [33]; ADAM22, gen za maligne transformacije endometrioze jajnika [48], je povezana sa lncRNA AL133090 na ekson osjetilima preklapajuće način; PLCG1 povezana sa lncRNA AK021471 u introna osjetilno-preklapaju način i povratna mutacija u PLCG1 je identificiran u angiosarkoma [49]; FYN povezana sa lncRNA AK AK090692 u intron smislu preklapanje način i antagomir-1290 potiskuje CD133 (+) stanica kod karcinoma ne-malih stanica pluća, ciljajući Fyn povezanih Src obitelj tirozin kinaze [50], itd

Ova studija pokazala je da deregulacija lncRNAs je uključen u razvoj višestruku otpornost phynotype od raka želuca. Daljnja analiza ovih lncRNAs i srodnih putevi mogu pružiti uvid u mehanizme kemoterapije otpornost na lijek od raka želuca i dati nove smjernice za obrnute lijekove phynotype otpora. Pregled

materijali i postupci

Etika izjava

Sve eksperimentalni postupci su odobreni od strane Institutional Review Board of Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte. Pismeni informirani pristanak dobiven je za sve uzorke pacijenata. Pregled

Stanične linije i stanična kultura pregled

Ljudski GC stanična linija SGC7901 dobiven je iz Akademije vojnih medicinskih znanosti (Peking, Kina). Dva multirezistentnog podlinije, SGC7901 /VCR i SGC7901 /ADR, razvijeni su u našem laboratoriju [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR i SGC7901 uzgajane su u RPMI1640 mediju (Thermo Scientific Co., USA) koji je bio nadopunjen s 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) u vlažnom inkubatoru s 5% CO2 na 37 ° C. VCR (1.0 ug /ml) ili ADR (0,5 ug /ml) se doda u medij kulture na odgovarajućim stanicama održavati fenotip je rezistentan na lijekove. Pregled

Izolacija RNA, označavanju i niz hibridizacija pregled

Ukupna RNA dobivenih iz SGC7901, SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekordera pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, CA, USA) i RNeasy Kit (Qiagen Co., Njemačka), u skladu s uputama proizvođača, uključujući korak Dnaza probave. Ukupna RNA iz svakog cellline se kvantificira korištenjem NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), Integritet RNA bio je procijenjen standardni denaturiranje elektroforezu u agaroznom gelu, a čistoća je procijenjen prema omjeru apsorbancije na 260 nm kako 280 nm (A260 /A280). Dvostrukog lanca cDNA (ds-cDNA) je sintetiziran upotrebom 5 ug ukupne RNA pomoću Invitrogen eksponent ds-cDNA Synthesis Kit, u prisustvu 100 pmol oligo dT primera. Zatim, DS cDNA je označena i izvodi hibridizaciju kao što je prethodno opisano [52]. Označavanje RNA i mikropostrojima hibridizacija provedena je KangChen Bio-Tech, Šangaj, NR Kina. Pregled

izraz profil Highthroughput lncRNA analiza pregled

kvalificirani RNA koristi za sintezu dvolančane cDNA pomoću Superscript dvaput lančani cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Dvolančane cDNA označen te hibridizira s ljudskom LncRNA mikropolja V2.0 (Arraystar Co. USA). mikropostrojima V2.0 sadrži oko 33.000 lncRNAs prikupljenih od autoritativni izvori podataka, uključujući NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs iz književnosti i UCRs. Nizovi su izabrani s vlasničkim strategije. Ponavljanje sekvence i ncRNAs kraći od 200 bp su izbrisani. Kako bi se poboljšala statističke pouzdanosti, svaki ljudski lncRNA polje je sastavljena od 60,302 različitih sondi (60 meri) i svaki transkript je zastupao 1-5 probe. Svaki transkript je predstavljao određenu eksona ili nadovezivanje čvora sonde za identifikaciju pojedinačnih transkripata točno. Mikropostrojima hibridization i bioinformatika analiza je provedena pomoću KangChen Bio-Tech, Šangaju, NR Kina. Podaci sirovo intenzitet i normalizirane su podaci prikazani u Gene Expression Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342). pregled

Kvantitativna real-time PCR (QRT-PCR) pregled

ukupna RNA SGC7901, SGC7901 /ADR i SGC7901 /videorekorder se izolira TRIzol reagensa (Invitrogen, CA, USA), a potom je reverzno transkribira uz pomoć PrimeScript RT seta s gDNA Eraser (Perfect real Time) (Takara, Dalian Kina) prema ča proizvođača. Ekspresija osam up-regulirana lncRNAs i šest dolje regulirana lncRNAs je mjerena QRT-PCR korištenjem SYBRGreen pokusi (Takara, Dalian, Kina) i GAPDH je korištena kao interna kontrola. Početnici su izlistani u Tablici 1. Razina ekspresije svake lncRNA je prikazan kao mnogostrukost promjene primjenom 2- △△ CT metode. Razina ekspresije lncRNAs Diferencijalno ekspresirana između SGC7901 i MDR podlinije SGC7901 /ADR i SGC7901 /VCR su analizirani pomoću Studentovog t-test s SPSS (verzija 17.0 SPSS LNC). Vrijednost od p < 0.05 je smatrana značajnom. Pregled

Histoculture Ispitivanje odgovora na lijek (HDRA) Svježa GC tkivo tumora prikupljeni iz svakog kirurški reseciranih uzorka i stavi u 24-jamica. Kocke kolagen gel spužve (1 cm ^{3) su uronjene u 1 mL RPMI 1640 nadopuni s 20% fetalnog goveđeg seruma. Tumorskih tkiva se stavi na kolagenske spužve sljedećem ADR doda se pri konačnoj koncentraciji od 6 ug /ml i inkubiraju na 37 ° C s 5% CO2. Tumorskih tkiva tretirane normalne fiziološke otopine (N.S) bez ADR su korišteni kao kontrola. Vrednovanja i kalkulacija postupci su kao što je ranije opisano [53]. Brzina inhibicije (IC) rasta tumora = (1 srednja apsorbancije tretiranih jažica po gramu tumora /srednja vrijednost apsorbancija kontrolnih jažica po gramu tumora) × 100. U ovom istraživanju, IR cut-off vrijednosti jednake ili veće od 30% (IR30) definirana je kao kemijske osjetljivosti prema preliminarnom istraživanju rezultata [54]. Baš onako kako je opisano, klinika patološke informacije o tumorskom tkivu je izvor koristi za HDRA treba dati znatno su prikazani u tablici 2.}

stanične linije i uvjeti uzgoja

ljudsko GC stanične linije SGC7901 je dobiven iz akademije vojnih medicinskih znanosti (Peking, Kina). Multirezistentnog podlinije SGC7901 /VCR i SGC7901 /ADR su razvijeni u našem laboratoriju. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR i SGC7901 uzgojene su u RPMI 1640 mediju (Thermo Scientific, USA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS) (ThermoScientific) u 5% CO2 vlažnom inkubatoru pri 37 ° C. Vinkristin (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO, 1.0 ug /ml) i ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO, 0,5 ug /ml) su dodani u medij za kulturu odgovarajućih staničnih sublini za održavati fenotip lijek otporne na pregled

Izgradnja pcDNA3.1 (+) -. arnt plazmid pregled

Kako bi pretjerano izričitog arnt, pcDNA3.1 (+) - arnt plazmid je konstruiran. Ljudski arnt cDNA Vektor ekspresije (pcDNA3.1 (+) - arnt) konstruirana je CW Biotech Co Ltd, Peking, Kina. Ukratko, plazmid pcDNA3.1 (+) - arnt se stvoriti u skladu s cDNA sekvence iz GenBank. Arnt gen je generiran PCR amplifikacije. Plazmid pcDNA3.1 (+) ekstrahira se kroz Maxi Priprema Kit (Omega, Georgia, SAD). PCR produkt je subkloniran u BamHI (Takara, Mountain View, SAD) i Hindlll (Takara) mjesta pcDNA3.1 plazmida T4 ligaze (Takara, Mountain View, SAD). PcDNA3.1 (+) -, Amt konstrukt je potvrđena sekvenciranjem DNA (Invitrogen, Grand Island, USA) (podaci nisu prikazani) pregled

Generiranje arnt stabilne stanične linije

SGC7901 /ADR stanice su uzgojene u 12-jažica s 1,0 × 10 ^{5 stanicama u svaku jažicu, u inkubatoru uz konstantnu opskrbu 5% CO2 na 37 ° C. Medij je promijenjen 24 h kasnije, s različitim koncentracijama G418 antibiotske G418 (600 ug /ml) i zamijenjen svaka 3 dana tijekom 14 dana nakon stanične kulture. Roditeljski stanice su transfektirane s pcDNA3.1 (+) - arnt plazmida pomoću Lipofectamine 2000 u skladu s uputama proizvođača. Gustoća stanica bila je 2 × 10 5 stanica po jažici u pločicama sa šest jamica. Monoklonska stanica kolonija otpor G418 dobiven je pomoću postupkom ograničenog razrjeđivanja kultiviranjem jednu ćeliju u 100 uL medija u pločicama s 96 jažica 24 sata. Monoklonskih stanične kolonije digerirani 15 dana za amplifikaciju da se stanice uzgajaju sa stabilnom arnt ekspresiju u 24 jažica. Stanice su prebačene u tikvicu stanične kulture sve dok nije otprilike 90% konfluentne. U arnt prekomjerno ekspresivne stanične linije transfektirane pcDNA3.1 (+) - arnt su imenovani kao SGC7901 /ADR arnt pregled}

Mali smetnje RNA (siRNA) transfekciju pregled

Za obaranje izraz arnt mRNA. , siRNA transfekcija je izvedena. Za transfekcije, Lipofektaminje 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 50 nM siRNA (Gene Pharma Co, Šangaj, Kina) se koriste u skladu s preporukama proizvođača kao što je ranije [55] što je opisano. SiRNA sekvence koriste su: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3' pregled

Western blot pregled

Ukupni proteini stanica su lizirani pomoću pufera za lizu, uz dodatak fenilmetilsulfonil fluorida (1 mM. ) na ledu. Zatim, protein se elektroforezi u 12% SDS poliakrilamidnim gelovima i preneseni na PVDF membranu (Millipore, Massachusetts, USA). 5% nemasnog mlijeka u prahu se koristi za blokiranje membrana, na sobnoj temperaturi 1 sat, a primarni protutijela su inkubirana preko noći. Potom su membrane inkubirane sa sekundarnim antitijelima obilježenim s HRP 1 h na sobnoj temperaturi nakon tri do 10 minuta ispiranja trietanolamin puferiranoj otopini soli s Tween (TBS-T). Konačno, signali su detektirani pomoću ECL kita (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) i membrane su skenirani i analizirani korištenjem ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, USA), slikovni sistem sa slike (verzija 1.0) , Tubulina je korištena kao interna kontrola. Spektara višebojni širokog raspona protein ljestve (Beyotime, Jiangsu, Kina) je korišten kao molekularnog biljega. Antitijela se koriste u zapadnoj upijajući testa može se vidjeti u tablici 3. pregled

Plate kolonija Test formiranje pregled

log-faze stanice su skupljene, nasađene na šest jamica (1 × 10 ^{4 stanica /jažici), te kemoterapeutika su dodani u medij kulture u drugom danu. Rezultirajući kolonija oboje s Coomassie Brilliant plavo (Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA), a vidljive kolonije brojani su nakon 2 tjedna. Pregled}

Analiza podataka pregled

to studija, informatički analiza podataka provedene su KangChen Biotech (Šangaju, NR Kina) .All preparata su skenirane na 5 lm /piksela koristeći Axon GenePix 4000B skener (Molecular Devices Corporation) runed by GenePix Pro 6.0 softver (aksona). Skenirane slike (JPEG format) su tada izvedena mreža za poravnanje i ekspresije analize podataka pomoću NimbleScan (verzija 2.5). Expression Podaci su normalizirani kroz Robusna čipova Prosjek (RMA) algoritam uključen u NimbleScan softvera. Osim toga, razina sonda datoteke i na razini mRNA datoteke su stvorena po normalizacije. Sve datoteke na razini gena su uvezeni u Agilent GeneSpring GX softvera (verzija 11.5.1) i normaliziraju strane kvantilnih metode; tada Combat softver se koristi za podešavanje normalizirani intenzitet ukloniti hrpa efekata. Značajno različito izražene lncRNAs i mRNA su identificirani kroz filtriranje vulkan parceli. Hijerarhijski klastera provedena je pomoću Agilent GeneSpring GX (verzija 11.5.1) [56]. Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Linearna analiza korelacija je izvedena pomoću Pearson metode u SPSS, verzija 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Razlike su smatrane značajna pri P vrijednosti < 0.05. Pregled

popratne podatke
S1 tablicu. lncRNA izraz profiliranje Podaci pregled DOI:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s001 pregled (XLS) pregled S2 stol. Konzistentno regulira prema gore i dolje regulirano lncRNAs između SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR i SGC7901 pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s002 pregled (XLS) pregled S3 stol. Izraz mRNA profiliranje podatke pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s003 pregled (XLS) pregled S4 stol. Konzistentno regulira prema gore i dolje-regulira mRNA između SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR i SGC7901 pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s004 pregled (XLS) pregled S5 stol. Gene Ontologija (GO) analiza pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0135461.s005 pregled (XLSX) pregled S6 stol.

• PLoS ONE: Serum HER2 je potencijalna zamjena za Tissue HER2 statusa u rak želuca: sustavni pregled i meta-Analysis
• PLoS ONE: HIF-1α inducira višestruke rezistencije na lijekove u rak želuca Stanice Izazivanje Mir 27a