PLoS ONE: Vergelijkende Proteomics Analyse van maagkanker Stem Cells

Abstract

Kanker stamcellen (CSC) zijn verantwoordelijk voor de progressie van kanker, metastase en herhaling. Tot op heden zijn de specifieke markers van CSCs blijven onontdekt. Het doel van deze studie was om nieuwe biomarkers maag- CSCs identificeren klinische diagnose met behulp proteomicstechnologie. CSC SP-achtige cellen, OCUM-12 /SP cellen OCUM-2MD3 /SP cellen en hun ouder OCUM-12 cellen en OCUM 2MD3-cellen werden gebruikt in deze studie. Eiwitlysaten van elke cellijn werden geanalyseerd met behulp QStar Elite vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie in combinatie met isobaar tags voor relatieve en absolute kwantificatie technologie. Kandidaat-eiwitten gedetecteerd door proteomics technologie werden gevalideerd door immunohistochemische analyse van 300 maagkanker. Op basis van de resultaten van LC-MS /MS, acht eiwitten, waaronder RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA en KRT18 waren opgereguleerd in zowel OCUM-12 /SP cellen en OCUM-2MD3 /SP cellen in vergelijking met hun overeenkomstige bovenliggende cellen. RT-PCR-analyse gaf aan dat de expressie van RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
en CK18
was hoog in OCUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP, in vergelijking met de controle van de ouder OCUM-12 en OCUM-2MD3. Deze eiwitten waren significant geassocieerd met geavanceerde invasie diepte, lymfeklieren metastase, metastasen op afstand, of geavanceerde klinische fase. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 en ALDOA expressie met name significant geassocieerd met een slechte prognose in het 300 maagkankerpatiënten. RBBP6 was vastbesloten om een ​​onafhankelijke prognostische factor zijn. De motiliteit stimulerende vermogen van OCUM-12 /SP-cellen en OCUM 2MD3 /SP-cellen werd geremd door RBBP6
siRNA. Deze bevindingen zou kunnen suggereren dat de acht eiwitten, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA en KRT18, gebruik te maken van vergelijkende proteomics analyse werden gezien als potentiële CSC markers van maagkanker zijn. Van de acht kandidaat-eiwitten, werd RBBP6 voorgesteld om een ​​veelbelovende prognostische biomarker en een therapeutisch doel voor maagkanker zijn

Visum:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Vergelijkende Proteomics Analyse van maagkanker Stem Cells. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Editor: Anita B. Hjelmeland, Universiteit van Alabama in Birmingham, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 3 mei 2014; Aanvaard: 16 september 2014; Gepubliceerd: 7 november 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden. nummers voor de toetreding van eiwit gegevens worden opgenomen als UniProt /Swiss-Prot in Tabel 2.

Financiering: Deze studie is gedeeltelijk gefinancierd door KAKENHI (Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek, de nummers 22390262, 23390329 en 26293307. ), door het National Cancer Center Research en Development Fund (23-A-9), en door Priority Research Fund van Osaka City University. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Kanker stamcellen (CSC) worden gedefinieerd als unieke subpopulatie in tumoren die het vermogen om tumorgroei gang brengen en [1] zelfvernieuwing hebben. Er is voorgesteld dat de heterogene geslacht van kankercellen de tumor vormen kan veroorzaken en speelt een belangrijke rol bij de maligne progressie van carcinoom, zoals metastasen op afstand, herhaling en chemoresistance [2] - [4]. CSCs werden aanvankelijk geïdentificeerd bij acute myeloïde leukemie [5], maar zijn onlangs gemeld dat er in een grote verscheidenheid van kankers, waaronder maagkanker [6]. De identificatie van markers CSC kan een nieuw therapeutisch perspectief openen op basis van selectief aan de kleine populatie van cellen [7], [8]. Recent is gerapporteerd dat CSCs eventueel expressie brengen hun eigen unieke merkers, zoals aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], en CD133 [12]. Veel van de gepubliceerde markers niet uniek voor CSCs. Kwantitatieve eiwitexpressie profielen maakt een efficiënte identificatie van nauwkeurige en reproduceerbare differentiële expressie waarden voor eiwitten [13]. Isobaric tags voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ) in combinatie met multidimensionale vloeistofchromatografie (LC) en de tandem massaspectrometrie (LC-MS /MS) analyse is in opkomst als een krachtige methode in de zoektocht naar tumor biomarkers [14]. We hebben eerder gemeld dat de side population (SP) cellen in staat zijn om te hernieuwen en produceren niet-SP-cellen, en dat kankercellen in SP fracties bezitten een groot potentieel carcinogeen, metastasen [3] en chemoresistance [2]. Dit suggereert dat SP cellen van maagkanker bezitten kanker stamcelachtige eigenschappen. Daarom was het doel van deze studie om een ​​nieuwe CSC marker (s) van maagkanker te detecteren door het vergelijken van de Proteoomwijde tussen ouder cellen en stamcel-achtige SP cellen die bekend zijn om een ​​rijke CSC bevolking [15] bezitten.

Materialen en Werkwijzen

celkweken

Twee maagkanker cellijnen OCUM-2MD3 [16] en OCUM-12 [17] werden gebruikt in deze studie. Deze cellijnen waren afkomstig van diffuse type maagkanker. De kweekomstandigheid werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM; Nikken, Kyoto, Japan) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilline en streptomycine en 0,5 mM natriumpyruvaat, en geïncubeerd bij 37 ° C. OCUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP SP cellijnen waren cellen die werden geëvalueerd door flowcytometrische analyse onder toepassing van Hoechst 33342 uit hun oudercel lijnen OCUM-2MD3 en OCUM-12, respectievelijk. Sortering werd driemaal uitgevoerd om een ​​stabiele populatie van SP verrijkte cellen vastgesteld. Na drie maanden incubatieperiode na sortering, OCUM-12 /SP cellen (6,5%) en OCUM-2MD3 /SP-cellen (12,2%) vertegenwoordigde nog een hoog percentage van de SP fractie in vergelijking met ouder OCUM-12 (3,2% ) en OCUM-2MD3 (6,3%) cellen (figuur S1). Hierdoor vertoont de SP-verrijkte cellen met een stabiele populatie waren de cellijnen gebruikt bij de analyse, zoals eerder beschreven [18].

Human Tissue Monsters en patiëntgegevens

weefselmonsters werden verkregen van 300 patiënten met maagkanker toegestane handelingen in Osaka City University. Tabel 1 toont de kenmerken van de clinicopathologic 300 maagkankerpatiënten. Er waren 208 mannelijke en 92 vrouwelijke patiënten met de gemiddelde leeftijd van 64 jaar (bereik 28-85 jaar) en werkingstijd. De diagnoses werden bevestigd door ten minste twee personen. Staging werd bepaald volgens de Japanse indeling van maagcarcinoom (14 ^{e editie) [19]. Deze studie werd goedgekeurd door de Osaka City University ethische commissie (Osaka, Japan). Schriftelijke geïnformeerde toestemming van de donor werd verkregen voor het gebruik van dit monster in onderzoek.}

Eiwit identificatie en kwantificatie van QStar Elite LC-MS /MS

De kankercellen (60 ug elk) waren gehomogeniseerd en vervolgens gelyseerd met behulp van 100 ul van T-pER lysisbuffer (Thermo Scientific) of 500 ul van 9 M ureum, 2% CHAPS en lysisbuffer met een proteaseremmer. Vervolgens werd het cellysaat vervolgens behandeld met ultrasone trillingen. Na acetonprecipitatie werden eiwitconcentraties bepaald door BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Reductie, alkylering, digestie en daaropvolgende peptide labeling van 50 ug eiwit per monster werden uitgevoerd met de AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. De iTRAQ-gelabelde monsters werden geladen op een ICCAT kationenuitwisseling cartridge (AB Sciex). De peptiden werden geëlueerd zes fracties (1 ml KCL oplossing van 10, 50, 70, 100, 200 en 350 mM), en de supernatant van elk werd in een vacuümcentrifuge ingedampt. De monsters werden vervolgens ontzout en geconcentreerd met gebruik van Sep-Pak Light C18 cartridges (Waters Corporation, Milford, MA), in vacuüm centrifuge verdampt, opnieuw gesuspendeerd in 20 pl 0,1% (v /v) mierenzuur, en vervolgens op QStar Elite LC toegepast -MS /MS. Elk monster werd gedurende 150 minuten. MS /MS-gegevens werd doorzocht tegen de Zwitserse Protein database (HUMAN) met behulp van ProteinPilot software (versie 2.0, AB Sciex) met trypsine te stellen als de spijsvertering enzym en methyl methanethiosulfinate als cysteïne modificatie. Om overbodige hits en vergelijkende kwantificering te verwijderen, werden de zoekresultaten verkregen verder verwerkt door ProteinPilot software met behulp van de Paragon algoritme. Dit resulteerde in de minimale set van gerechtvaardigde geïdentificeerde eiwitten. Alle gerapporteerde gegevens werd gebruikt met een betrouwbaarheid van 95% cut-off limit. Relatieve kwantificering van peptiden werd berekend als een verhouding door deling van de iTRAQ reporter intensiteit. De verhoudingen van peptiden die het bestaan ​​van een eiwit ondersteunen werden gemiddeld voor de relatieve kwantificatie eiwit. Daarna worden de ProteinPilot analyse en Ingenuity pathway-analyse (IPA) (Ingenuity System, Mountain View, CA) werden uitgevoerd. Na het uitvoeren van een eenvoudige t-test op één van de berekende gemiddelde proteïneverhoudingen 1 tegen de geldigheid van de eiwitexpressie veranderingen te beoordelen, werd een p-waarde gerapporteerd. Proteïneverhoudingen met een p-waarde van minder dan 0,05 werden als betrouwbaar. Men moet weten dat in 90% van de iTRAQ experimentele runs eerder gedaan, de standaarddeviatie van de proteïne verhoudingen die samenhangen met technische varianten werden gemeld minder dan 0,3 zijn. Daarom verandert expressie meer dan 1,2 keer of minder dan 0,8 maal genormaliseerde expressieniveaus werden beschouwd als buiten het gebied van technische variabiliteit. Ook voerden een ongemerkte analyse en gedetecteerd op de aanwezigheid van eiwitten alleen binnen OCUM-12 /SP-cellen en OCUM 2MD3 /SP-cellen, maar niet binnen bovenliggende cellen [21]. Elk monster werd tweemaal uitgevoerd. De toegepaste LC-MS /MS onderzoeken in combinatie met iTRAQ technologie gerapporteerd als een betrouwbare kwantitatieve methode voor eiwitexpressie, die nog gevoeliger dan de western blot die afhankelijk van het type toegepaste antilichamen [22].

IPA en selectie van kandidaat eiwitten

de RIE database wordt voornamelijk gebruikt op het gebied van farmaceutische ontologie, die tot 300.000 biologische voorwerpen met inbegrip van genen, eiwitten, moleculaire en cellulaire processen. Daarom IPA werd gebruikt voor de analyse van eiwit-moleculaire functies lokalisatie. Daarnaast kunnen gedetailleerde informatie over de functies en cellulaire locaties van de geïdentificeerde eiwitten werd verkregen. Op basis van de resultaten van LC MS /MS en IPA analyses, eiwitten die waargenomen zijn overexpressie in SP cellijnen in vergelijking met hun overeenkomstige frequentie van expressie in moedercel lijnen, werden geselecteerd als kandidaat biomerkers voor SP cellen maagkanker. De identificatie van netwerken van interagerende eiwitten, alsmede functionele groepen en trajecten werd gegenereerd door IPA, en de analyse is afhankelijk van de eerder gekarakteriseerde associaties.

Kwantitatieve real-time reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR )

Maagkanker cellen werden gekweekt. En het totale cellulaire RNA werd geëxtraheerd met behulp RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA werd bereid uit 2 pg RNA met behulp van willekeurige primers (Invitrogen). Om veelvoudveranderingen in elk gen te bepalen, werd RT-PCR uitgevoerd op het ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), met in de handel verkrijgbaar genexpressie assays (Applied Biosystems) voor RBBP6
( retinoblastoom eiwit 6
; Hs00544663), HSPA4
( heat shock eiwitten 70kDa 4
; Hs00382884), HSPA9
( heat shock 70 kDa eiwit 9
; Hs00269818), GLG1
(Golgi glycoproteïne 1; Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrofosfatase 1
; Hs00225433), VPS13A
( vacuole eiwit sortering 13 homoloog A
; Hs00362891), CK18 (keratine 18
; Hs028277483), ALDOA (aldolase A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) en NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) werd gebruikt als een interne standaard om mRNA te normaliseren. De drempelcyclus (Ct) waarden werden gebruikt om de relatieve expressie verhouding tussen controle en behandelde cellen berekenen.

Western blotanalyse

expressieniveau van RBBP6 en ALDOA in kankercellen werd als volgt onderzocht. Cellysaten werden verzameld na verschillende behandelingen. Na de eiwitconcentratie van elk monster werd ingesteld, werd elektroforese uitgevoerd met 10% Tris /Gly gels (Life Technologies, Carlsbad, CA). De eiwitbanden verkregen werden overgebracht naar een Immobilon-P Transfer membraan (Amersham, Aylesbury, UK). Vervolgens werd het membraan geplaatst in PBS-T oplossing die anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS) en anti-β-actine (1:300 verdunning; Sigma Aldrich), en men liet reageren bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. De niveaus van specifieke eiwitten in elk lysaat werden gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie behulp van ECL plus (Amersham), gevolgd door autoradiografie.

kleine interfererende RNA Ontwerp

De sequenties voor RBBP6
klein interfererende RNA (siRNA) zijn als volgt opgebouwd: si RBBP6
sense, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antisense, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ', en nontargeting siRNA (negatief-siRNA) werd gekocht van Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP-cellen werden bereid bij 60% samenvloeiing in zes putjes. Het transfectie mengsel werd bereid door 150 pi Opti-MEM waaronder 9 pi Lipofectamine RNA IMAX Regant (Life Technologies) met 150 pl Opti-MEM met 90 pmol siRNA en incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Tenslotte werd de bovenstaande transfectie mengsel bereid zes-putjes toegevoegd. Vierentwintig uur na transfectie, werd RT-PCR uitgevoerd.

Wondhelende Assay

Cancer cellen werden gekweekt in 96-wells platen (Essen Instruments, Birmingham, UK). Nadat de cellen confluentie bereikten halve werd een wond gecreëerd in de cel monolaag met 96 putjes door WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Bekrast velden werden afgebeeld elke 3 uur gehouden en werd gevolgd met Incucyte live-Cell Imaging System en software (Essen Instruments). De mate van cel migratie werd geanalyseerd 24 uur na wondbehandeling als percentage van de wond confluentie. Het gemiddelde van 4 velden werd berekend als de monsterwaarde.

Invasion Assay

We gebruikten de chemotaxicell kamers (Kubota, Osaka, Japan) met een 12 urn poriën membraanfilter bekleed met 50- ug Matrigel (Collaborative Research Co, Bedford, MA). De kamer (bovenste gedeelte) werd in een 24-well kweekplaat (onderste deel). Maagkanker cellen werden geresuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 ^{3 cellen /ml. Next 500-ul lagere componenten. Na incubatie gedurende 48 uur werden kankercellen op het bovenoppervlak van het membraan verwijderd door deze af en gekleurd met hematoxyline. Kankercellen die binnengevallen door een filter bekleed met Matrigel in het onderste membraan werden handmatig geteld onder een microscoop bij 200 x vergroting. Zes willekeurig gekozen velden werden geteld voor elke bepaling. Het gemiddelde van vier velden werd berekend als de monsterwaarde. Voor elke groep werd de kweek in drievoud uitgevoerd.}

Validatie van eiwitexpressie door immunohistochemie

Immunohistochemie werd uitgevoerd op met formaline gefixeerd, in paraffine ingebedde weefselmonsters in xyleen en gedehydrateerd werden van paraffine ontdaan door middel gegradeerde ethanol. De secties werden gedurende 10 minuten bij 105 ° C autoclaaf in Target Retrieval Solution (DAKO). De monsters werden vervolgens geïncubeerd met 3% waterstofperoxide om endogene peroxidase activiteit te blokkeren. De volgende antilichamen werden gebruikt in de immunohistochemische werkwijze: anti-RBBP6 (retinoblastoom eiwit 6, WH0005930M1, 6:1000, Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glycoproteïne 1, HPA010815, 1:80, ATLAS), anti-VPS13A (vacuolaire eiwitsortering 13 homoloog A, NBP1-85642, 1:500; Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolase A, fructose-bisfosfaat; HPA004177, 1:400, ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrofosfatase 1; HPA002832, 1:200; ATLAS), anti-HSPA9 (heat shock 70 kDa eiwit 9; HPA000898, 1:200; ATLAS), anti-HSPA4 (heat shock eiwitten 70kDa 4; HPA010023, 1:200; ATLAS), en anti-KRT18 (keratine 18; ab668, 1:500; Abcam). De monsters werden geïncubeerd met elk antilichaam overnacht bij ongeveer 4 ° C. Daarna werden monsters geïncubeerd in bestemmen immunoglobuline G gedurende 10 minuten, gevolgd door driemaal wassen met PBS. Alle monsters werden vervolgens behandeld met streptavidine-peroxidase reagens en geïncubeerd in PBS diaminobenzidine en waterstofperoxide 1% (vol /vol), gevolgd door tegenkleuring met hematoxyline Mayer.

Immunohistochemische evaluatie

RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA en KRT18 expressie niveaus werden beoordeeld door zowel de intensiteit van de kleuring en het aandeel van gebrandschilderd tumorcellen. De intensiteit van kleuring werd gescoord op een schaal van 0-3 (0 = geen, 1 = mild, 2 = matig, 3 = intense). Kleuring proporties werden gescoord op een schaal van 0-4 (het percentage was anders met elk antilichaam) op basis van het percentage van positief gekleurde cellen. Daarom zou de finale kleuring score, die werd berekend als een veelvoud van de kleurintensiteit score en de kleuring aandeel score, op een schaal van 0-12. Expressie van DCTPP1 werden als positief beschouwd wanneer zij kreeg een score van 3. expressie van HSPA4 werden als positief beschouwd wanneer zij een score van 6. expressie van ALDOA, KRT18, VPS13A en GLG1 ontvangen werden als positief beschouwd wanneer elke kreeg een score van 8. RBBP6 de evaluatie waarvan alleen de kleuring evenredig score werd gebruikt voor het berekenen, werd als positief beschouwd indien het een score van 3. HSPA9 de evaluatie waarvan alleen de kleurintensiteit score werd gebruikt voor de berekening ontvangen werd positief te oordelen kreeg een score van 3. Alle evaluaties werden gemaakt door twee waarnemers die niet op de hoogte van de klinische gegevens en het resultaat waren. Wanneer een afwijkende evaluatie tussen de twee onafhankelijke waarnemers werd gevonden, werden de objectglaasjes opnieuw gecontroleerd en opnieuw geëvalueerd na bespreking.

Statistische analyse

De SPSS software (SPSS Japan, Tokyo, Japan) werd gebruikt voor gegevensanalyse. Statistische significantie van de associatie tussen de expressie van eiwitten en de verschillende klinische en variabelen, zoals leeftijd, geslacht, macroscopische type tumordifferentiatie, totaal aantal weggesneden lymfeknopen en type van chirurgie (D1 of D2 gastrectomie) werd geëvalueerd met behulp van Fisher's en Chi -squared testen. Overleving werden berekend vanaf de dag van de operatie tot het moment van overlijden of de laatste follow-up observatie met de Kaplan-Meier-methode. Bovendien, eventuele verschillen tussen de overleving curves werden beoordeeld met behulp van de log-rank test. Multivariate analysen werden uitgevoerd volgens het Cox regressiemodel de associaties tussen clinicopathologische variabelen en mortaliteit te bepalen. P-waarden van < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

De stemness van maagkanker cellijnen

De percentages van de SP-cellen waren hoger in de OCUM-12. /SP en OCUM-2MD3 /SP cellen dan in hun ouder OCUM-12 en OCUM-2MD3 cellen (figuur S1). stamcel kankertellers SP cellen OCUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP, zoals CD44, CD133 en NANOG, werden geanalyseerd door RT-PCR. Het expressieniveau van deze merkers was significant verhoogd in zowel de SP-cellijnen in vergelijking met hun oudercel lijnen (Figuur S2). Het aantal sferoïde kolonie was significant hoger in beide OCUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP cellen dan hun ouder OCUM-12 en OCUM 2MD3-cellen (gegevens niet getoond).

Detectie van kandidaateiwitten

We onderzochten of eiwitten differentieel of onafhankelijk werden tot expressie gebracht in cellen SP en uitkomsten vergeleken met die van hun ouder cellen middels QStar Elite LC-MS /MS. Bij de analyse van biologische processen, en met een betrouwbaarheid van 95% cut-off limit en p < 0,05, identificeerden we dat eiwitten inderdaad differentieel tot expressie werden gebracht. De resultaten van deze resultaten zijn weergegeven in figuur 1. De meeste van de eiwitten werden tot overexpressie gebracht in het cytoplasma van de tumorcellen (Figuur 1A). De p-waarde in de vindingrijkheid analyse wordt vermeld in Tabel S1. Deze eiwitten werden bepaald als zijnde gerelateerd aan cellulaire processen, zoals celdood, metabolisme, cellulaire organisatie DNA metabolisme, eiwitafbraak en verwerking van RNA (Figuur 1B). Boven canonieke die geassocieerd zijn met deze doelstellingen en geïdentificeerd door IPA worden in tabel S2.

In vergelijking met hun overeenkomstige bovenliggende cellen, 40 eiwitten waren opgereguleerd in OCUM-12 /SP en 35 eiwitten waren gereguleerde in OCUM-2MD3 /SP. Onder deze eiwitten, acht waren opgereguleerd in zowel OCUM-12 /SP-cellen en OCUM 2MD3 /SP-cellen, terwijl dat verband waargenomen tussen hun overeenkomstige bovenliggende cellen (Tabel 2 en Figuur 1C). Van deze acht eiwitten, de drie eiwitten, RBBP6, GLG1 en VPS13A, werden onafhankelijk gedetecteerd in zowel de SP-cellijnen, maar niet in hun corresponderende oudercellen. De vijf eiwitten, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA en KRT18, waren significant over-uitgedrukt door ten minste 1,2 maal in zowel de SP-cellen in vergelijking met hun overeenkomstige bovenliggende cellen.

De mRNA expressie niveau van deze 8 kandidaat-moleculen, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
en CK18
werd verhoogd in OCUM-12 /SP (9,15 maal, 9,36 keer, 4,14 maal, 7,80 maal, 2,08 keer, 1,46 keer, 3,44 maal en 1,99 maal, respectievelijk) en OCUM-2MD3 /SP (6,15 maal, 1,71 keer, 2,33 maal, 2,30 keer, 2,03 maal, 1,32 keer, 1,35 maal en 1,31 maal, respectievelijk) cellen, vergeleken met die van de controle ouder OCUM-12 en OCUM 2MD3-cellen (figuur 1D). Western blotanalyse gaf aan dat het expressieniveau van RBBP6 en ALDOA was hoog in CUM-12 /SP en OCUM-2MD3 /SP-cellen, vergeleken met die OCUM-12 en OCUM 2MD3-cellen (Figuur S3).

het netwerk weergegeven in figuur 1E werd gegenereerd door IPA, en de analyse is afhankelijk van de eerder gekarakteriseerde en gerapporteerd eiwitinteracties. Zo RBBP6, die werd waargenomen te worden over-uitgedrukt in CSC-achtige SP-cellen, OCUM-12 /SP cellen en OCUM-2MD3 /SP-cellen, werd direct gerelateerd aan HSPA4 en Rb en ​​indirect in verband met Hsp90 en TAGLN2. HSPA4, Hsp90 en TAGLN2 bleken ook up-gereguleerd CSC SP-achtige cellen.

Effect van siRBBP6 transfectie voor de migratie en invasieve vermogen van maagkanker cellen

Figuur 2A toont dat si RBBP6
transfectie daalde aanzienlijk mRNA expressie niveau van zowel SP cellijnen (OCUM-12 /SP was 12%, p < 0,01, OCUM-2MD3 /SP was 2,5% p. < 0,01), in vergelijking met die van de negatieve-siRNA transfectie. RBBP6
siRNA knock-down aanzienlijk gedaald de invasie (Figuur 2B) en migratie-activiteit (figuur 2C) van zowel SP-cellen.

Immunohistochemische evaluatie van de kandidaat-eiwitten en hun associatie met klinisch-pathologische kenmerken

RBBP6, DCTPP1 en HSPA9 waargenomen primair uitgedrukt in het cytoplasma en kernen van maagkanker cellen. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA en KRT18 waargenomen primair uitgedrukt in het cytoplasma (Figuur 3A). In normale epitheelcellen, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 en HSPA9 expressie bleken sommige cellen in de epitheliale klier. KRT18 werden tot expressie gebracht in de meeste epitheelcellen. HSPA4 en ALDOA expressie werd niet gevonden in normale cellen. BBP6, DCTPP1 en HSPA9 werden uitgedrukt in het cytoplasma en kernen van normale epitheelcellen. GLG1, VPS13A, HSPA9 en KRT18 waargenomen in het cytoplasma van epitheelcellen (figuur 3B).

We onderzochten de associatie tussen het expressieniveau van de acht kandidaat-eiwitten en de klinische en pathologische kenmerken. Aantal gevallen aan elke score voor de acht doelen werd weergegeven in tabel S3. Deze acht eiwitten werden bepaald geassocieerd met potentieel kwaadaardige processen, zoals metastasen op afstand, lymfeknoop (LN) metastase, invasie diepte of stadium ontwikkeling (tabel 3). De berekende p-waarden waren als volgt: RBBP6 was significant geassocieerd met invasie diepte (p < 0,001), LN metastase (p < 0,001), metastasen (p = 0,013), en klinische fase (p < 0,001); GLG1 was significant geassocieerd met slechts metastasen op afstand (p = 0,045). VPS13A was significant geassocieerd met de invasie diepte (p = 0,005), LN metastase (p < 0,001), en het stadium vooruitgang (p = 0,005); DCTPP1 was significant geassocieerd met de invasie diepte (p < 0,001), LN metastase (p < 0,001), metastasen op afstand (p < 0,001), en het stadium vooruitgang (p < 0,001); HSPA9 was significant geassocieerd met de invasie diepte (p < 0,001), LN metastase (p < 0,001), en het stadium vooruitgang (p < 0,001); HSPA4 was significant geassocieerd met de invasie diepte (p < 0,001), LN metastase (p < 0,001), metastasen op afstand (p = 0,007), en het stadium vooruitgang (p < 0,001); ALDOA was significant geassocieerd met de invasie diepte (p = 0,034), LN metastase (p = 0,004), en het stadium vooruitgang (p = 0,029); en KRT18 was significant geassocieerd met de invasie diepte (p = 0,001), LN metastase (p = 0,001), metastasen op afstand (p = 0,034), en het stadium vooruitgang (p = 0,004).

Prognose

de Kaplan-Meier plots voorgesteld van de acht overexpressie gebrachte eiwitten, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 en ALDOA, waren significant geassocieerd met een slechte overleving in alle patiënten (Figuur 4). De cumulatieve vijf jaar algehele overleving van RBBP6-positieve gevallen (61%) was significant minder (p = 0,002) dan die van RBBP6-negatieve gevallen (78%). Bovendien kan bij patiënten in fase III, de totale overleving van RBBP6-positieve gevallen was significant lager (p = 0,034) dan die van RBBP6-negatieve gevallen. De prognose voor patiënten met DCTPP1-positieve tumoren (63%) was significant slechter (p = 0,016) dan die van DCTPP1-negatieve tumoren (75%). De periode van vijf jaar algehele overleving van HSPA4-positieve gevallen (66%) was significant minder (p = 0,047) dan die van HSPA4-negatieve gevallen (75%). De periode van vijf jaar algehele overleving van ALDOA-positieve tumoren vertonen overexpressie (61%) was significant slechter (p = 0,043) dan die van ALDOA-negatieve tumoren (72%). Daarentegen werden geen significante correlatie gevonden tussen andere eiwitten en overleving van de patiënt. Na univariate analyse werden RBBP6, DCTPP1, HSPA4 en ALDOA expressieniveaus significant geassocieerd met een slechte prognose bij 300 maagkankerpatiënten (Tabel 4). Bovendien macroscopische type (Type 4), weefseltype (diffuus), T categorie (T2-4), verblijf invasie, infiltratie patroon (INF b, c), peritoneale métastase, en LN metastase werden bepaald significant geassocieerd met een slechte prognose. Multivariate analyse werd uitgevoerd volgens het Cox Proportional hazards model voor alle belangrijke variabelen in de univariate analyse. Na analyse voltooiing RBBP6 expressie (p = 0,023), Borrmann type 4 (p < 0,001), buikvlies positief (p = 0,001), LN metastase (p = 0,003), en lever metastase (p = 0,001) werden bevestigd als onafhankelijke factoren gecorreleerd met overleving (tabel 3). Van de acht eiwitten, RBBP6 expressie was een onafhankelijke prognostische factor.

Discussie

Maagkanker leidt tot een slechte prognose vanwege veelvuldige metastatische processen, zoals LN metastase en peritoneale metastasen [23]. CSCs zijn voorgesteld als hebbende een belangrijke rol bij de maligne potentie van kankercellen, waaronder metastasen en chemoresistance [4]. Sindsdien hebben we ontdekt dat SP-cellen verkregen van maagkanker onderwerpen bezitten deze CSC eigenschappen [3]. We bevestigd dat SP cellen gebruikt in deze studie express kandidaat maagkanker stamcel markers waaronder CD44 [24], CD133 [25] en NANOG [26] (figuur S2). De sferoïde kolonievorming activiteit van deze SP cellen was hoger dan die van de bovenliggende cellen [18]. Bovendien zijn deze CSC-achtige SP cellen vertonen chemoresistance antikanker drugs [2]. Deze bevindingen bevestigden dat OCUM-12 /SP-cellen en OCUM 2MD3 /SP kankercellen stamcelachtige eigenschappen kunnen vormen. Aangezien specifieke markers voor de maag CSCs niet als nog gepubliceerd, zou opheldering van de specifieke signaalwegen en mechanismen die ten grondslag liggen aan de acties van CSCs de prognose van maagkanker te verbeteren. In deze studie werden acht kandidaat CSCs markers geïdentificeerd door proteomics technieken met behulp van LC-MS /MS in combinatie met iTRAQ technologie. Drie eiwitten, RBBP6, GLG1 en VPS13A, werden gedetecteerd alleen in de SP-cellijnen, maar niet in hun respectievelijke ouders cellijnen. Bovendien, de vijf eiwitten, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4 en KRT18, werden tot overexpressie gebracht in zowel de SP-cellijnen ten opzichte van hun oudercel lijnen. RT-PCR-analyse gaf ook aan dat de expressie van RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
en CK18
was hoog in OCUM-12 /SP en OCUM- 2MD3 /SP, in vergelijking met de controle van de ouder OCUM-12 en OCUM-2MD3. Deze eiwitten werden verdacht van nieuwe biomarkers voor de maag CSCs zijn. Deze hypothese werd getest door immunohistochemische analyse van 300 maagkanker cases.

RBBP6 is een nucleair eiwit, dat een bekend is geassocieerd en mogelijk gerelateerd aan p53 en retinoblastoom Q bindend eiwit 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interageert met het tumor suppressor eiwitten p53 en Rb, en speelt een rol bij de inductie van apoptose en regulering van de celcyclus [28] [29]. RBBP6 bindt aan wild-type p53-eiwitten maar niet p53 mutanten [30]. Ook is aangetoond dat het bevorderen van de binding van MDM2 [31], een E3 ubiquitine ligase dat de p53 [32] is gericht, en verstoring van het vermogen om de doelgenen [33] transactiveren. Up-regulatie van RBBP6 sterk gecorreleerd met tumorprogressie bij slokdarmkanker en baarmoederhalskanker [32]. In deze studie werd RBBP6 expressie geassocieerd met 'T' categorie kanker met betrekking tot invasie diepte, metastasen op afstand, lymfeknoop metastase en klinische fase. Bovendien werd RBBP6 expressie significant geassocieerd met een slechte overleving in patiënten in alle stadia, met name in fase III, waardoor de conclusie dat RBBP6 een onafhankelijke factor om te overleven. We voerden de RBBP6
siRNA knock-down van de RBBP6
gen met behulp van OCUM-12 /SP cellen en OCUM-2MD3 /SP cellen in deze studie.

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy van maagkanker peritonitis carcinomatosa in een muis Model
• PLoS Genetics: kiembaanmutaties in MAP3K6 worden geassocieerd met Familiaire Gastric Cancer