PLoS ONE: resistent zijn tegen meedere Related Lang niet-coderende RNA Expressie Profiel Analyse van maagkanker

Abstract

Het effect van chemotherapie van maagkanker (GC) blijft zeer slecht vanwege multidrug resistentie (MDR). Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan MDR van GC blijft verre van volledig begrepen. Het doel van deze studie is de mogelijke mechanismen van de MDR GC illustreren in hoofdzaak de lange niet-coderende RNA (lncRNA) niveau. In deze studie, GC cellijn, SGC7901, en twee MDR sublijnen, SGC7901 /videorecorder en SGC7901 /ADR zijn onderworpen aan een lncRNA microarray-analyse. Bioinformatica en controle experimenten werden uitgevoerd om de potentiële lncRNAs betrokken bij de ontwikkeling van MDR onderzoeken. Pathway analyse gaf aan dat 15 trajecten overeen met neerwaarts gereguleerd transcripten en 20 trajecten overeen met opgereguleerd transcripten (p-waarde cut-off is 0,05). GO analyse toonde aan dat de hoogste verrijkte GO doelwit van opgereguleerd transcripten werden "systeemontwikkeling" en de hoogste esenriched GO waarop het downgereguleerde-transcripten werden "sterol biosynthese proces". Onze studie is de eerste die verschillend tot expressie in humane lncRNAs GC cellijn en de MDR sublijnen ondervragen en geeft aan dat lncRNAs moeite waard zijn voor verdere studie naar de nieuwe kandidaat biomerkers voor de klinische diagnose van MDR en potentiële doelwitten voor verdere therapie.

Citation: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) resistent zijn tegen meedere Related Lang niet-coderende RNA Expressie Profiel Analyse van maagkanker. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10.1371 /journal.pone.0135461

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 24 december 2014; Aanvaard: 22 juli 2015; Gepubliceerd: 20 augustus 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability: Alle ruwe data en de genormaliseerde gegevens werden getoond in http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door National programma op Key Basic Research Project ( "973" programma, No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); National Natural Science Foundation of China (nr 81301763); Henan provinciale belangrijke wetenschappelijke en technologische projecten (No. 142102310473); Key Program, National Natural Science Foundation of China (nr 81030044)

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

multidrug resistance ( MDR) blijft een belangrijke hinderpaal voor chemotherapie falen bij de behandeling van maagkanker, wat een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Meerdere multidrug resistentie-geassocieerde eiwitten (MRP) [1] of miRNAs [2] MDR mediëren via verschillende mechanismen zijn eerder geïdentificeerd. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan MDR van GC blijft verre van volledig duidelijk.

genoom sequencing aangegeven dat eukaryoten genomen coderen voor een verrassend groot aantal niet-coderende transcripten in vergelijking met prokaryote genomen. Onder deze niet-coderende transcripten, velen zijn lange niet-coderende RNA's (lncRNAs), die een belangrijke rol in de regulering van mRNA transcriptie of translatie op transcriptionele of post-transcriptionele niveau te spelen. lncRNAs zijn RNA's die coderen van potentiële missen, die zijn > 200 bp en zijn goed voor ten minste 80% van de transcripten van het gehele genoom [3]. Accumuleren gegevens wijzen erop dat lncRNA speelt een belangrijke rol in de regulatie van mRNA [4], organel biogenese [5], de subcellulaire handel van moleculen [6], en cel ontwikkeling [7] [8].

LncRNA ontregeling was betrokken bij meerdere soorten ziekten, waaronder kanker ^{[ 4 , 9 , 10 ]. Namelijk, kan lncRNAs een belangrijke rol in de carcinogenese, metastase en invasiviteit van meerdere kwaadaardige tumoren te spelen door middel van invloed oncogen expressie. Bijvoorbeeld kan de COX-2-lncRNA, PACER, fungeren als een nieuw potentieel doelwit voor COX-2-modulatie bij ontsteking en kanker [11]; -RNAi gemedieerde omverwerpen van LINC01081 in normale foetale long fibroblasten toonde aan dat dit een positieve lncRNA regelt FOXF1 transcript niveau, verder aangeeft dat de daling van de LINC01081 expressie kan bijdragen aan de ontwikkeling van de alveolaire capillaire dysplasie met uitlijning van pulmonale aderen [12]; lncRNA hetelucht kan ook een waardevolle voorspeller darmkanker beheer [13] en MALAT1 als potentiële prognostische indicator kan worden beschouwd en kan een doelwit voor diagnose en gentherapie voor alvleesklierbuis adenocarcinoom [14] zijn; overexpressie van lncRNA H19 verbetert carcinogenese en metastase van maagkanker en het effect van H19 in GC wordt gemedieerd door de directe opwaartse regulatie van ISM1 en indirecte onderdrukking van expressie CALN1 via miR-675 [15]. Vandaar voorlopige inzicht in de moleculaire mechanismen van MDR van GC te krijgen, hebben we de lncRNA expressie profiel van GC MDR sublijnen.}

Hier hebben we bestudeerden de differentieel tot expressie profielen van lncRNAs en mRNA tussen GC cellijn SGC7901 en MDR sublijnen SGC7901 /ADR en SGC7901 /videorecorder via lncRNA microarray-analyse. Vergelijking van differentieel tot expressie transcripten tussen de sublijnen en ouderlijke cellijn bleek 15 routes die overeenkwam met-down gereguleerd transcripties en 20 routes die overeenkwam met up-gereguleerd transcripten (p-waarde cut-off was 0,05). Gene ontologie (GO) analyse toonde aan dat de meest hoogverrijkt GO termen voor het up-gereguleerd transcripties waren "ontwikkeling van het systeem", "nucleosoom" en "binding" en de meest hoogverrijkt GO termen voor de-down gereguleerd transcripties waren "sterol biosynthetische proces "," cel periferie "en" steroid dehydrogenase activiteit ". Onze resultaten toonden aan dat de lncRNA en mRNA expressie profielen aanzienlijk tussen MDR sublijnen en ouderlijke cellijn verschilden. Deze bevinding suggereert dat de afwijkende expressie van lncRNAs kan bijdragen tot de ontwikkeling van MDR GC. Nader onderzoek van de verschillen in lncRNA expressie profielen kunnen potentiële nieuwe werkwijzen voor het omkeren van MDR fenotype van GC.

Resultaten

differentieel tot expressie lncRNAs

De highthroghput lncRNA microarray gegevens bleek een totaal van 27.883 lncRNAs uitgedrukt in maagkanker cellijn, SGC7901 en twee multidrug-resistentie sublijnen, SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR (S1 tabel). De relaties tussen monsters afleiden hiërarchische clustering analyse werd gebruikt om celllines rangschikken in groepen volgens hun expressieniveaus, waarbij hij de verhoudingen van de lncRNA expressie modi tussen celllines (figuur 1A en 1B). Nader onderzoek van deze gegevens vertoonden een gemiddelde van 1.637 differentieel tot expressie lncRNA. Onder hen, 638 waren constant up-gereguleerd en 999 werden consistent down-gereguleerd (het opvouwen change≥2.0) (S2 tabel). ASHG19A3A028863 (fold change: 146,0139) was de meest up-gereguleerd lncRNA en ASHG19A3A007184 (fold change: 58,7105) was de meest down-gereguleerd lncRNA. Bovendien, down-gereguleerd lncRNAs kwamen vaker dan up-gereguleerd lncRNAs in onze microarray data (S2 tabel).

differentieel tot expressie mRNA

Er waren 19.644 mRNA's geïdentificeerd in het GC MDR sublijnen door geanalyseerd mRNA expressieprofielen gegevens met microarray-analyse en de hiërarchische clustering analyse die de relaties tussen de mRNA expressie modi die in de GC MDR deellijnen en hun ouderlijke cellijn (Fig 2A en 2B) (Tabel S3) waren. Onder de verschillend tot expressie mRNA tussen SGC7901 /ADR, SGC7901 /videorecorder en SGC7901, 730 was altijd up-gereguleerd en 650 was consequent down-gereguleerd in SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR celllines vergelijking met SGC7901 (figuur 2B). (S4 Table). NM_000735 (gen symbool: CGA, fold change: 106,19) was de meest up-gereguleerd mRNA, en NM_001136574 (gen symbool: LANCL1, fold change: 25.43) was de meest down-gereguleerd mRNA (Fig 2B)

GO analyse

Om het gen te bepalen en gen product attributen in biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies, werd analyse Gene Ontology (GO) wordt uitgevoerd. Fisher's exact test wordt uitgevoerd om te testen of er nog overlap tussen het voorste lijst en de GO annotatie lijst dan verwacht toevallig. De p-waarde geeft de betekenis van termen GO verrijking in het voorste genen. Hoe lager de p-waarde, des te groter de GO Term (p-waarde < = 0,05 wordt aanbevolen). Daaruit bleek dat de hoogste verrijkt GO's het doelwit van up-gereguleerd transcripten waren weefsel homeostase (GO: 0.048.731; ontologie: biologisch proces; p = 6.84E-08) (Fig 3A), nucleosoom (GO: 0.000.786; ontologie: cellulaire component; p = 2.10E-07) (Fig 3B) en binding (GO: 0.005.488; ontologie: moleculaire functie; p = 0,001) (figuur 3C) en dat de hoogste verrijkt GO's het doelwit van de-down gereguleerd transcripten waren sterol biosynthese werkwijze (GO: 0016126; ontologie: biologisch proces; p = 0,000) (figuur 3D), cel periferie (GO: 0.071.944; ontologie: cellulaire component; p = 3.80E-06) (Fig 3E) steroïde dehydrogenase activiteit (GO: 0.016.229; ontologie: moleculaire functie; p = 0,001) (figuur 3F) (S5 tabel)

pathway analyse

In deze studie pathway analyse vertoonde dat 20 trajecten voortdurend overeen met opwaarts gereguleerd transcripten en dat het meest. verrijkte netwerk was: "Alcoholisme-Homo sapiens (menselijke)" (Fisher-p-waarde = 3.66E-08), bestaande uit 24 gerichte genen (figuur 4A); Bovendien is de pathway-analyse toonde ook aan dat 15 trajecten consequent overeen met down-gereguleerd transcripties en dat de meest verrijkte netwerk was "biosynthese-Homo sapiens (menselijke)" (Fisher-p-waarde = 0,00044), bestaande uit 5 gerichte genen (Fig 4B ) (S6 Table, de aanbevolen p-waarde cut-off is 0,05). Onder deze paden is het gen categorie "circadiane ritme" storing gemeld te worden geassocieerd met verschillende kankers, waaronder maagkanker [16], chronische myeloïde leukemie [17], hoofd en hals plaveiselcel carcinoma [18], hepatocellulair carcinoom [19 ], endometriumcarcinoom [20], en borstkanker [21]. De categorie gen "NOD-like receptor signaling pathway", bestaande uit NOD1, is gebleken dat NOD1 /CARD4 en NOD2 /CARD15 gen polymorfismen kan worden geassocieerd met veranderde kans op maag- [22], colorectale [23], long [24 ], larynx [25], galblaas [26], alvleesklier [27], dunne darm, nier [28], urineblaas kanker [29], huidkanker, lymphoma [30] en leukemie [31]. Hier hebben we verder onderzocht de expressie en functie van ARNT (arylkoolwaterstofreceptor nucleaire translocator) gemedieerde MDR1 (multidrug resistentie 1) opregulatie route. Het bleek dat ARNT en MDR1 significant opgereguleerd in SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR cellijnen vergeleken met SGC7901 het effect van aanzienlijke opwaartse regulatie van MDR1 gemedieerd door ARNT expressievector transfectie werd gecompromitteerd via Sp1 siRNA transfectie. Plate kolonie formatie test toonde aan dat SGC7901 /ADR cel kolonie vorming tarieven waren remarably hoger in pARNT + /siSp1- groep in vergelijking met pARNT + /siSp1 + groep met het adriamycine (ADR) aan te vullen in de cultuur meida (p < 0,0001) (Figuur 5).

Real time kwantitatieve PCR validatie

Om de microarray data, zes up-gereguleerd lncRNAs en tien onder gereguleerde lncRNAs werden willekeurig geselecteerd uit het consequent verschillend tot expressie lncRNAs behulp SGC7901 onderzoeken /ADR, SGC7901 /VCR en SGC7901 cellijnen en qRT-PCR resultaten en microarray gegevens consistent (figuur 6A); de expressieniveaus van deze lncRNAs verder bestuderen resistente gastrische weefsels twintig resistente maag monsters en paste niet multidrug-resistente weefsels werden onderzocht op het expressieniveau van deze lncRNAs met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) (figuur 6B) .De resultaten toonden aan dat maagkanker monsters behandeld met ADR voor 5 dagen vertoonden significant verschil van meningsuiting niveaus van deze zestien lncRNAs afformentioned vergelijking met de controlegroep (figuur 6C). Bovendien correlatie analyse toonde aan dat lncRNA NR_015379 expressie niveaus werden negatief gecorreleerd met de remming tarieven van deze twintig resistente gastric monsters (figuur 6D en 6E, p < 0,01).

Discussie

onze vorige onderzoek heeft al geconstateerd dat miR-21 van de drug weerstand van verschillende soorten kanker kunnen bevorderen [32]; LncRNA-MRUL bevordert ABCB1 expressie in multiresistente maagkanker cel sublijnen [33]; CUTL1 activiteit is omgekeerd geassocieerd met resistentie tegen geneesmiddelen en is dus een aantrekkelijk therapeutisch doel om multidrug resistance moduleren bij maagkanker [34]; maag CSCs werden geïdentificeerd uit-VCR voorgeconditioneerd SGC7901 cellijn, gekenmerkt door hoge tumorgeniciteit en het vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie [35]; Mad2 kan een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van menselijke maagkanker en dat silencing de Mad2 gen nodige doen aan de multidrug resistentie van maagkanker cellen [36] en door hypoxia opgewekte MGr1-Ag /37LRP expressie geactiveerd door HIF-1 hangt op ERK activatie. Deze gebeurtenissen zijn afhankelijk van reactieve zuurstof tussenproducten [37] .Echter, de mechanismen van GC multidrug resistance zijn veel meer Nader toegelichte en lncRNAs ontregeling van GC MDR sublijnen zijn nog niet onderzocht.

In deze studie, GC cellijn , SGC7901, en twee MDR sublijnen, SGC7901 /videorecorder en SGC7901 /ADR zijn onderworpen aan een lncRNA microarray-analyse. Bioinformatica en controle experimenten werden uitgevoerd om de potentiële lncRNAs betrokken bij de ontwikkeling van MDR onderzoeken. Pathway analyse gaf aan dat 15 trajecten overeen met neerwaarts gereguleerd transcripten en 20 trajecten overeen met opgereguleerd transcripten (p-waarde cut-off is 0,05). GO analyse toonde aan dat de hoogste verrijkte GO doelwit van opgereguleerd transcripten werden "ontwikkelingssysteem" en de hoogste esenriched GO waarop het downgereguleerde-transcripten werden "sterol biosynthese proces".

Verhoging erop wijst, dat lncRNA ( lange niet-coderende RNA) kunnen een belangrijke rol spelen bij carcinogenese en tumorinvasie en metastase [38]. Bijvoorbeeld Jan [39] enz aangetoond dat lncRNA PCGEM1
geassocieerd met prostaatkanker; transformerende groeifactor-β geïnduceerde lncRNA-Smad7 bleek apoptose van muis borstkanker JygMC (A) cellen te remmen en daarmee suggereren ed een complex mechanisme voor het regelen van de anti-apoptotische en tumor-progressieve aspecten van TGF-β signalering [40]; lncRNA, prostaatkanker geassocieerde transcript 29 (PCAT29), gekenmerkt samen met de relatie met de androgeenreceptor, fungeerde als een androgeen-gereguleerde tumor suppressor bij prostaatkanker [41]; Yuan etc ontdekte een nieuw TGF-β-geïnduceerde lncRNA, lncRNA-ATB, die EMT gestimuleerd door sekwestreren miR-200s en gefaciliteerd kolonisatie door het stabiliseren van IL-11
mRNA, waardoor zowel de vroege en late stappen van kanker metastase bevorderen [42].

Er is gevonden dat lncRNAs spelen een centrale rol bij het wijzigen van de expressie van eiwit-coderende genen via cis- of trans-mechanismen. Hier vonden we dat lncRNAs up-gereguleerd in SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR vergelijking met SGC7901lncRNA zoals AF119893, die intronic antisense was om NRP2 (neuropiline-2). Er is gesuggereerd dat de NRP2 /VEGF-C as een rol bij blaaskanker therapieresistentie en de VEGF-paxillin-NRP2 route zou een nieuw therapeutisch doelwit voor kanker en andere angiogenese-gerelateerde ziekten vertegenwoordigen speelt. lncRNA AF461897 was intron sense-overlapping van ABCB9. Dong etc heeft aangetoond dat miR-31 oefende een anti-apoptotisch effect waarschijnlijk door remming van ABCB9 en aldus een nieuwe strategie die het gebruik van miR-31 als een potentieel doelwit NSCLC chemotherapie. lncRNA BC065904 was intron zintuiglijke overlapping van CTBP2, een van de transcriptionele corepressoren van C-eindstandige bindingseiwit (CtBP) familie, die fungeerde als corepressor van E2F7 en als regulator van DNA schade respons. lncRNA NR_026900 was exon zintuiglijke overlapping QSOX1, dat werd aangetoond dat proliferatie, migratie en invasie van borstkankercellen in vitro te verminderen en vermindert tumorgroei in vivo.

Anderzijds, lncRNAs neergereguleerd in SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR vergelijking met SGC7901lncRNA zoals AF113689 was natuurlijk antisense te RRM1. Khatri etc hebben gemeld dat vóór blootstelling van RRM1 siRNA verminderde de IC50 waarde van gemcitabine hydrochloride 5 vouwen in A-549-cellen in vergelijking met Gemcitabine hydrochloride alleen, wat aangeeft dat RRM1 een potentiële oncogen van longkanker. lncRNA uc010iyh was intronic antisense van NAIP (neuronale apoptose remmend proteïne), dat is een van de IAP-familie. Het is aangetoond dat IAPs betrokken kunnen zijn bij prostaataandoeningen (BPH, PIN en PC) ontwikkeling sinds zou inhibitie van apoptose en vervolgens celproliferatie te lokken. LncRNA uc003jsd was exon zintuiglijke overlapping van PDE4D, d.w.z. cAMP-specifieke 3 ', 5'-cyclische phosphodiesterase 4D. Lin etc gebleken dat PDE4D functioneert als een tumor-bevorderende factor en een unieke richtbare enzym van kankercellen. LncRNA NR_002332 was exon zintuiglijke overlapping ST7, suppressor van tumorvorming 7, die is voorgesteld om een ​​tumorsuppressorgen in het chromosoom regio 7q31.1-q31.2 zijn.

Pathway analyse onthulde mogelijke routes betrokken bij de ontwikkeling van meervoudige geneesmiddel resistentie (MDR) van maagkanker. ARNT was een van de 20 trajecten voortdurend overeen met opwaarts gereguleerd transcripten en werd gerapporteerd als zijnde betrokken bij de multidrug resistentie ontwikkeling van meervoudige kwaadaardige tumoren [43], waaronder multiple myeloom [44], en AML (acute myeloïde leukemie) [45] . MDR1 codeert voor P-glycoproteïne die een energie-afhankelijke efflux pomp planaire hydrofobe moleculen waaronder sommige chemotherapeutische geneesmiddelen zoals adriamycine, cisplatine, taxol en dergelijke uit de cel [46, 47] kunnen uitvoeren. Hierbij bleek dat ARNT en MDR1 significant opgereguleerd in SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR cellijnen compacared aan SGC7901 het effect van aanzienlijke opwaartse regulatie van MDR1 gemedieerd door ARNT expressievector transfectie werd gecompromitteerd via Sp1 siRNA transfectie, die gewezen op de rol van ARNT-MDR1pathway in het MDR fenotype van maagkanker.

nader onderzoek bleek dat sommige eiwitten coderende genen betrokken bij de resistentie fenotype en de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren misschien heb cis-gereguleerd door gecorreleerde lncRNAs . Bijvoorbeeld, ABCB1 (ATP-bindende cassette, sub-familie B (MDR /TAP), lid 1, P-glycoproteïne (P-gp) coderende gen), gelegen 400KB stroomopwaarts van lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-gerelateerd en up- gereguleerd lncRNA), was significant up-gereguleerd door middel van een mogelijke versterking-achtige rol van MRUL en bevorderd drug-resistentie fenotype van SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR cellen [33]; ADAM22, een kandidaat-gen voor maligne transformatie van ovariële endometriose [48], werd gecorreleerd met lncRNA AL133090 in een exon-sense overlappende manier; PLCG1 werd gecorreleerd met lncRNA AK021471 in een intron-sense overlappende wijze en recidiverende mutaties in PLCG1 werd geïdentificeerd in angiosarcoma [49]; FYN werd gecorreleerd met lncRNA AK AK090692 in een intron sense-overlappende wijze en antagomir-1290 onderdrukt CD133 (+) cellen in niet-kleincellige longkanker door zich te richten-fyn gerelateerde Src familie tyrosine kinase [50], enz.

Deze studie toonde dat deregulering van lncRNAs was betrokken bij de ontwikkeling van multidrug-resistentie phynotype maagkanker. Nadere analyse van deze lncRNAs en aanverwante trajecten kunnen inzicht verschaffen om de mechanismen van chemotherapie geneesmiddelen resistentie van maagkanker en bieden nieuwe aanwijzingen voor reverse multidrug resistance phynotype.

Materialen en methoden

Ethics statement

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional review Board van de Vierde Militaire Medische Universiteit. Schriftelijke informed consent werd verkregen voor alle monsters van patiënten.

Cellijnen en celkweek

De menselijke GC cellijn SGC7901 werd verkregen uit de Academie van Militaire Medische Wetenschappen (Beijing, China). Twee multiresistente sublijnen, SGC7901 /videorecorder en SGC7901 /ADR, werden ontwikkeld in ons lab [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR en SGC7901 werden gekweekt in RPMI1640 medium (Thermo Scientific Co., USA) die was gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C. VCR (1,0 ug /ml) of ADR (0,5 ug /ml) werd toegevoegd aan het kweekmedium van de geschikte cellen om de geneesmiddel-resistente fenotype behouden.

RNA-isolatie, labeling en hybridisatie matrix

Totaal RNA werd geoogst uit SGC7901, SGC7901 /ADR en SGC7901 /videorecorder via TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA) en de RNeasy kit (Qiagen Co., Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant, inclusief een DNase digestiestap. Totaal RNA uit elke cellijn werd gekwantificeerd onder toepassing van een NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), RNA integriteit werd bepaald met standaard denaturerende agarosegelelektroforese, en de zuiverheid werd beoordeeld door de verhouding van de absorptie bij 260 nm 280 nm (A260 /A280). Dubbelstrengs cDNA (ds-cDNA) werd gesynthetiseerd onder toepassing van 5 ug totaal RNA door een Invitrogen SuperScript ds-cDNA synthese kit in aanwezigheid van 100 pmol oligo dT primers. Vervolgens wordt de ds-cDNA werd gemerkt en hybridisatie uitgevoerd zoals eerder beschreven [52]. Het RNA etikettering en microarray hybridisatie werd uitgevoerd door Kang Chen Bio-tech, Shanghai, PR China.

Highthroughput lncRNA expressie profiel analyse

Competentiecentrum RNA werd gebruikt voor het synthetiseren van dubbelstrengs cDNA met behulp van Superscript Double- cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Dubbelstrengs cDNA werd gemerkt en gehybridiseerd met de menselijke LncRNA microarray V2.0 (Arraystar Co. USA). microarray V2.0 bevat ongeveer 33.000 lncRNAs verzameld uit de gezaghebbende gegevensbronnen, inclusief NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs van literatuur en UCRs. Sequenties werden geselecteerd met eigen strategieën. Repeat sequenties en ncRNAs korter dan 200 bp werden geschrapt. Om statistische betrouwbaarheid te verbeteren, werd ieder mens lncRNA reeks bestaat uit 60.302 verschillende sondes (60 meren) en elk transcript werd vertegenwoordigd door 1-5 sondes. Elk transcript werd vertegenwoordigd door een specifiek exon of splitsingsplaats probe afzonderlijke transcripten nauwkeurig te identificeren. De microarray hibridization en bioinformatica analyse werd uitgevoerd door Kang Chen Bio-tech, Shanghai, PR China. De rauwe intensiteit data en de genormaliseerde gegevens werden getoond in Gene Expression Omnibus (GSE69342: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

De totale RNA van SGC7901, SGC7901 /ADR en SGC7901 /VCR werd geïsoleerd met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA) en werd daarna reverse getranscribeerd met behulp van PrimeScript RT reagens Kit met gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa, Dalian China) volgens de constructies van de fabrikant. De expressie van acht opgereguleerd lncRNAs en zes neerwaarts gereguleerd lncRNAs werd gemeten met qRT-PCR onder SYBRGreen assays (TaKaRa, Dalian, China), en GAPDH werd gebruikt als een interne controle. De primers zijn opgesomd in Tabel 1. De expressieniveau van elk lncRNA werd voorgesteld als factor van verandering toepassing van 2- △△ Ct methoden. De expressie niveau van lncRNAs differentieel tot expressie tussen SGC7901 en MDR sublijnen SGC7901 /ADR en SGC7901 /videorecorder werden geanalyseerd met behulp van de t-test van Student met SPSS (Versie 17.0 SPSS lnc). Een waarde van p < 0,05 werd beschouwd als significant.

histologische Drug Response Assay (HDRA) Fresh GC tumorweefsel werd geoogst uit elk chirurgisch resectiepreparaat en geplaatst in een 24-well plaat. Blokjes collageengel spons (1 cm ^{3) werden ondergedompeld in 1 ml RPMI 1640 te vullen met 20% foetaal runderserum. Tumorweefsels werden op collageenspons volgende ADR werden in een eindconcentratie van 6 ug /ml toegevoegd en ze werden geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO2 geplaatst. Tumorweefsels behandeld met fysiologische zoutoplossing (N.s) zonder ADR werden gebruikt als controle. Evaluatie en berekeningsmethoden zijn zoals eerder beschreven [53]. De inhibitieverhouding (IR) van tumorgroei = (1-gemiddelde absorptie van behandelde putjes per gram tumor /gemiddelde absorptie van controleputjes per gram tumor) x 100. In deze studie, de IR grenswaarde gelijk aan of groter dan 30% (IR30) werd gedefinieerd als chemosensitivity volgens voorlopige onderzoeksresultaat [54]. Net zoals aangegeven, moet de kliniek pathologische gegevens van de bron van de tumor weefsel gebruikt voor HDRA respectievelijk worden gegeven werden gepresenteerd in Tabel 2.}

Cellijnen en kweekomstandigheden

De menselijke GC cellijn SGC7901 was verkregen uit de Militaire Academie van Medische Wetenschappen (Beijing, China). Multiresistente sublijnen SGC7901 /videorecorder en SGC7901 /ADR werden ontwikkeld in ons lab. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR en SGC7901 werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Thermo Scientific, USA) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) (ThermoScientific) in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Vincristine (VCR, Sigma, Inc., St. Louis, MO; 1,0 ug /ml) en ADR (Sigma, Inc., St. Louis, MO; 0,5 ug /ml) toegevoegd aan het kweekmedium van juiste cel sublijnen te onderhouden van de drug-resistente fenotype

de bouw van pcDNA3.1 (+) -. ARNT plasmide

Om over-express ARNT, pcDNA3.1 (+) - ARNT plasmide werd geconstrueerd. De menselijke ARNT cDNA expressie vector (pcDNA3.1 (+) - ARNT) werd gebouwd door CW Biotech Co Ltd, Beijing, China. Kort samengevat, het plasmide pcDNA3.1 (+) - ARNT werd gegenereerd volgens de cDNA sequentie uit GenBank. De ARNT gen werd gegenereerd door PCR-amplificatie. Het plasmide pcDNA3.1 (+) werd geëxtraheerd door een Maxi Bereiding kit (Omega, Georgia, USA). Het PCR-product werd gesubkloneerd in de BamHI (Takara, Mountain View, USA) en sites HindIII (Takara) van pcDNA3.1 plasmide door T4 ligase (Takara, Mountain View, USA). De pcDNA3.1 (+) -. ARNT construct werd geverifieerd door DNA sequentiebepaling (Invitrogen, Grand Island, USA) (gegevens niet getoond)

Het maken van ARNT stabiele cellijnen

SGC7901 /ADR cellen werden gekweekt in 12-well platen met 1,0 x 10 ^{5 cellen in elk putje, in een incubator met constante toevoer van 5% CO2 bij 37 ° C. Het medium werd 24 uur later gewijzigd met verschillende concentraties G418 antibioticum G418 (600 ug /ml) en vervangen elke 3 dagen gedurende 14 dagen na celcultuur. Ouderlijke cellen werden getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) - ARNT plasmiden met gebruik van Lipofectamine 2000 volgens de instructies van de fabrikant. De dichtheid van de cellen is 2 x 10 5 cellen per putje in platen met zes putjes. Monoklonale celkolonie met G418 resistentie werd onder toepassing van beperkende verdunning methode kweken cel in 100 ul medium in 96-well platen voor 24 uur. Monoklonale celkolonies 15 dagen later gedigereerd voor verdere amplificatie kweekcellen met stabiele ARNT expressie in 24-well platen. Cellen werden overgebracht naar celkweekkolf totdat er ongeveer 90% confluent. De ARNT over-uitgedrukt cellijnen getransfecteerd met pcDNA3.1 (+) - ARNT werden genoemd als SGC7901 /ADR ARNT}

Kleine interferentie RNA (siRNA) transfectie

Om knockdown de ARNT mRNA expressie. , siRNA transfectie werd uitgevoerd. Voor transfecties Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en 50 nM siRNA (Gene Pharma Co, Shanghai, China) werden volgens de aanbevelingen van de fabrikant zoals eerder [55] beschreven. De siRNA-sequenties gebruikt: 5'-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ', 5'-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3'

Western blotting

De totale celeiwit werden gelyseerd middels lysis buffer gesupplementeerd met fenylmethylsulfonylfluoride (1 mM. ) op ijs. Vervolgens werd eiwit geëlektroforeerd over 12% SDS-polyacrylamidegels en overgebracht naar een PVDF-membraan (Millipore, Massachusetts, USA). 5% magere melkpoeder werd gebruikt om membranen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur geblokkeerd en de primaire antilichamen werden overnacht geïncubeerd. Daarna werden membranen geïncubeerd met secundaire antilichamen gemerkt met HRP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur na drie 10-min wassingen in triethanolamine gebufferde zoutoplossing met Tween (TBS-T). Tenslotte werden de signalen gedetecteerd met een ECL kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) en de membranen werden gescand en geanalyseerd met een ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, Californië, USA) beeldvormingssysteem met beeldverwerkingssoftware (versie 1,0) . Tubuline werd gebruikt als een interne controle. De Spectra multicolor brede range eiwit ladder (Beyotime, Jiangsu, China) werd gebruikt als een moleculaire marker. De antilichamen gebruikt in de Western blot assay kan worden gezien in de Tabel 3.

Plate kolonievorming assay

De log-fase cellen werden geoogst, uitgeplaat in platen met zes putjes (1 x 10 ^{4 cellen /putje), en chemotherapeutische geneesmiddelen werden toegevoegd in het kweekmedium op de tweede dag. De resulterende kolonies werden gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (Sigma, Inc., St. Louis, MO, USA) en de zichtbare kolonies werden geteld na 2 weken.}

Gegevensanalyse

In deze studie, informatic data-analyse werden uitgevoerd door Kang Chen Biotech (Shanghai, PR China) .Alle van de dia's werden gescand op 5 lm /pixel resolutie met behulp van een Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices Corporation) runed door GenePix Pro 6.0 software (Axon). Gescande afbeeldingen (JPEG-formaat) werden vervolgens uitgevoerd rasteruitlijning en expressie data-analyse met behulp van NimbleScan software (versie 2.5). Expression gegevens werden genormaliseerd door middel van robuuste Multichip Average (RMA) algoritme opgenomen in de NimbleScan software. Bovendien is de sonde niveau bestanden en mRNA-niveau dossiers werden gegenereerd na normalisering. Alle gen level bestanden zijn geïmporteerd in Agilent GeneSpring GX software (versie 11.5.1) en genormaliseerd door de kwantiel methode; vervolgens werd het gevecht software gebruikt om de genormaliseerde intensiteit aanpassen om batch effecten te verwijderen. Significant verschillend tot expressie lncRNAs en mRNA werden geïdentificeerd door middel van Volcano Plot filtering. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd met behulp van Agilent GeneSpring GX software (versie 11.5.1) [56]. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking (SD). Lineaire correlatie analyse werd uitgevoerd met behulp van Pearson methode in SPSS, versie 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Verschillen werden significant beschouwd bij een p-waarde van < 0.05.

Ondersteunende informatie
S1 Table. De lncRNA expressie profiling data
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135461.s001
(XLS)
S2 Table. De constant up-gereguleerd en down-gereguleerd lncRNAs tussen SGC7901 /ADR, SGC7901 /videorecorder en SGC7901
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135461.s002
(XLS)
S3 Table. De mRNA expressie profiling data
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135461.s003
(XLS)
S4 Table. De constant up-gereguleerd en down-gereguleerd mRNA tussen SGC7901 /ADR, SGC7901 /videorecorder en SGC7901
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135461.s004
(XLS)
S5 Table. Gene Ontology (GO) analyse
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135461.s005
(XLSX)
S6 Table.

• PLoS ONE: Serum HER2 is een potentiële surrogaat voor Tissue HER2 Status bij maagkanker: een systematische review en meta-Analysis
• PLoS ONE: HIF-1α induceert multidrug resistance bij maagkanker Cellen door het induceren van MiR-27a