PLoS ONE: Jämförande Proteomics Analys för magcancer Stem Cells

Abstrakt

Cancer stamceller (CSCS) är ansvariga för cancer progression, metastas, och återfall. Hittills har de specifika markörer för CSCs förblir oupptäckta. Syftet med denna studie var att identifiera nya biomarkörer för gastric CSCs för klinisk diagnos med hjälp av proteomik teknik. CSC-liknande SP-celler, OCUM-12 /SP-celler, OCUM-2MD3 /SP-celler, och deras moder OCUM-12-celler och OCUM-2MD3 celler användes i denna studie. Proteinlysat från varje cellinje analyserades med användning QSTAR Elite Liquid Chromatography med Tandem-masspektrometri, i kombination med isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering teknik. Kandidatproteiner upptäcks av proteomik teknik validerades genom immunhistokemisk analys av 300 magsäckscancer. Baserat på resultaten av LC-MS /MS, åtta proteiner, inklusive RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA och KRT18, var uppreglerade i båda OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP celler i jämförelse med deras motsvarande moderceller. RT-PCR-analys indikerade att expressionsnivån av RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, och CK18
var hög i OCUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP, i jämförelse med kontrollen av överordnade OCUM-12 och OCUM-2MD3. Dessa proteiner var signifikant associerade med avancerad invasion djup, lymfkörtel metastas, fjärrmetastaser eller avancerad klinisk fas. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 och ALDOA uttryck i synnerhet var signifikant associerade med en dålig prognos i 300 gastric cancerpatienter. RBBP6 bestämdes att vara en oberoende prognostisk faktor. Rörligheten stimulerande förmåga OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler hämmades av RBBP6
siRNA. Dessa fynd kan tyda på att de åtta proteiner, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA och KRT18, utnyttja jämförande proteomik analys, uppfattades vara potentiella CSC markörer för magcancer. Av de åtta kandidatproteiner, var RBBP6 föreslagits vara en lovande prognos biomarkör och en terapeutiskt mål för magcancer

Citation. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Jämförande Proteomics Analys av Gastric cancerstamceller. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Redaktör: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama i Birmingham, USA

Mottagna: 3 maj 2014. Accepteras: 16 september 2014. Publicerad: 7 november 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet. Det författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter finns inom pappers- och dess stödinformationsfiler. numren för protein uppgifter ingår som UniProt /Swiss-Prot i tabell 2.

Finansiering: Denna studie är delvis finansierat av KAKENHI (Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning, nr 22.390.262, 23.390.329 och 26.293.307. ), av National Cancer Center Research och utvecklingsfonden (23-A-9), och prioritet Research Fund Osaka City University. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Cancer stamceller (CSCS) definieras som en unik subpopulation i tumörer som besitter förmågan att initiera tumörtillväxt och upprätthålla självförnyelse [1]. Har det föreslagits att de kan orsaka den heterogena linjen av cancerceller som utgör tumören såväl som spelar en viktig roll i den maligna progression av karcinom, såsom avlägsna metastaser, återfall, och chemoresistance [2] - [4]. CSCs identifierades initialt vid akut myeloisk leukemi [5], men har nyligen rapporterats att existera i en mängd olika cancerformer, inklusive magcancer [6]. Identifieringen av CSC markörer kan öppna en ny terapeutisk perspektiv på grundval av selektivt rikta denna lilla population av celler [7], [8]. Nyligen har det rapporterats att CSCs möjligen uttrycker sina egna unika markörer, såsom aldehyddehydrogenas en (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], och CD133 [12]. Men många av de publicerade markörer är inte unika för CSCs. Kvantitativ protein uttrycksprofilering möjliggör effektiv identifiering av noggranna och reproducerbara differentialuttrycksvärden för proteiner [13]. Isobar taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) i kombination med flerdimensionell vätskekromatografi (LC) och tandem masspektrometri (LC-MS /MS) analys framstår som en kraftfull metod i sökandet efter tumör biomarkörer [14]. Vi rapporterade tidigare att sido befolkning (SP) celler kan själv förnya och producera icke-SP-celler, och att cancerceller i SP fraktioner har hög potential för tumörbildning, fjärrmetastaser [3], och chemoresistance [2]. Detta tyder på att SP-celler av magcancer har cancer stamcellsliknande egenskaper. Därför är syftet med denna studie var att upptäcka en ny CSC markör (er) av magcancer genom att jämföra proteom bland moderceller och stamcellsliknande SP celler som har varit kända för att ha en rik CSC befolkningen [15].

Material och metoder

cellkulturer

Två gastric cancercellinjer, OCUM-2MD3 [16] och OCUM-12 [17], användes i denna studie. Dessa cellinjer härleddes från diffusa-typ magsäckscancer. Odlingsförhållande odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM; Nikken, Kyoto, Japan) med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicillin och streptomycin och 0,5 mM natriumpyruvat, och inkuberades vid 37 ° C. OCUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP cellinjer var SP-celler som utvärderades av en flödescytometrisk analys med användning av Hoechst 33342 från sina modercellinjer, OCUM-2MD3 och OCUM-12, respektive. Sortering utfördes tre gånger för att skapa en stabil population av SP-berikade celler. Efter en tre månaders inkubationsperiod efter sortering, OCUM-12 /SP-celler (6,5%) och OCUM-2MD3 /SP-celler (12,2%) utgjorde fortfarande en stor andel av SP-fraktionen, jämfört med moder OCUM-12 (3,2% ) och OCUM-2MD3 (6,3%) celler (Figur S1). Därefter dessa SP-anrikade celler med en stabil population var de cellinjer som används för analysen, som tidigare rapporterats [18].

mänskliga vävnadsprover och patientinformation

Vävnadsprover erhölls från 300 patienter diagnosen magcancer tillåtna verksamheten vid Osaka City University. Tabell 1 visar de clinicopathologic egenskaperna hos 300 magsäckscancerpatienterna. Det fanns 208 män och 92 kvinnliga patienter, med medianålder på 64 år (intervall 28-85 år) vid tidpunkten för operation. Diagnoserna bekräftades av minst två personer. Staging bestämdes i enlighet med den japanska klassificering av magcancer (14 ^{e upplagan) [19]. Studien godkändes av Osaka City University etikkommittén (Osaka, Japan). Skriftligt informerat samtycke från donatorn erhölls för användning av detta prov i forskning.}

Protein identifiering och kvantifiering av QSTAR Elite LC-MS /MS

cancerceller (60 ug vardera) homogeniserades och sedan lyseras med användning av antingen 100 mikroliter av T-PER lysbuffert (Thermo Scientific) eller 500 | il av 9 M urea, och 2% CHAPS lysbuffert med en proteashämmare. Därefter cellysatet behandlades sedan genom ultrasonikering. Efter acetonutfällning, var proteinkoncentrationer mättes genom BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Reduktion, alkylering, matsmältning, och efterföljande peptidmärkning av 50 | j, g protein för varje prov utfördes med användning av AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Kanada) [20]. De iTRAQ-märkta prover laddades på en ICAT katjonbytar patron (AB Sciex). Peptiderna eluerades som sex fraktioner (1 ml KCl-lösning av 10, 50, 70, 100, 200 och 350 mM), och supernatanten av varje indunstades i en vakuumcentrifug. Proven underkastades sedan avsaltades och koncentrerades med användning av Sep-Pak Ljus C18 patroner (Waters Corporation, Milford, MA), indunstades i en vakuumcentrifug, återsuspenderades i 20 mikroliter av 0,1% (v /v) myrsyra, och appliceras därefter på QSTAR Elite LC -MS /MS. Varje prov kördes i 150 minuter. MS /MS-data söktes mot den schweiziska proteindatabasen (HUMAN) med hjälp av ProteinPilot programvara (version 2.0, AB Sciex) med trypsin in som matsmältningen enzym och metyl methanethiosulfinate som cystein modifiering. För att ta bort redundanta hits och jämförande kvantifiering var sökresultaten erhållna bearbetas ytterligare av ProteinPilot programvara med hjälp av Paragon algoritm. Detta resulterade i minimal uppsättning försvar identifierade proteiner. Alla rapporterade data användes med 95% säkerhet cut-off gräns. Relativ kvantifiering av peptider beräknades som ett förhållande genom att dividera iTRAQ reporter intensitet. Förhållandena av peptider som stöder förekomsten av ett protein i genomsnitt för den relativa protein kvantifiering. Därefter var det ProteinPilot analys och uppfinningsrikedom väg analys (IPA) (Uppfinningsrikedom System, Mountain View, CA) utförs. Efter att ha utfört en enkel t-test på en av de beräknade genomsnittliga proteinförhållanden mot en att bedöma giltigheten av proteinuttryck förändringar var ett p-värde rapporteras. Proteinförhållanden med p-värde på mindre än 0,05 ansågs tillförlitliga. Det bör vara känt att i 90% av de iTRAQ experimentella körningar gjorda tidigare, standardavvikelserna för de proteinförhållanden, som härrör från tekniska variationer, rapporterades vara mindre än 0,3. Därför ändrar uttryck är större än 1,2 gånger eller mindre än 0,8 gånger av normaliserade uttrycksnivåer ansågs vara utom räckhåll för teknisk variabilitet. Vi utförde också en icke-märkt analys, och detekteras närvaron av proteiner endast inom OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler, men inte inom moderceller [21]. Varje prov kördes två gånger. Den tillämpade LC-MS /MS undersökning tillsammans med iTRAQ teknik har redovisats som en tillförlitlig kvantitativ metod för proteinuttryck, är ännu känsligare än den västra blot som beror på vilken typ av tillämpade antikroppar [22].

IPA och Val av kandidat proteiner

IPA databas används främst inom egen ontologi, som innehåller upp till 300.000 biologiska artiklar inklusive gener, proteiner, molekylära och cellulära processer. Därför var IPA användes för analys av proteinmolekyl funktioner, lokalisering. Dessutom var detaljerad information om funktioner och cellulära placeringen av de identifierade proteinerna som erhållits. Baserat på resultaten från LC MS /MS och IPA analyser, proteiner som observerades att vara överuttryckt i SP cellinjer, jämfört med sin motsvarande frekvens av uttryck i föräldra cellinjer, valdes som kandidat biomarkörer för SP-celler av magcancer. Identifieringen av nätverk av samverkande proteiner, samt funktionella grupper och vägar genererades av IPA, och analysen beror på de tidigare karakteriserade föreningar.

kvantitativ realtids omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR ) katalog

Gastric cancerceller odlades. Och totalt cellulärt RNA extraherades med användning av RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA framställdes från 2 | j, g RNA med användning av slumpmässiga primrar (Invitrogen). Att bestämma faldiga förändringar av varje gen, var RT-PCR utfördes på ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), med kommersiellt tillgänglig genuttryck analyser (Applied Biosystems) för RBBP6
( retinoblastom bindande protein 6
, Hs00544663), HSPA4
( värmechock 70kDa protein 4
, Hs00382884), HSPA9
( protein värmechock 70 kDa 9
, Hs00269818), GLG1
(Golgi glykoprotein 1, Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrofosfatas en
, Hs00225433), VPS13A
( vakuolär protein sortering 13 homolog A
, Hs00362891), CK18 (keratin 18
, Hs028277483), ALDOA (aldolas A
, Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) och NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) användes som en intern standard för att normalisera mRNA-nivåer. Tröskelcykeln (Ct) -värden användes för att beräkna de relativa uttrycksförhållandena mellan kontroll och behandlade celler.

Western blot-analys

Expression nivå av RBBP6 och ALDOA i cancerceller undersöktes enligt följande. Cellysat uppsamlades efter olika behandlingar. Efter proteinkoncentrationen i varje prov justerades ades elektrofores utfördes med användning av 10% Tris /Gly geler (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteinbanden som erhölls överfördes till ett Immobilon-P Transfer membran (Amersham, Aylesbury, UK). Sedan tillsattes membranet placerades i PBS-T-lösning innehållande anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), och anti-β-aktin (1:300 utspädning; sigma- Aldrich), och fick reagera vid rumstemperatur under 2 timmar. Nivåerna av specifika proteiner i varje lysat detekterades genom förstärkt kemiluminescens användning av ECL plus (Amersham) följt av autoradiografi.

små störande RNA Design

Sekvenserna för RBBP6
liten störande RNA (siRNA) är utformade på följande sätt: si RBBP6
känsla, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antisens, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', och nontargeting siRNA (negativ-siRNA) köptes från Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP-celler framställdes vid 60% sammanflytning i sex brunnar. Transfektionsblandningen framställdes genom tillsats 150 pl av Opti-MEM inklusive 9 mikroliter av Lipofectamine RNA Imax Regant (Life Technologies) till 150 mikroliter av Opti-MEM inklusive 90 pmol siRNA och inkubation under 5 min vid rumstemperatur. Slutligen, erhölls ovan transfektionsblandningen sattes till förberedda sex-brunnsskål. Tjugofyra timmar efter transfektion, utfördes RT-PCR utfördes.

sårläkande Assay

Cancerceller odlades i 96-brunnars plattor (Essen Instrument, Birmingham, UK). Efter det att cellerna nått halv konfluens, var ett sår skapades i cellmonoskiktet med 96 brunnar genom WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Repade fält togs bilden var 3 timmar och övervakades med Incucyte Live-cell imaging System och programvara (Essen Instruments). Graden av cellmigrationer analyserades 24 timmar efter sårbehandling som en procentandel av lindad konfluens. Medelvärdet av 4 fält beräknades som sampelvärdet.

Invasion Assay

Vi använde chemotaxicell kamrarna (Kubota, Osaka, Japan) med en 12-fim por-membranfilter belagt med 50- pg Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). Kammaren (övre komponenten) placerades i en 24-brunnars odlingsplatta (lägre komponent). Gastric cancerceller resuspenderades till en slutlig koncentration av 5 x 10 ^{3 celler /ml. Därefter 500 mikroliter lägre komponenter. Efter inkubation under 48 timmar tillsattes cancerceller på den övre ytan av membranet bort genom att torka och färgades med hematoxylin. Cancerceller som invaderade genom ett filter belagt med Matrigel in i den nedre membranet manuellt räknades under ett mikroskop med × 200 förstoring. Sex slumpmässigt utvalda fält räknades för varje analys. Medelvärdet av fyra fält beräknades som sampelvärdet. För varje grupp ades odlings gjordes i triplikat.}

Validering av Protein Expression av Immunohistokemi

Immunohistokemi utfördes på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsprover som avparaffinerades i xylen och dehydratiserades genom graderad etanol. Sektionerna värmdes under 10 minuter vid 105 ° C i autoklav i Target Retrieval Solution (Dako). Proven inkuberades därefter med 3% väteperoxid för att blockera endogen peroxidasaktivitet. Följande antikroppar användes i immunohistokemisk process: anti-RBBP6 (retinoblastom bindande protein 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glykoprotein 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (vakuolär protein sortering 13 homolog A, NBP1-85642, 1:500, Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolas A, fruktos-bisfosfat, HPA004177, 1:400, ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrofosfatas 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (värmechock 70 kDa-proteinet nio; HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (värmechock 70kDa protein 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), och anti-KRT18 (keratin 18, ab668, 1:500; Abcam). Proverna inkuberades med varje antikropp över natten vid cirka 4 ° C. Därefter togs prover inkuberades i disponeras immunoglobulin G i 10 minuter, följt av tre tvättningar med PBS. Alla prov behandlades sedan med streptavidin-peroxidas-reagens och inkuberades i PBS diaminobensidin och 1% väteperoxid (vol /vol), följt av motfärgning med Mayers hematoxylin.

Immunohistokemisk utvärdering

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA och KRT18 expressionsnivåer utvärderades både intensitet färgning och andelen färgade tumörceller. Färgningsintensiteten poängsattes på en skala från 0-3 (0 = nej, 1 = mild, 2 = måttlig, 3 = intensiv). Färgning proportioner poängsattes på en skala från 0-4 (procentandelen var olika med varje antikropp) baserad på den procentandel av positivt färgade celler. Därför skulle det slutliga färgning poäng, som beräknades som en multipel av färgningsintensitetspoäng och färgnings andel poäng, vara på en skala från 0-12. Uttrycksnivåer av DCTPP1 ansågs positivt när det fick en poäng på 3. expressionsnivåer av HSPA4 ansågs positivt när det fick en poäng av 6. expressionsnivåer av ALDOA, KRT18, VPS13A och GLG1 ansågs positivt när varje fick en poäng 8. RBBP6, utvärdering av vilka endast färgnings andel poängen användes för beräkning, ansågs positivt när det fick en poäng på 3. HSPA9, utvärdering av vilka endast färgningsintensitetspoäng användes för beräkning, ansågs positivt när det fick en poäng på 3. Alla utvärderingar gjordes av två observatörer som var ovetande om kliniska data och utfall. När en avvikande bedömning mellan de två oberoende observatörer konstaterades, var bilderna kontrolleras på nytt och omvärderas efter diskussion.

Statistisk analys

SPSS programmet (SPSS Japan, Tokyo, Japan) användes för dataanalys. Statistisk signifikans av sambandet mellan uttrycket av proteiner och de olika kliniskt patologiska variabler, inklusive ålder, kön, makroskopiska typ, tumör differentiering, totalt antal opererande lymfkörtel, och typ av kirurgi (D1 och D2 gastrektomi) utvärderades med användning av Fishers och Chi -squared tester. Överlevnadskurvorna beräknades från operationsdagen till tidpunkten för dödsfallet eller den sista uppföljningen observation med hjälp av Kaplan-Meier-metoden. Dessutom var några skillnader mellan överlevnadskurvorna bedömas med hjälp av log-rank test. Multivariata analyser genomfördes enligt Cox regressionsmodell för att bestämma sambanden mellan kliniskt patologiska variabler och dödlighet. P-värden på < 0,05 ansågs statistiskt signifikant

Resultat

Den stemness av magcancer cellinjer

De procentsatser av SP-celler var högre i OCUM-12. /SP och OCUM-2MD3 /SP-celler än i föräldrarnas OCUM-12 och OCUM-2MD3 celler (Figur S1). Cancer stamcellsmarkörer för SP-celler, OCUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP, såsom CD44, CD133, och NANOG, analyserades med RT-PCR. Uttrycket nivån på dessa markörer ökade signifikant i båda SP cellinjer, i jämförelse med modercellinjer (Figur S2). Antalet sfäroid koloni var betydligt högre i både OCUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP celler än moder OCUM-12 och OCUM-2MD3 celler (data visas ej).

Upptäckt av kandidat Proteiner

Vi undersökte huruvida proteiner differentiellt eller oberoende uttrycktes i SP-celler, och jämfört våra resultat med de av sina moderceller använder QSTAR Elite LC-MS /MS. Vid analys av biologiska processer, och med 95% säkerhet cut-off gräns och p < 0,05, identifierade vi att proteiner verkligen differentiellt uttrycktes. Resultaten av dessa resultat presenteras i figur 1. De flesta av proteinerna överuttrycks i cytoplasman av tumörceller (Figur 1A). P-värdet som ingår i den uppfinningsrikedom analysen anges i tabell S1. Dessa proteiner bestämdes vara relaterade till cellulära processer, såsom celldöd, metabolism, cellulär organisation, DNA-metabolism, proteinnedbrytning, och bearbetning av RNA (Figur 1B). De översta kanoniska mönstren som är associerade med dessa mål och identifierade av IPA visas i tabell S2.

Vid jämförelse med deras motsvarande moderceller, 40 proteinerna var uppreglerat i OCUM-12 /SP och 35 proteinerna var upp -regulated i OCUM-2MD3 /SP. Bland dessa proteiner, åtta var uppreglerade i båda OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler, medan ingen sådan association observerades mellan deras motsvarande moderceller (tabell 2 och figur 1C). Av dessa åtta proteiner, de tre proteiner, RBBP6, GLG1 och VPS13A, oberoende detekterades i båda SP cellinjer, men inte i deras motsvarande moderceller. De fem proteiner, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA och KRT18, var betydligt överuttryckt av åtminstone 1,2 gånger i både SP-celler jämfört med motsvarande moderceller.

mRNA expressionsnivån av dessa 8 kandidatmolekyler, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
och CK18
ökades i OCUM-12 /SP (9,15 gånger, 9,36 gånger, 4,14 gånger, 7,80 gånger 2,08 gånger, 1,46 gånger, 3,44 gånger och 1,99 gånger respektive) och OCUM-2MD3 /SP (6,15 gånger, 1,71 gånger, 2,33 gånger, 2,30 gånger, 2,03 gånger, 1,32 gånger, 1,35 gånger och 1,31 gånger, respektive) celler, i jämförelse med de för kontroll av överordnade OCUM-12 och OCUM-2MD3 celler (figur 1D). Western blot-analys indikerade att expressionsnivån av RBBP6 och ALDOA var hög i CUM-12 /SP och OCUM-2MD3 /SP-celler, i jämförelse med att OCUM-12 och OCUM-2MD3 celler (Figur S3).

nätverket presenteras i figur 1E genererades av IPA, och analysen beror på de tidigare karakteriserade och rapporterade proteininteraktioner. Således RBBP6, vilket observerades vara överuttryckt i CSC-liknande SP celler, OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler, var direkt relaterad till HSPA4 och Rb, och indirekt i samband med Hsp90 och TAGLN2. HSPA4, Hsp90 och TAGLN2 befanns också vara uppreglerad i CSC-liknande SP celler.

Effekt av siRBBP6 transfektion på migration och invasiva förmåga gastric cancerceller

Figur 2A visar att si RBBP6
transfektion minskade signifikant mRNA-uttryck nivå av både SP cellinjer (OCUM-12 /SP var 12%, p < 0,01, var OCUM-2MD3 /SP 2,5% p. < 0,01), i jämförelse med det negativa-siRNA transfektion. RBBP6
siRNA knockdown minskade signifikant invasion (figur 2B) och migration aktivitet (Figur 2C) av både SP celler.

Immunohistokemisk Bedömning av kandidat Proteiner och deras Association med kliniskt patologiska funktioner

RBBP6, DCTPP1 och HSPA9 observerades i första hand uttrycks i cytoplasman och kärnorna i gastric cancerceller. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA och KRT18 observerades att i första hand uttrycks i cytoplasman (figur 3A). I normala epitelceller, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 och HSPA9 uttryck befanns vissa celler i epiteliala körteln. KRT18 uttrycktes i de flesta epitelceller. HSPA4 och ALDOA uttryck hittades inte i normala celler. BBP6, DCTPP1 och HSPA9 uttrycktes i cytoplasman och kärnorna i normala epitelceller. GLG1, VPS13A, HSPA9 och KRT18 observerades i cytoplasman av epitelceller (Figur 3B).

Vi utforskade association mellan uttrycksnivån av de åtta kandidatproteiner och kliniskt patologiska funktioner. Antal ärenden till varje poäng för de åtta mål visades i tabell S3. Dessa åtta proteiner bestämdes att förknippas med potentiellt elakartade processer, såsom fjärrmetastaser, lymfkörtel (LN) metastas, invasion djup, eller scen avancemang (tabell 3). De beräknade p-värdena var följande: RBBP6 var signifikant associerade med invasion djup (p < 0,001), LN metastas (p < 0,001), avlägsen metastas (p = 0,013), och kliniska stadiet (p < 0,001); GLG1 signifikant associerad med endast fjärrmetastaser (p = 0,045). VPS13A var signifikant associerad med invasion djup (p = 0,005), LN metastaser (p < 0,001), och steget avancemang (p = 0,005); DCTPP1 var signifikant associerad med invasion djup (p < 0,001), LN metastaser (p < 0,001), fjärrmetastaser (p < 0,001), och steget avancemang (p < 0,001); HSPA9 var signifikant associerad med invasion djup (p < 0,001), LN metastaser (p < 0,001), och steget avancemang (p < 0,001); HSPA4 var signifikant associerad med invasion djup (p < 0,001), LN metastaser (p < 0,001), fjärrmetastaser (p = 0,007), och steget avancemang (p < 0,001); ALDOA var signifikant associerad med invasion djup (p = 0,034), LN metastaser (p = 0,004), och steget avancemang (p = 0,029); och KRT18 var signifikant associerad med invasion djup (p = 0,001), LN metastaser (p = 0,001), fjärrmetastaser (p = 0,034), och steget avancemang (p = 0,004).

Prognos

Kaplan-Meier kurvor föreslog att av de åtta över uttryckta proteinerna, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 och ALDOA, var signifikant associerade med dålig överlevnad hos alla patienter (Figur 4). Den kumulativa femårs totala överlevnaden av RBBP6-positiva fallen (61%) var signifikant lägre (p = 0,002) än den för RBBP6-negativa fallen (78%). Dessutom hos patienter med stadium III, den totala överlevnaden hos RBBP6-positiva fall var betydligt mindre (p = 0,034) än för RBBP6 negativa fall. Prognosen för patienter med DCTPP1-positiva tumörer (63%) var signifikant sämre (p = 0,016) än den för DCTPP1 negativa tumörer (75%). Femårs totala överlevnaden av HSPA4-positiva fallen (66%) var signifikant lägre (p = 0,047) än den för HSPA4-negativa fallen (75%). Den femåriga totala överlevnaden av ALDOA-positiva tumörer uppvisar överuttryck (61%) var signifikant sämre (p = 0,043) än för ALDOA-negativa tumörer (72%). Däremot fanns inga signifikanta korrelationer observeras mellan andra proteiner och patientöverlevnad. Efter univariat analys var RBBP6, DCTPP1, HSPA4 och ALDOA expressionsnivåer signifikant associerade med dålig prognos i 300 gastric cancerpatienter (tabell 4). Dessutom makroskopisk typ (typ 4), histologiska typ (diffus), T kategori (T2-4), fartyg invasion, infiltration mönster (INF b, c), peritoneal metastas, och LN metastaser var fast beslutna att vara signifikant associerade med en dålig prognos. Multivariat analys utfördes med användning av Cox Proportional Hazards Modell för alla signifikanta variabler i univariata analysen. Vid analys fullbordan RBBP6 uttryck (p = 0,023), Borrmann typ 4 (p < 0,001), bukhinnan positivt (p = 0,001), LN metastas (p = 0,003), och levermetastaser (p = 0,001) bekräftades som oberoende faktorer korrelerat med överlevnaden (tabell 3). Av de åtta proteiner RBBP6 uttryck var en oberoende prognostisk faktor.

Diskussion

magcancer resulterar i en dålig prognos på grund av täta metastatiska processer, såsom LN metastaser och peritoneal metastas [23]. CSCs har föreslagits som att ha en viktig roll i malign potential av cancerceller, inklusive avlägsna metastaser och chemoresistance [fyra]. Vi har sedan upptäckt att SP-celler erhållna från magcancer patienter har dessa CSC egenskaper [3]. Vi bekräftade att SP celler som används i denna studie express kandidat magcancer stamcellsmarkörer inklusive CD44 [24], CD133 [25], och NANOG [26] (Figur S2). Den sfäroid kolonibildning aktiviteten hos dessa SP-celler var högre än den hos moderceller [18]. Även dessa CSC-liknande SP celler uppvisar chemoresistance att anticancerläkemedel [2]. Dessa upptäckter har bekräftat att OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler kan representera cancerstamcellsliknande egenskaper. Eftersom specifika markörer för gastric CSCs inte har publicerats i nuläget kan klarlägga de specifika signalvägar och mekanismer som ligger bakom de åtgärder CSCs förbättra prognosen för magcancer. I denna studie har åtta kandidat CSCS markörer identifieras genom proteomik tekniker med användning av LC-MS /MS i kombination med iTRAQ teknik. Tre proteiner, RBBP6, GLG1 och VPS13A, upptäcktes endast i SP cellinjer men inte i sina respektive modercellinjer. Dessutom är de fem proteiner, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4 och KRT18, var överuttryckt i båda SP cellinjer i förhållande till sina respektive modercellinjer. RT-PCR-analys visade också att uttrycksnivån för RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
och CK18
var hög i OCUM-12 /SP och OCUM- 2MD3 /SP, i jämförelse med kontrollen av överordnade OCUM-12 och OCUM-2MD3. Dessa proteiner misstänktes vara nya biomarkörer för gastriska CSCs. Denna hypotes testades genom immunohistokemisk analys av 300 gastric cancerfall.

RBBP6 är ett nukleärt protein, vilket är en känd för att vara associerade och potentiellt relaterade till p53 och retinoblastom bindande Q protein 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interagerar med tumörhämmande proteiner p53 och Rb, och spelar en roll i induktion av apoptos liksom reglering av cellcykeln [28], [29]. RBBP6 binder till vildtyp p53-proteiner men inte till p53-mutanter [30]. Det har också visat sig främja bindningen av MDM2 [31], en E3 ubiquitin ligas som riktar sig mot p53 [32], och att störa dess förmåga att transaktivera målgener [33]. Uppreglering av RBBP6 har varit starkt korrelerad med tumörprogression i matstrupscancer och livmoderhalscancer [32]. I denna studie var RBBP6 uttryck i samband med "T" kategori cancer när det gäller invasionen djup, fjärrmetastaser, lymfkörtel metastas, och kliniska stadiet. Dessutom var RBBP6 uttryck signifikant associerade med dålig överlevnad hos patienter i alla skeden, i synnerhet vid stadium III, vilket resulterar i slutsatsen att RBBP6 var en oberoende faktor för överlevnad. Vi utförde RBBP6
siRNA knockdown av RBBP6
gen med hjälp OCUM-12 /SP-celler och OCUM-2MD3 /SP-celler i denna studie.

• PLOS ONE: Photoimmunotherapy för magcancer Peritoneal karcinomatos i en musmodell
• PLOS Genetics: nedärvda mutationer i MAP3K6 är associerade med Familial Gastric Cancer