PLoS ONE: Vergleichende Proteomanalyse von Magenkrebsstammzellen

Abstrakt

Krebsstammzellen (KSZ) sind verantwortlich für die Progression von Krebs, Metastasen und Rezidiv. Bis heute bleiben die spezifische Marker von CSCs unentdeckt. Das Ziel dieser Studie war es, neue Biomarker für Magen-CSCs für die klinische Diagnostik mit Hilfe der Proteomik-Technologie zu identifizieren. CSC-like SP-Zellen, OCUM-12 /SP-Zellen, OCUM-2MD3 /SP-Zellen und ihre Mutter OCUM-12-Zellen und OCUM-2MD3 Zellen wurden in dieser Studie verwendet. Proteinlysaten aus jeder Zelllinie wurden für relative und absolute Quantifizierung Technologie QSTAR Elite Liquid Chromatography mit Tandem-Massenspektrometrie, gepaart mit isobar-Tags analysiert. Kandidatenproteine ​​von Proteomik-Technologie nachgewiesen wurden durch immunhistochemische Analyse von 300 Magenkrebs validiert. Basierend auf den Ergebnissen der LC-MS /MS, acht Proteine, einschließlich RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA und KRT18, waren hochreguliert in beiden OCUM-12 /SP-Zellen und OCUM-2MD3 /SP Zellen, wenn sie in ihre entsprechenden Elternzellen verglichen. RT-PCR-Analyse zeigte, dass das Expressionsniveau von RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
und CK18
war hoch in OCUM-12 /SP und OCUM-2MD3 in /SP, mit der Steuerung des übergeordneten OCUM-12 verglichen und OCUM-2MD3. Diese Proteine ​​waren signifikant mit fortgeschrittenen Invasionstiefe, Lymphknotenmetastasen, Fernmetastasen oder der fortgeschrittenen klinischen Phase verbunden. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 und ALDOA Ausdruck insbesondere waren signifikant mit einer schlechten Prognose bei den 300 Patienten mit Magenkrebs in Verbindung gebracht. RBBP6 wurde festgestellt, ein unabhängiger prognostischer Faktor. Die Motilität stimulierende Fähigkeit von OCUM-12 /SP-Zellen und OCUM-2MD3 /SP-Zellen wurde durch RBBP6
siRNA gehemmt. Diese Ergebnisse könnte darauf hindeuten, dass die acht Proteine, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA und KRT18, unter Verwendung von vergleichenden Proteomanalyse, wahrgenommen wurden potenzielle CSC-Marker von Magenkrebs. Von den acht Kandidatenproteine ​​wurde RBBP6 vorgeschlagen für Magenkrebs ein vielversprechender prognostischer Biomarker und ein therapeutisches Ziel sein

Citation. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Vergleichende Proteomanalyse von Magenkrebsstammzellen. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Editor: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama in Birmingham, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 3. Mai 2014; Akzeptiert: 16. September 2014; Veröffentlicht: 7. November 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien. Zugangsnummern für die Proteindaten werden als UniProt /Swiss-Prot in Tabelle 2 enthalten

Finanzierung:. Diese Studie teilweise durch KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research, Nr 22390262, 23390329 und 26293307 finanziert ), von der National Cancer Center Forschungs- und Entwicklungsfonds (23-A-9) und von Priority Research Fund von Osaka City University. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Krebsstammzellen (KSZ) als einzigartige Subpopulation in Tumoren definiert, die die Fähigkeit besitzen, das Tumorwachstum zu initiieren und Selbsterneuerung unterstützen [1]. Es wurde vorgeschlagen, dass sie die heterogene Linie von Krebszellen führen kann, die den Tumor als auch spielen eine wichtige Rolle bei der malignen Progression von Karzinomen, wie Fernmetastasen, Wiederholung und Chemoresistenz darstellen [2] - [4]. KSZ wurden zunächst in akuter myeloischer Leukämie [5] identifiziert, aber vor kurzem in einer Vielzahl von Krebsarten existieren, einschließlich Magenkrebs berichtet worden [6]. Die Identifizierung von CSC Marker können öffnen Sie eine neue therapeutische Perspektive auf der Basis von selektiv diese kleine Population von Zellen Targeting [7], [8]. Vor kurzem wurde berichtet, dass CSCs möglicherweise ihre eigene einzigartige Marker exprimieren, wie Aldehyd-Dehydrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11] und CD133 [12]. Jedoch sind viele der veröffentlichten Marker nicht eindeutig CSCs. Quantitative Proteinexpressionsprofilen ermöglicht die effiziente Identifizierung von genauen und reproduzierbaren differentielle Expressionswerte für Proteine ​​[13]. Isobaric Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) in Kombination mit multidimensionalen Flüssigchromatographie (LC) und Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS /MS) Analyse zeichnet sich als eine leistungsfähige Methode bei der Suche nach Tumor-Biomarker [14]. Wir bereits berichtet, dass die Seitenpopulation (SP) Zellen in der Lage sind, selbst zu erneuern und nicht-SP-Zellen produzieren, und dass Krebszellen in SP-Fraktionen besitzen großes Potenzial für tumorigenicity, Fernmetastasen [3], und Chemoresistenz [2]. Dies deutet darauf hin, dass SP-Zellen von Magenkrebs besitzen Krebsstammzellen ähnlichen Eigenschaften. Daher war das Ziel dieser Studie, eine neue CSC Marker (n) von Magenkrebs zu erfassen, indem die Proteome unter Elternzellen verglichen und Stammzellähnlichen SP-Zellen, die eine reiche CSC Bevölkerung zu besitzen [15] bekannt sind.

Materialien und Methoden

Zellkulturen

Zwei Magenkrebszelllinien, OCUM-2MD3 [16] und OCUM-12 [17], die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Zelllinien wurden aus diffusen Typ Magenkrebs abgeleitet. (; Nikken, Kyoto, Japan DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum Die Kulturbedingungen wurde in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium kultiviert (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), Penicillin und Streptomycin und 0,5 mM Natriumpyruvat, und bei 37 ° C inkubiert. OCUM-12 /SP und OCUM-2MD3 /SP Zelllinien wurden SP-Zellen, die durch eine durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung von Hoechst 33342 von ihren Mutterzelllinien wurden bewertet, OCUM-2MD3 und OCUM-12. wurde Sortierung dreimal durchgeführt, eine stabile Population von SP-angereicherten Zellen zu etablieren. Nach einer dreimonatigen Inkubationsdauer Postsortierung, OCUM-12 /SP-Zellen (6,5%) und OCUM-2MD3 /SP-Zellen (12,2%) repräsentiert noch einen hohen Prozentsatz der SP-Fraktion im Vergleich zur Mutter OCUM-12 (3,2% ) und OCUM-2MD3 (6,3%) Zellen (S1). Anschließend werden diese SP-angereicherten Zellen mit einer stabilen Population die Zelllinien für die Analyse verwendet wurden, wie bereits berichtet [18].

Humangewebeproben und Patienteninformation

Die Gewebeproben wurden erhalten aus 300 Patienten mit Magenkrebs zugelassen Operationen an der Osaka City University diagnostiziert. Tabelle 1 zeigt die klinisch-pathologische Merkmale der 300 Patienten mit Magenkrebs. Es wurden 208 männliche und 92 weibliche Patienten, mit dem Durchschnittsalter von 64 Jahren (Bereich 28-85 Jahre) zum Zeitpunkt der Operation. Die Diagnosen wurden durch mindestens zwei Personen bestätigt. Staging wurde in Übereinstimmung mit der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom (14 ^{th edition) [19] bestimmt. Diese Studie wurde von der Osaka City University Ethikkommission (Osaka, Japan) genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung von dem Spender für die Verwendung dieser Probe in der Forschung erhalten.}

Protein Identifizierung und Quantifizierung von QSTAR Elite LC-MS /MS

Die Krebszellen (60 &mgr; g pro Stück) wurden homogenisiert und dann lysiert, unter Verwendung von entweder 100 &mgr; l von T-PER Lysepuffer (Thermo Scientific) oder 500 &mgr; l 9 M Harnstoff und 2% CHAPS Lysepuffer mit einem Protease-Inhibitor. Anschließend wurde das Zellysat dann durch Ultraschallbehandlung behandelt. Nach Acetonfällung wurden Proteinkonzentrationen von BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA) gemessen. Reduktion, Alkylierung, Verdauung und anschließende Peptid Markierung von 50 ug Protein für jede Probe wurden unter Verwendung des AB Sciex iTRAQ Reagenz Multi-Plex-Kit (AB Sciex, Concord, ON, Kanada) durchgeführt [20]. Die iTRAQ-markierten Proben wurden auf eine ICAT Kationenaustauschkartusche (AB Sciex) geladen. Die Peptide wurden sechs Fraktionen (1 ml KCL-Lösung von 10, 50, 70, 100, 200 und 350 mM) eluiert, und der Überstand von jedem wurde in einer Vakuumzentrifuge eingedampft. Proben wurden dann entsalzt und konzentriert, unter Verwendung von Sep-Pak-Licht C18 Patronen (Waters Corporation, Milford, MA), in einer Vakuumzentrifuge eingedampft, in 20 ul 0,1% (v /v) Ameisensäure resuspendiert und anschließend auf QSTAR Elite LC angewendet -MS /MS. Jede Probe wurde 150 Minuten lang laufen. MS /MS-Daten wurden gegenüber dem Schweizer Protein-Datenbank gesucht (Human) mit ProteinPilot Software (Version 2.0, AB Sciex) mit Trypsin eingestellt, wie die Verdauung Enzym und Methyl methanethiosulfinate als Cystein-Modifikation. Um erhalten redundante Hits und vergleichende Quantifizierung, die Suchergebnisse wurden durch ProteinPilot Software mit dem Paragon-Algorithmus verarbeitet zu entfernen. Dies führte in der minimalen Menge von vertretbarem identifizierten Proteine. Alle gemeldeten Daten wurde mit einer 95% cut-off Grenze eingesetzt. Relative Quantifizierung von Peptiden wurde als ein Verhältnis berechnet, indem die iTRAQ reporter Intensität geteilt wird. Die Verhältnisse von Peptiden, die die Existenz eines Proteins unterstützt wurden für die relative Proteinquantifizierung gemittelt. Danach wurden die ProteinPilot Analyse und Ingenuity Pathway-Analyse (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA) durchgeführt. Nach der Durchführung war ein einfacher t-Test auf einer der berechneten gemittelten Protein-Verhältnisse gegen 1 die Gültigkeit der Proteinexpression Veränderungen zu bewerten, ein p-Wert angegeben. Protein-Verhältnisse mit einem p-Wert von weniger als 0,05 wurden als zuverlässig angesehen. Es sollte bekannt sein, dass in 90% der iTRAQ zuvor getan Versuchsdurchläufe, die Standardabweichungen der Protein-Verhältnisse, die sich aus technischen Varianten stammen, weniger zu sein gemeldet wurden als 0,3. Daher ändert sich die Expression von mehr als 1,2-fach oder weniger als das 0,8-fache der normalisierten Expressionsniveaus angesehen wurden außerhalb des Bereichs der technischen Variabilität zu sein. Wir führten auch ein nicht-markiertes Analyse und detektiert das Vorhandensein von Proteinen nur innerhalb OCUM-12 /SP-Zellen und OCUM-2MD3 /SP-Zellen, aber nicht in Elternzellen [21]. Jede Probe wurde zweimal ausgeführt. Die aufgebrachte LC-MS /MS Untersuchung gekoppelt mit iTRAQ Technologie haben als zuverlässige quantitative Verfahren für die Proteinexpression, wobei sogar noch empfindlicher als der Western-Blot, die von der Art der angewandten Antikörpern abhängt [22] berichtet.

IPA und Auswahl von Kandidatenproteinen

die IPA-Datenbank wird im Bereich der proprietären Ontologie, die bis zu 300.000 biologischen Gegenstände, einschließlich Gene, Proteine, molekulare und zelluläre Prozesse eingesetzt. Daher IPA wurde zur Analyse von Protein-Molekular Funktionen, Lokalisierung verwendet. Zusätzlich in Bezug auf Informationen, die Funktionen und zellulären Positionen der identifizierten Proteine ​​wurden erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der LC MS /MS und IPA Analysen, Proteine, die beobachtet wurden, im SP-Zelllinien überexprimiert sind, wenn sie auf ihre entsprechenden Häufigkeit der Expression in parentalen Zelllinien verglichen wurden als Biomarker-Kandidaten für SP-Zellen ausgewählt von Magenkrebs. Die Identifizierung der Netzwerke von Proteinen interagieren, sowie funktionelle Gruppen und Pfaden durch IPA erzeugt, und die Analyse ist abhängig von den zuvor charakterisierten Assoziationen.

Quantitative Echtzeit-Reverse-Transcription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR
)

Magenkrebs-Zellen wurden kultiviert. Und die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung von RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA) extrahiert. cDNA wurde aus 2 ug RNA unter Verwendung von Zufallsprimern (Invitrogen) hergestellt. Um zu bestimmen, Fold Change in jedem Gen, RT-PCR wurde auf dem ABI Prism 7000 durchgeführt (Applied Biosystems, Foster City, CA), mit handelsüblichen Genexpressionsassays (Applied Biosystems) für RBBP6
( Retinoblastom-bindendes Protein 6
; Hs00544663), HSPA4
( Hitzeschock-Protein 70kDa 4
; Hs00382884), HSPA9
( Hitzeschock-70 kDa-Protein 9
; Hs00269818), GLG1
(Golgi-Glycoprotein 1; Hs00939452), DCTPP1
( dCTP Pyrophosphatase 1

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy von Magenkrebs Peritonealkarzinose in einer Maus Model
• PLoS Genetics: Keimbahnmutationen in MAP3K6 sind mit Familial Magenkrebs assoziiert