PLOS ONE: multirésistance longue connexes non-codage ARN Expression Profil Analyse de gastrique Cancer

Résumé

L'effet de la chimiothérapie du cancer gastrique (GC) reste très faible en raison de la multirésistance (MDR). Cependant, les mécanismes sous-jacents MDR de GC reste loin d'être pleinement compris. Le but de cette étude est d'illustrer les mécanismes potentiels de la MDR de GC à principalement le niveau à long ARN non codant (lncRNA). Dans cette étude, la lignée cellulaire GC, SGC7901 lignées, et deux MDR, SGC7901 /VCR et SGC7901 /ADR ont été soumis à une analyse lncRNA microarray. Bioinformatique et expériences de vérification ont été effectuées pour étudier les lncRNAs potentiels impliqués dans le développement du MDR. analyse de Pathway a indiqué que 15 voies correspondaient à des transcrits régulés à la baisse et que 20 voies correspondaient à régulés à la hausse des transcriptions (p-valeur de coupure est de 0,05). GO analyse a montré que les GOs plus haut enrichis ciblés par les transcriptions jusqu'à réglementés étaient "le développement du système» et les GOs plus élevés esenriched ciblés par les relevés de notes de bas réglementés étaient «processus de biosynthèse des stérols". Notre étude est la première à interroger lncRNAs différentiellement exprimés dans la lignée cellulaire de GC humaine et MDR-lignées et indique que lncRNAs sont valables pour une étude plus approfondie pour être les nouveaux biomarqueurs candidats pour le diagnostic clinique des objectifs de MDR et potentiels pour la poursuite du traitement.

Citation: Wang Y, Wu K, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) multirésistance longue connexes non-codage ARN Expression Profil Analyse de cancer gastrique. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10.1371 /journal.pone.0135461

Editeur: Jin Cheng Q., H.Lee Moffitt Cancer Center & Institut de recherche, ÉTATS-UNIS

Reçu le 24 Décembre 2014; Accepté 22 Juillet 2015; Publié 20 Août, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les premières les données de données et normalisées ont été montrées dans http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

financement:. Ce travail a été soutenu par le national Programme sur le projet de recherche fondamentale Key (programme "973", No. 2010CB529302, No. 2010CB529305, No. 2010CB529306); National Natural Science Foundation de Chine (n ° 81301763); projets Henan provinciaux clés scientifiques et technologiques (n ° 142102310473); Programme clé, National Natural Science Foundation de Chine (n ° 81030044)

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent

résistance polychimiothérapie
Introduction ( MDR) reste un obstacle majeur à l'échec de la chimiothérapie dans le traitement du cancer gastrique, ce qui est une cause majeure de décès liés au cancer dans le monde entier. protéines associées à la résistance multirésistantes multiples (MRP) [1] ou miARN [2] que la médiation MDR grâce à des mécanismes différents ont été identifiés précédemment. Cependant, les mécanismes sous-jacents de MDR GC reste loin d'être tout à fait clair.

Génomes séquençage a indiqué que les génomes eucaryotes codent un nombre étonnamment élevé de transcrits non codantes par rapport aux génomes procaryotes. Parmi ces transcriptions non codantes, beaucoup sont longs ARN non codants (lncRNAs) qui jouent un rôle important dans la régulation de l'ARNm de transcription ou de traduction au niveau de la transcription ou post-transcriptionnel. lncRNAs sont des ARN qui manquent de potentiel de codage, qui sont > 200 pb et représentent au moins 80% des transcriptions de l'ensemble du génome [3]. Les données accumulées indiquent que lncRNA joue un rôle important dans la régulation de l'ARNm [4], organite biogenèse [5], le trafic subcellulaire de molécules [6], et le développement des cellules [7] [8].

lncRNA dysrégulation a été impliqué dans plusieurs types de maladies, y compris le cancer ^{[ 4 , 9 , 10 ]. A savoir, lncRNAs peut jouer un rôle important dans la carcinogenèse, la métastase et l'invasivité de multiples tumeurs malignes en affectant l'expression oncogène. Par exemple, la COX-2-lncRNA, PACER, peut agir comme une nouvelle cible potentielle pour la COX-2-modulation dans l'inflammation et le cancer [11]; ARNi médiée knock-down de LINC01081 dans les fibroblastes pulmonaires foetales normales a montré que cette lncRNA régule positivement le niveau de transcription FOXF1, ce qui indique en outre que la diminution de l'expression de LINC01081 peut contribuer au développement alvéolaire dysplasie capillaire avec un mauvais alignement des veines pulmonaires [12]; lncRNA Hotair peut aussi être un facteur prédictif utile pour le traitement du cancer du côlon [13] et MALAT1 pourrait être considérée comme un indicateur pronostique potentiel et peut être une cible pour le diagnostic et la thérapie génique pour le canal pancréatique adénocarcinomes [14]; surexpression de lncRNA H19 améliore la carcinogenèse et les métastases du cancer gastrique et l'effet de H19 en GC est médiée par la régulation positive directe de ISM1 et la suppression indirecte d'expression CALN1 via miR-675 [15]. Par conséquent, pour obtenir un aperçu préliminaire des mécanismes moléculaires de la MDR de GC, nous avons étudié le profil d'expression lncRNA des lignées GC MDR.}

Ici, nous avons étudié les profils d'expression différentiellement de lncRNAs et ARNm entre GC lignée cellulaire SGC7901 et MDR lignées SGC7901 /ADR et SGC7901 /VCR en utilisant lncRNA analyse des microréseaux. Comparaison des transcriptions différentiellement exprimés entre les lignées et lignée cellulaire parentale a révélé 15 voies qui correspondaient à des transcriptions de régulés à la baisse et 20 voies qui correspondent à des transcrits régulés à la hausse (valeur p de coupure était de 0,05). L'ontologie génétique (GO) analyse a montré que les termes les GO les plus hautement enrichi pour les transcriptions régulés à la hausse étaient "le développement du système", "nucléosome", et "obligatoires" et les termes les GO les plus hautement enrichi pour les relevés de notes en bas réglementés étaient "stérol procédé biosynthétique »,« périphérie de la cellule "et" activité stéroïde-déshydrogénase ». Nos résultats ont montré que les profils d'expression lncRNA et ARNm différaient significativement entre les lignées MDR et Celline parental. Cette découverte suggère que les niveaux d'expression aberrants de lncRNAs peuvent contribuer au développement de la tuberculose en GC. Une étude plus approfondie des différences dans les profils d'expression lncRNA peut fournir de nouvelles méthodes potentielles pour inverser MDR phénotype de GC.

Résultats différentiellement exprimé lncRNAs

Les données de biopuces highthroghput de lncRNA a montré une total de 27,883 lncRNAs exprimées dans la lignée cellulaire de cancer gastrique, SGC7901 et deux lignées multirésistance, SGC7901 /ADR et SGC7901 /VCR (S1 Table). Pour déduire les relations entre les échantillons, l'analyse de classification hiérarchique a été utilisé pour organiser des celllines en groupes en fonction de leurs niveaux d'expression, présentant les relations entre les modes d'expression lncRNA entre celllines (figure 1A et 1B). Une étude plus approfondie de ces données a montré une moyenne de 1637 différentiellement exprimé lncRNA. Parmi eux, 638 étaient toujours régulés à la hausse et 999 ont été constamment régulée à la baisse (fold change≥2.0) (S2 Tableau). ASHG19A3A028863 (fold change: 146,0139) a été le plus régulé à la hausse lncRNA et ASHG19A3A007184 (fold change: 58,7105) a été le plus régulé à la baisse lncRNA. En outre, lncRNAs down-régulés étaient plus fréquents que lncRNAs régulée à la hausse dans nos données de biopuces (S2 Tableau).

différentiellement exprimé mARN

Il y avait 19,644 ARNm identifiés dans les lignées GC MDR analysées par l'expression d'ARNm de profilage des données en utilisant une analyse de puces à ADN et l'analyse de clustering hiérarchique présente les relations entre les modes d'expression de l'ARNm qui étaient présents dans les sous-chaînes GC MDR et leur Celline parentale (figure 2A et 2B) (S3 tableau). Parmi les ARNm différentiellement exprimés entre SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR et SGC7901, 730 était constamment régulée à la hausse et 650 était constamment régulée à la baisse dans SGC7901 /ADR et celllines SGC7901 /magnétoscope par rapport à SGC7901 (figure 2B). (S4 tableau). NM_000735 (symbole de gène: CGA, pli changement: 106.19) était le symbole (gène: LANCL1, fold change: 25,43) les plus régulés à la hausse de l'ARNm, et NM_001136574 était le plus régulé à la baisse de l'ARNm (figure 2B)

analyse GO

Pour déterminer le gène et produit du gène attributs dans les processus biologiques, les composants cellulaires et fonctions moléculaires, Gene Ontology (GO) analyse a été effectuée par les présentes. Le test exact de Fisher est fait pour tester s'il y a plus de chevauchement entre la liste DE et la liste d'annotation GO que celle qui serait attendue par hasard. La valeur p dénote l'importance de GO termes d'enrichissement dans les gènes DE. Plus la valeur p, plus importante que le GO terme (valeur p < = 0,05 est recommandé). Elle a montré que les GOs plus haut enrichis ciblés par régulés à la hausse des transcriptions étaient homéostasie tissulaire (GO: 0048731; ontologie: processus biologique; p = 6.84E-08) (figure 3A), nucléosome (GO: 0000786; ontologie: composant cellulaire; p = 2.10E-07) (figure 3B) et de liaison (GO: 0005488; ontologie: fonction moléculaire; p = 0,001) (figure 3C) et que les GOs le plus enrichi visés par les relevés de notes de bas réglementés étaient processus de biosynthèse des stérols (GO: 0016126; ontologie: processus biologique; p = 0,000) (figure 3D), périphérie de la cellule (GO: 0071944; ontologie: composant cellulaire; p =) (figure 3E) déshydrogénase stéroïde 3.80E-06 (GO: 0016229; ontologie: moléculaire fonction; p = 0,001) (figure 3F) (S5 Table)

Pathway analyse

Dans cette étude, l'analyse des voies expose que 20 voies toujours correspondu à régulés à la hausse des transcriptions et que le plus. réseau enrichi était "sapiens alcoolisme-Homo (humaine)" (Fisher-P value = 3.66E-08) composé de 24 gènes ciblés (figure 4A); Par ailleurs, l'analyse des voies a également montré que les 15 voies de manière cohérente correspondent à des transcrits régulés à la baisse et que le réseau le plus enrichi était "Steroid sapiens biosynthèse Homo (humain)" (valeur Fisher-P = 0,00044) composé de 5 gènes cibles (figure 4B ) (S6 Table, le recommande p-valeur de coupure est de 0,05). Parmi ces voies, la catégorie de gènes "rythme circadien" perturbation a été signalé à être associé à divers cancers, dont le cancer gastrique [16], la leucémie myéloïde chronique [17], la tête et le cou carcinome épidermoïde [18], le carcinome hépatocellulaire [19 ], de l'endomètre carcinome [20] et le cancer du sein [21]. La catégorie de gène "voie de signalisation du récepteur NOD-like", qui se compose de NOD1, a été montré que NOD1 /CARD4 et NOD2 /CARD15 polymorphismes du gène peuvent être associés à un risque modifié de gastrique [22], colorectal [23], du poumon [24 ], laryngé [25], la vésicule biliaire [26], du pancréas [27], de l'intestin grêle, le rein [28], le cancer de la vessie [29], le cancer de la peau, le lymphome [30] et de la leucémie [31]. Ici, nous avons examiné en outre l'expression et la fonction de ARNT (aryl hydrocarbure récepteur de translocation nucléaire) médiée MDR1 (multirésistance 1) de voie régulation à la hausse. Il a été constaté que ARNT et MDR1 étaient significativement régulés à la hausse dans SGC7901 /ADR et des lignées cellulaires /VCR SGC7901 par rapport à SGC7901, l'effet de la régulation à la hausse significative de MDR1 médiée par ARNT vecteur d'expression transfection a été compromise par Sp1 siRNA transfection. essai de formation plaque de colonies a montré que SGC7901 /ADR colonies de cellules taux de formation étaient remarably plus élevés dans pARNT + /siSp1- groupe par rapport à pARNT + /siSp1 + group avec le complément de l'adriamycine (ADR) dans la culture meida (p < 0,0001) (figure 5).

en temps réel validation quantitative PCR

Pour examiner les données de biopuces, six lncRNAs régulés à la hausse et dix lncRNAs sous-réglementés ont été choisis au hasard parmi les lncRNAs toujours exprimés de manière différentielle en utilisant SGC7901 /ADR, SGC7901 /magnétoscope et SGC7901 cellines et la qRT-PCR résultats et les données de puces à ADN sont compatibles (figure 6A); d'étudier plus avant les niveaux de ces lncRNAs d'expression dans les tissus gastriques résistants aux médicaments, vingt échantillons gastriques résistants aux médicaments et appariés tissus multirésistantes non ont été examinés pour le niveau de ces lncRNAs utilisant quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) expression (figure 6B) .Les résultats ont montré que les échantillons de cancer gastrique traités avec ADR pendant 5 jours présentaient des différences significatives de ces seize niveaux d'expression lncRNAs afformentioned comparés aux groupes témoins (figure 6C). En outre, l'analyse de corrélation a montré que les niveaux d'expression lncRNA NR_015379 ont été négativement corrélés avec les taux d'inhibition de ces vingt échantillons gastriques résistants aux médicaments (figure 6D et 6E, p < 0,01).

Discussion

Notre recherche précédente a déjà constaté que miR-21 peut favoriser la résistance aux médicaments de divers cancers [32]; LncRNA-MRUL favorise l'expression de ABCB1 dans gastriques lignées de cellules cancéreuses multirésistantes [33]; activité CUTL1 est inversement associée à la résistance aux médicaments et est donc une cible thérapeutique attractive pour moduler la résistance multidrogues dans le cancer gastrique [34]; CSCs gastriques ont été identifiés à partir de la lignée cellulaire de SGC7901 VCR-préconditionnés, caractérisé par une forte tumorigénicité et la capacité d'auto-renouvellement et de différenciation [35]; MAD2 pourrait jouer un rôle important dans le développement du cancer de l'estomac humain et que l'inhibition du gène MAD2 peut aider à faire face à la multirésistance des cellules gastriques de cancer [36] et mgr1-Ag /37LRP expression de l'hypoxie provoquée activés par HIF-1 dépend lors de l'activation d'ERK. Ces événements sont dépendants des intermédiaires réactifs de l'oxygène [37] .Cependant, les mécanismes de résistance multidrogue de GC sont beaucoup plus élucidé et lncRNAs dysrégulation des lignées GC MDR n'a pas encore été étudié.

Dans cette étude, la lignée cellulaire GC , sous-lignées SGC7901 et deux MDR, SGC7901 /magnétoscope et SGC7901 /ADR ont été soumis à une analyse lncRNA de puces à ADN. Bioinformatique et expériences de vérification ont été effectuées pour étudier les lncRNAs potentiels impliqués dans le développement du MDR. analyse de Pathway a indiqué que 15 voies correspondaient à des transcrits régulés à la baisse et que 20 voies correspondaient à régulés à la hausse des transcriptions (p-valeur de coupure est de 0,05). GO analyse a montré que les GOs plus haut enrichis ciblés par régulés à la hausse des transcriptions étaient «le développement du système» et les GOs plus élevés esenriched ciblés par les relevés de notes de bas réglementés étaient «processus de biosynthèse des stérols".

augmentation de la preuve a montré que lncRNA ( longue ARN non codants) peuvent jouer un rôle important dans la carcinogenèse et de l'invasion tumorale et les métastases [38]. Par exemple, John [39] ont démontré que lncRNA etc. PCGEM1
est associée au cancer de la prostate; a été trouvé la croissance transformant le facteur β-induite lncRNA-Smad7 pour inhiber l'apoptose des cancers du sein de la souris JygMC cellules (A) et donc suggèrent ed un mécanisme complexe de régulation des aspects anti-apoptotique et tumeurs progressives de TGF-β de signalisation [40]; lncRNA, de la prostate transcription associée au cancer 29 (PCAT29), se caractérise en même temps que son rapport avec le récepteur d'androgène, fonctionne comme un suppresseur de tumeur androgéno-régulé dans le cancer de la prostate [41]; Yuan etc découvert un roman lncRNA TGF-β-induite, lncRNA-ATB, qui a stimulé EMT par séquestrant miR-200s et a facilité la colonisation en stabilisant IL-11
ARNm, favorisant ainsi les étapes à la fois précoces et tardifs de métastases du cancer [42].

Il a été constaté que lncRNAs jouent un rôle essentiel dans la modification de l'expression des gènes codant pour des protéines via cis ou trans mécanismes. Ici, nous avons constaté que lncRNAs régulée à la hausse dans SGC7901 /ADR et SGC7901 /VCR par rapport SGC7901lncRNA tel que AF119893, qui est anti-sens à intronique NRP2 (neuropiline-2). Il a été suggéré que l'axe NRP2 /VEGF-C joue un rôle dans la résistance à la thérapie du cancer de la vessie et de la voie VEGF-paxilline NRP2 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique pour le cancer et d'autres maladies liées à l'angiogenèse. lncRNA AF461897 était intron sens-chevauchement des ABCB9. Dong, etc a démontré que miR-31 exerce un effet anti-apoptotique très probablement par l'inhibition de ABCB9 et de proposer une nouvelle stratégie impliquant l'utilisation de miR-31 comme une cible potentielle dans la chimiothérapie ainsi NSCLC. lncRNA BC065904 était intron sens-chevauchement des CTBP2, l'un des co-répresseurs de la transcription de C-terminal protéine de liaison (CtBP) famille, qui a fonctionné comme un corepressor de E2F7 et en tant que régulateur de la réponse aux dommages de l'ADN. lncRNA NR_026900 était exon sens-chevauchement des QSOX1, qui a été démontré pour réduire la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses du sein in vitro et réduit la croissance tumorale in vivo.

D'autre part, lncRNAs régulée à la baisse dans SGC7901 /ADR et SGC7901 /VCR comparativement à SGC7901lncRNA tels que AF113689 était antisens naturelle à RRM1. Khatri etc ont rapporté que la pré-exposition de RRM1 ARNsi a diminué la valeur IC50 du chlorhydrate de gemcitabine 5 plis dans les cellules A-549 par rapport à la gemcitabine seule chlorhydrate, ce qui indique que RRM1 était un oncogène potentiel de cancer du poumon. lncRNA uc010iyh était antisens intronique du PNIA (Neuronal Apoptose de protéine inhibitrice), qui est l'un des IAP-famille. Il a été démontré que les PIA pourraient être impliqués dans les troubles de la prostate (BPH, PIN et PC) étant donné que le développement pourrait provoquer une inhibition de l'apoptose et par la suite la prolifération cellulaire. LncRNA uc003jsd était exon sens-chevauchement des PDE4D, i.e, 3 'spécifique-AMPc, 5'-cyclique phosphodiestérase 4D. Lin, etc. a montré que les fonctions de PDE4D en tant que facteur de promotion tumorale et représente une enzyme de ciblage unique de cellules cancéreuses. LncRNA NR_002332 était exon sens-chevauchement des ST7, suppresseur de tumorigénicité 7, qui a été proposé comme un gène suppresseur de tumeur dans la région chromosomique 7q31.1-q31.2.

Analyse de Pathway a révélé les voies potentielles impliquées dans le développement de la multirésistance (MDR) du cancer gastrique. ARNT était l'une des 20 voies toujours correspondu à régulés à la hausse des transcriptions et a été signalé à être impliqué dans le développement de la multirésistance de multiples tumeurs malignes [43], y compris le myélome multiple [44], et AML (leucémie myéloïde aiguë) [45] . MDR1 code pour la P-glycoprotéine qui est une pompe d'efflux dépendant de l'énergie qui peut exporter des molécules hydrophobes planes, y compris certains médicaments chimiothérapeutiques tels que l'adriamycine, le cisplatine, le taxol et ainsi de suite à partir de la cellule [46, 47]. Ici, nous avons constaté que ARNT et MDR1 étaient significativement régulés à la hausse dans SGC7901 /ADR et des lignées cellulaires /VCR SGC7901 compacared à SGC7901, l'effet de la régulation à la hausse significative de MDR1 médiée par ARNT vecteur d'expression transfection a été compromise par l'intermédiaire Sp1 siRNA transfection, qui a indiqué le rôle de ARNT-MDR1pathway dans le phénotype MDR du cancer gastrique.

Une enquête plus poussée a montré que certains gènes codant pour des protéines impliquées dans le phénotype et le développement de tumeurs malignes de résistance aux médicaments peut-être étaient cis-régulés par lncRNAs corrélés . Par exemple, ABCB1 (ATP-binding cassette, sous-famille B (MDR /TAP), membre 1, P-glycoprotéine (P-gp) du gène codant), situé en amont 400Kb de lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-liés et amont réglementé lncRNA), était significativement régulée à la hausse grâce à un rôle de mise en valeur comme potentiel joué par MRUL et promu la résistance aux médicaments de phénotype SGC7901 /ADR et SGC7901 /cellules VCR [33]; ADAM22, un gène candidat pour une transformation maligne de l'endométriose ovarienne [48], a été corrélée avec lncRNA AL133090 d'une manière logique se chevauchant exon; PLCG1 a été corrélée avec lncRNA AK021471 d'une manière logique chevauchantes intron et des mutations récurrentes dans PLCG1 a été identifié dans les angiosarcomes [49]; FYN a été corrélée avec lncRNA AK AK090692 dans un intron sens chevauchantes chemin et antagomir-1290 supprime CD133 (+) cellules non-petit cancer du poumon en ciblant liés Fyn-Src tyrosine kinase de la famille [50], etc.

Cette étude a démontré que la déréglementation des lncRNAs a été impliqué dans le développement de multirésistance phynotype du cancer gastrique. Une analyse plus poussée de ces lncRNAs et les voies connexes pourrait donner un aperçu des mécanismes de résistance aux médicaments de chimiothérapie du cancer gastrique et fournir de nouvelles directions pour la marche arrière phynotype de multirésistance.

Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Conseil de la quatrième université médicale militaire Institutional Review. Le consentement éclairé écrit a été obtenu pour tous les échantillons de patients.

Les lignées cellulaires et la culture cellulaire

La lignée cellulaire de GC humaine SGC7901 a été obtenu à partir de l'Académie des sciences militaires médicale (Beijing, Chine). Deux lignées multirésistantes, SGC7901 /VCR et SGC7901 /ADR, ont été développés dans notre laboratoire [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR et SGC7901 ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 (Thermo Scientific Co., USA) qui a été complété par 10% de sérum de veau foetal (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 à 37 ° C. Magnétoscope (1,0 pg /ml) ou de l'ADR (0,5 pg /ml) ont été ajoutés dans le milieu de culture des cellules appropriées pour maintenir le phénotype de résistance aux médicaments.

isolement de l'ARN, l'étiquetage et le réseau d'hybridation

ARN total a été récolté à partir de SGC7901, SGC7901 /ADR et SGC7901 /VCR en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, CA, USA) et le kit RNeasy (Qiagen Co., Allemagne) selon les instructions du fabricant, y compris une étape DNase de digestion. L'ARN total de chaque lignée cellulaire a été quantifié en utilisant un NanoDrop ND-1000 (DO 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), l'intégrité de l'ARN a été évaluée en utilisant un étalon électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose, et la pureté a été évaluée par le rapport de l'absorbance à 260 nm

• PLOS ONE: Sérum HER2 est un substitut potentiel de tissus statut HER2 dans le cancer gastrique: Une revue systématique et méta-analyse
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