Abstrakt
Photoimmunotherapy (PIT) ist eine neue Krebstherapie, die die Spezifität von Antikörpern für das Targeting-Tumoren mit der Toxizität von Photosensibilisatoren nach der Exposition induziert kombiniert zu nah-Infrarot (NIR) Licht. Wir führten PIT in einem Modell von disseminierter Magenkrebs Peritonealkarzinose und überwacht die Wirksamkeit mit in vivo Citation:. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy von Magenkrebs Peritonealkarzinose in einem Maus-Modell. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276 Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Vereinigte Staaten von Amerika Empfangen: 2. Juli 2014; Akzeptiert: 21. Oktober 2014; Veröffentlicht am: 17. November 2014 Dies ist eine Open-Access-Artikel, frei von Copyright und werden frei reproduziert werden, verteilt, übertragen, verändert, als Grundlage oder auf andere Weise von jedermann zu jedem legalen Zweck verwendet. Die Arbeit wird unter der Creative Commons CC0 public domain Engagement verfügbar Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse zugrunde liegen, sind ohne Einschränkung in vollem Umfang verfügbar. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien Finanzierung:. Diese Arbeit wurde vom NIH Intramural Programm und JSPS-Forschungsstipendium unterstützt wurde. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen Einführung Magenkarzinom verursacht mehr als 740.000 Krebs-Todesfälle pro Jahr weltweit vor allem in Asien [1] - [3]. Die Mehrheit der Patienten mit Magenkrebs vorhanden mit lokal fortgeschrittenem, rezidiviertem oder metastasiertem Krankheit ausgeschlossen kurative Operation, die vor allem durch nicht-kurative Therapie [1] verwaltet wird. Peritonealkarzinose und Lebermetastasen sind häufig lebensbedrohlichen Manifestationen der fortgeschrittenen Stadium Magenkrebs [1], [4]. Peritonealkarzinose tritt auch bei Eierstock-, Appendix, Kolon, Pankreas und Magen-Krebs. Die Prognose ist allgemein schlecht und lokale Behandlungen sind immer erfolglos mit hohen Rezidivraten und Morbidität verbunden mit Aszites und Darmverschluss. Die systemische Therapie ist auch in der Regel nicht erfolgreich. So werden neue Methoden der Peritonealkarzinose Behandlung benötigt. Photoimmunotherapy (PIT) ist eine neue zielzellspezifische Krebsbehandlung, die eine Antikörper-Konjugat Photosensibilisator (APSC), gefolgt von nahem Infrarot (NIR) Belichtung verwendet. Ein APSC besteht aus einem Krebszell-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) und einem Photosensibilisator, IR700, die ein Siliciumdioxid-Phthalocyanin-Derivat kovalent an den Antikörper konjugiert ist. Der APSC bindet Zielmoleküle auf der Zellmembran und induziert dann fast sofort Zellnekrose nach Einwirkung von NIR-Licht bei 690 nm. In vitro Während PIT schnelle zelluläre Nekrose entsteht, das Gesamtvolumen des Tumors mehrere Tage nicht ändern können. Dies liegt daran, es mindestens mehrere Tage dauert, Makrophagen, Verfahren zu betreten und die behandelten Tumor verlassen. Daher werden neue Verfahren, über Größenmessungen sind erforderlich, um die Auswirkungen von PIT zu überwachen. Die Fluoreszenz-Proteine (FPs) werden zur Visualisierung zellulärer Prozesse häufig verwendet [10], [11]. Während die meisten apoptotischen Zelltod führt Erhaltung der Zellmembran und Beibehaltung der FP Herstellung Fluoreszenz insensitive Tod [12] zu der Zelle, [13], in PIT, die plötzlichen Bruch von Zellmembranen führt Extrusion von zytoplasmatischen FPs und daher ein relativ schnelle Auslesung des Zelltods. Ein Vorteil der FPs für In-vivo-Bildgebung In dieser Studie untersuchten wir die Wirksamkeit von PIT in einem Maus-Modell von disseminierter Peritonealdialyse Magenkrebs unter Verwendung von in-vivo-GFP-Fluoreszenz-Bildgebung Antwort überwachen. Materialien und Methoden Reagenzien Wasserlösliche lösliche~~POS=HEADCOMP, Silizium-Phthalocyanin-Derivat, IRDye 700DX NHS-Ester und IRDye 800 CW NHS-Ester von LI-COR Bioscience erhalten (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, ein vollständig humanisierter IgG 2 mAb gegen EGFR gerichtet ist, wurde von Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) erworben. Trastuzumab, 95% humanisierte IgG 1 mAb gegen HER2 gerichtete, von Genentech (South San Francisco, CA, USA) erworben wurde. Alle anderen Chemikalien waren analysenrein. Die Konjugation von Farbstoffen mit mAb einem früheren Bericht gemäß [19] durchgeführt wurde. Kurz gesagt, Panitumumab oder Trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) wurde mit IR700 NHS-Ester (60,2 &mgr; g, 30,8 nmol) oder IRDye 800 CW NHS-Ester (35,9 &mgr; g, 30,8 nmol) in 0,1 mol /l Na 2HPO N87-GFP-Zellen stabil GFP exprimieren, wurden gekauft von ANTI-KREBS (San Diego, CA, USA). Hohe GFP-Expression wurde in Abwesenheit eines Selektionsmittels mit 10 Durchgängen bestätigt. Auszuwerten spezifischen Zellabtötung durch PIT, 3T3-Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden stabil DsRed (3T3 /DsRed) Exprimieren [5]. Zellen wurden in RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin /Streptomycin (Life Technologies) in Gewebekulturflaschen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95 gezüchtet % Luft und 5% Kohlendioxid die Fluoreszenzmikroskopie , um die Antigen-spezifische Lokalisierung von IR700-Konjugate und die Änderung der Zellmorphologie nach PIT, Fluoreszenzmikroskopie (IX61 oder IX81 durchgeführt wurde, zu erkennen.; Olympus America, Melville, NY, USA). Zehntausend Zellen wurden auf Deckglasbodenplatten und für 24 Stunden inkubiert. Tra-IR700 wurde dann zu dem Kulturmedium (Phenolrot-frei) bei 10 ug /ml und für 6 h bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen; Propidiumiodid (PI) (1:2000) oder Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) wurde in den Medien 30 min zugegeben, bevor PIT abgestorbenen Zellen zu detektieren. Die Zellen wurden dann mit NIR-Licht ausgesetzt und serielle Bilder wurden erhalten. Einen Tag nach der PIT wurden die Zellen gewaschen und mit neuem Medium nach PIT (0,5 J /cm 2) und PI wurde erneut zugegeben. Um sicherzustellen, dass die gleiche Region wurde abzubildenden Markierungen wurden auf jeder Kulturschale gemacht, um anzuzeigen, wo die Abbildungs erworben wurde. Der Filter wurde auf IR700 Fluoreszenz mit einem 590-650 nm Anregungsfilter erfassen und ein 665-740 nm-Band Emissionsfilter passieren. Die Analyse der Bilder wurde mit ImageJ-Software durchgeführt (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Die Fluoreszenz von Zellen nach der Inkubation mit pan-IR700 oder tra-IR700 wurde mit einem Durchflusszytometer (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) und Cellquest-Software (BD Biosciences) gemessen. Zellen (1 × 10 5) wurden bei 37 ° C mit jedem Konjugat für 6 Stunden inkubiert. Um die spezifische Validierung wurde die Bindung des konjugierten Antikörper, überschüssige Antikörper (50 ug) verwendet 0,5 ug Farbstoff-Antikörper-Konjugate zu blockieren [8]. Eine hunderttausend Zellen wurden in 24 Well-Platten ausgesät und für 24 h inkubiert. Kulturmedium wurde durch frisches Kulturmedium 10 ug /ml tra-IR700 enthält, und die Zellen bei 37 ° C für 6 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS, Phenolrot freies Kulturmedium zugegeben wurde. Dann wurden die Zellen bei 685-695 nm Wellenlänge mit NIR-Laserlicht bestrahlt (BWF5-690-8-600-0.37; B &. W TEK INC, Newark, DE, USA). Die tatsächliche Leistungsdichte von mW /cm 2 wurde mit einem optischen Leistungsmesser (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA) gemessen. Die zytotoxische Wirkung von PIT mit tra-IR700 wurden durch Durchflusszytometrie-PI-Färbung bestimmt, die kompromittierten Zellmembranen erkennt. Für die Durchflusszytometrie-Assay wurden die Zellen 1 h nach der Behandlung mit Trypsin behandelt und mit PBS gewaschen. PI wurde cytometry in der Zellsuspension (final 2 ug /ml) und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min, gefolgt von Strömung versetzt. Einhunderttausend Zellen wurden auf Deckglasboden-Schalen ausgesät und für 12 Stunden inkubiert. Tra-IR700 wurde dann zu dem Kulturmedium (Phenolrot-frei) bei 10 ug /ml und für 6 h bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und wieder mit einem neuen, Phenolrot freien Kulturmedium und der unteren Seite des Deckglases markiert wurde (um die Position des Beobachtungs bestimmen). Nach dem PIT wurden die Zellen erneut für 1 Tag inkubiert. Einen Tag nach der PIT wurden die Zellen erneut beobachtet. Die GFP-Intensität wurde mit insgesamt Pixel mit dem gleichen Schwellenwert im gleichen Feld [20] bewertet. Analyse der Bilder wurde mit ImageJ Software durchgeführt (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Fluoreszenz von behandelten Zellen wurde auch eine Durchflusszytometer (FACS Calibur) gemessen. Tierische und Tumormodelle Alle in vivo In vivo Mäuse entweder mit Peritonealdialyse Krebs verbreitet (bei 6 Wochen nach der Zellimplantation) oder Flankentumoren (7 Tage nach der Zellimplantation) wurden intravenös mit 100 ug tra-IR700 und tra-IR800 injiziert. Einen Tag nach der Injektion wurden serielle Bilder mit einem Perlen-Imager ausgeführt IR700 /IR800 Fluoreszenz zu erkennen und die Maestro für GFP. Weißes Licht Bilder der Mäuse wurden mit einem iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA) erhalten. Um die Wirkung von PIT in der Flanke Modells zu bewerten , N87-GFP tumortragenden Mäuse wurden in 4 Gruppen von mindestens 10 Tieren pro Gruppe randomisiert wie folgt: (1) keine Behandlung (Kontrolle); (2) nur die Belichtung NIR-Licht bei 50 J /cm 2 am Tag 1 und 100 J /cm 2 am Tag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ohne NIR-Licht Exposition; (4) 100 ug tra-IR700 i.v., NIR-Licht bei 50 J verabreicht wurde /cm 2 am Tag 1 nach der Injektion und 100 J /cm 2 am Tag 2 nach der Injektion. Diese Bedingungen wurden jede Woche für bis zu 3 Wochen aufgetragen. Die Mäuse wurden täglich überwacht und die Fluoreszenzbilder wurden 1 Tag erhalten wird, beginnend vor dem PIT und die Tumorvolumina wurden dreimal pro Woche gemessen, bis der Tumor Durchmesser 2 cm erreicht, worauf die Mäuse mit Kohlendioxid eingeschläfert wurden. Für Fluoreszenz-Bildgebung wurden die Mäuse mit 100 ug tra-IR700 injiziert oder bestrahlt wie folgt: (1) NIR-Licht bei 50 J verabreicht wurde /cm 2 am Tag 1 nach der Injektion und 100 J /cm 2 auf Tag 2 nach rechts Tumor (2) wurde keine NIR-Licht nach links Tumor verabreicht, die als Kontrolle diente. Die Kontrollen umfassten (1) nur NIR-Licht-Exposition bei 50 J /cm 2 am Tag 1 und 100 J /cm 2 am Tag 2 nach rechts Tumor; (2) keine Behandlung für die linke Tumor Um verbreitet Peritonealdialyse Krebs zu bewerten, Mäuse in 4 Gruppen von 5 Tieren, die für die folgenden Behandlungen pro Gruppe randomisiert wurden. (1) keine Behandlung (Kontrolle); (2) nur die Belichtung NIR-Licht bei 50 J /cm 2 am Tag 1 und 100 J /cm 2 am Tag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ohne NIR-Licht Exposition; (4) 100 ug tra-IR700 iv wurde NIR-Licht bei 50 J verabreicht /cm 2 am Tag 1 und 100 J /cm 2 am Tag 2 nach der Injektion. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von einem Minimum von vier Experimenten, wenn nicht anders angegeben. Statistische Analysen wurden durchgeführt, ein Statistikprogramm (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Für multiple Vergleiche, eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Post-Test (Kruskal-Wallis-Test mit Post-Test) und wurde Tukey-Test verwendet. Die kumulative Wahrscheinlichkeit des Überlebens, bestimmt hier als die Tumordurchmesser andernfalls 2 cm zu erreichen, wurden in jeder Gruppe mit der Verwendung des Kaplan-Meier-Überlebenskurvenanalyse abgeschätzt und die Ergebnisse wurden mit dem Log-Rank-Test und Wilcoxon-Test verglichen. Student t Ergebnisse | Bestätigung von Expressionsprofil von N87-GFP-Zellen als Ziel für die PIT Wir haben die Fluoreszenzsignale untersucht. von pan-IR700 und tra-IR700 zu N87-GFP-Zellen durch FACS gebunden. Nach 6-stündiger Inkubation mit entweder pan-IR700 oder tra-IR700, N87-GFP-Zellen zeigten durchweg eine höhere Helligkeit mit tra-IR700 als pan-IR700 (Abb. 1A). Diese Signale wurden fast vollständig durch die Zugabe von überschüssigem Trastuzumab oder panitumumab blockiert, was darauf hindeutet spezifische Bindung und bestätigt die höhere Expression von HER2 als EGFR [21]. Diese Daten legen nahe, dass HER2 das bevorzugte Ziel für die PIT in N87-GFP-Zellen war aufgrund seiner höheren Ausdruck. Serien-Fluoreszenzmikroskopie von N87-GFP-Zellen vor durchgeführt wurde, und nach der PIT. Nach der Belichtung mit NIR-Licht (2 J /cm 2) zellulären Schwellung, Bläschen Bildung und Ruptur des Lysosom beobachtet wurden, bei der Extrusion von Zytoplasma resultierenden extrazellulär (Fig. 1B). PI-Färbung zeigten akute zytotoxische Membran Schäden, die durch PIT. Die meisten dieser zellulären Veränderungen wurden innerhalb von 30 Minuten der Belichtung (Hintergrundinformationen Video S1 und S2) beobachtet. Keine wesentlichen Änderungen wurden in EGFR-negativen 3T3-Zellen bestrahlt mit NIR-Licht detektiert, was darauf hindeutet, PIT keinen Schaden in Nicht-Zielzellen induziert (Abb. S1). um die Wirkung von in vitro Einen Tag nach der Exposition gegenüber NIR-Licht von 0,5 J /cm 2, etwa 50% der Zellen zeigten akute Zytotoxizität (Fig. 1C) und die GFP-Fluoreszenz-Intensität wurde in toten Zellen (positiv gefärbt mit PI) stark reduziert, während GFP-Fluoreszenz in überlebenden Zellen (Abb. 1D) erhalten wurde. Diese Studien legen nahe, dass GFP aus der Zelle nach Membranruptur extrudiert. Um die Änderung der GFP-Fluoreszenz zu untersuchen, verglichen wir die Gesamt GFP Pixel in dem selben Gebiet vor und einen Tag nach der PIT (Abb. S2). Die GFP-Fluoreszenz-Verhältnis verringerte sich direkt mit Lichtdosis, während keine Abnahme mit NIR-Lichtexposition oder tra-IR700 allein (Abb. 1E) nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse wurden durch FACS-Analyse bestätigt (Fig. 1F und Fig. S3) und legen nahe, dass PIT führt zu einer Abnahme der GFP-Fluoreszenz folgenden nekrotischen Zelltod bei 1 Tag nach der PIT in einer Weise abhängig von der Lichtdosis. Als nächstes wir die Wirkung von PIT in vivo Um zu überwachen in vivo Die Quantifizierung der Gesamt GFP-Fluoreszenzintensität ergaben, dass es eine signifikante Abnahme nach PIT (n = 5 Mäuse in jeder Gruppe, * p = 0,0118 < 0,05, ** p = 0,0010 < 0,01, *** p = 0,0049 < 0,01, Tukey-Test mit ANOVA) (Fig. 3C). Durch Tumor wieder Wachstum, erhöhte wieder das GFP-Verhältnis von Tag 4 nach der PIT, obwohl es als andere Kontrollgruppen niedriger war. Die Echtzeit-GFP-Fluoreszenz-Bildgebung und deren Quantifizierung ermöglicht Echtzeit-Vergleich der Gruppen und zeigte eine starke Korrelation zwischen höheren GFP-Fluoreszenz und die Tumorprogression in jeder Gruppe. Um diesen Effekt zu bestätigen, ex vivo Wenn PIT wöchentlich wiederholt wurde, GFP-Fluoreszenz-Aktivität schließlich verschwunden (Abb. 4C und D), was auf eine vollständige Tötung des Tumors. Charakterisierung der disseminierten Peritonealdialyse-Modell mit Fluoreszenz-Bildgebung um geführt, um die Naturgeschichte der disseminierten Peritonealdialyse Modell, Serien Fluoreszenz-Bildgebung wurde zu bestimmen. Die implantierten Tumoren zeigten hohe Fluoreszenzsignal mit IR700, IR800 und GFP, von denen alle miteinander co-lokalisiert (IR800 verwendet wurde intestinale Autofluoreszenz zu vermeiden) (Fig. 5). Diese Daten deuten darauf hin, dass dieses Modell von disseminierter Peritonealdialyse Krebs kann in lebenden Mäusen unter Verwendung von GFP-Fluoreszenz überwacht werden. Realtime-GFP-Fluoreszenz-Bildgebung war in der verbreiteten Peritonealdialyse-Modell vor und nach der PIT (Abb. 6A) durchgeführt. IR700 Fluoreszenz sank nach PIT (Abb. S4). GFP TFI allmählich erhöht, in den nicht-PIT-Gruppen aufgrund des Tumorwachstums. In der PIT behandelten Gruppe sank GFP TFI von 1 Tag bis 3 Tage nach dem PIT (Abb. 6B). Quantifizierung der Gesamt GFP-Fluoreszenzintensität zeigte eine signifikante Abnahme nach PIT (n = 5 Mäuse in jeder Gruppe, * p = 0,0295 < 0,05, ** p = 0,0355 < 0,05, Kruskal-Wallis-Test mit Post-Test) (Fig. 6C). Aufgrund der Tumorwiederwachstum, erhöhte das GFP-Verhältnis wieder von 4 Tage nach der PIT, obwohl sie geringer als bei anderen Gruppen gehalten, wie bei der Flankentumormodell beobachtet. Somit verursacht PIT gezielten Tumor signifikante Wirkung Abtöten sowohl in der Flanke und disseminierter peritonealen Tumormodellen und diese mit GFP TFI überwacht werden könnte. Diese Studie zeigt, dass die Wirkung von PIT kann mit GFP-Fluoreszenz-Bildgebung überwacht. Im Gegensatz zu Apoptose [12], [13], in denen GFP und verwandte fluoreszierende Proteine werden heller aufgrund der Abnahme zytoplasmatischen Volumen, während nekrotischen Zelltod mit PIT, Membranschäden von Cytoplasma-Inhalte, einschließlich GFP zur Freigabe führt. Diese einzigartige Eigenschaft von GFP und verwandte fluoreszierende Proteine macht sie Biomarker für PIT. In-vivo- Das Konzept der gezielten Lichttherapie ist mehr als drei Jahrzehnte alt [22]. Aufgrund der Hydrophobizität des traditionellen Sensibilisatoren Photodynamischen Therapie (PDT), ist die Pharmakokinetik von Antikörper konjugiert PDT-Mittel in seiner Fähigkeit, hoch beschränkt Konjugate zu dem Ziel zu liefern. Daher mit Antikörpern gezielte PDT Sensibilisatoren hat nur erfolgreich bei Modellen, bei denen das Konjugat direkt in den Tumor oder Peritoneum injiziert wurde [23]. Um einen Antikörper-Photosensibilisator-Konjugat (APSC) systemisch zu liefern, sollte der Photosensibilisator vorzugsweise hydrophil sein. Die hydrophile Phthalocyanin-Basis Photosensibilisator, IR700DX wenn an einen Antikörper konjugiert wird ein APC, die intravenös verabreicht werden kann. Diese Form der Therapie, PIT genannt, unterscheidet sich von herkömmlichen PDT nicht nur in der Hydrophilie des Photosensibilisators, sondern auch in seiner Abhängigkeit von NIR-Licht um den Photosensibilisator zu aktivieren. NIR-Licht hat eine bessere Gewebepenetration als niedrigere welliges Licht in der PDT verwendet. Diese neue Generation von APCs zeigt ähnliche intravenöse Pharmakokinetik nackte Antikörper, was zu einer sehr gezielten Tumorakkumulation mit minimalen Nicht-Ziel-Bindung und kann auf ein breites Spektrum von Antikörpern angewendet werden, viele mögliche Anwendungen im ganzen Körper ermöglicht. Trotz zytotoxische Chemotherapie, das Ergebnis für fortgeschrittenen Stadium Magenkrebs bleibt schlecht. Da wird die Mehrzahl der Patienten mit Peritonealmetastasen vorhanden mit heimtückischen Symptome wie Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust, Blähungen Gefühl, Schmerzen oder Anämie Diagnose oft verzögert und lokale Therapien sind nicht mehr möglich [24]. PIT ist eine vielversprechende Methode der disseminierten Peritonealdialyse Behandlung von Krebs. Um eine effektive PIT zu können, sollte die APSC systemisch und das Licht geliefert werden soll selektiv an das Peritoneum angewendet werden. Unter diesen Bedingungen gibt es eine ausreichende Abgabe von in APSCs Reduktion von disseminierten Tumoren nach PIT führt. Dieser Prozess kann mit Echtzeit in vivo Es gibt mehrere Einschränkungen dieser Studie. Es sollte beachtet werden, dass nicht alle Magenkarzinome HER2 exprimieren und daher tra-IR700 möglicherweise nicht einheitlich wirksam bei disseminierter Magenkrebs. Tatsächlich kann es notwendig sein, ein Cocktail von APSCs zu verwenden, um effektiv die meisten der Expressionsprofile in einem bestimmten Tumor decken [25]. Eine andere Einschränkung, die in dieser Studie ist, dass Licht transkutan in kleine Mäusen verabreicht werden können, aber dies ist nicht möglich, beim Menschen. Um effektiv Menschen mit PIT behandeln, wird es notwendig sein Licht anwenden laparoskopisch Absorption durch die Haut zu verhindern. Eine weitere Einschränkung ist, dass unser Modell nur bei immungeschwächten Mäusen bewertet. Die immunologische Reaktion der PIT wird in der Zukunft in immunkompetenten Mäusen ausgewertet werden. Schließlich wird in der nahen Zukunft GFP Fluoreszenz-Bildgebung zu Tierstudien beschränkt, da es die Transfektion des Tumors mit einem endogenen Protein erfordert. Dennoch ist dies eine nützliche Anzeige für präklinische Studien. PIT ist wirksam gegen HER2-positiven Peritonealkarzinose Magenkrebs in einem Mausmodell und GFP-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht die Überwachung von PIT-Effekte. Grundinformationen Acknowledgments Diese Forschung wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Zentrum für Krebsforschung unterstützt. Kazuhide Sato mit JSPS-Forschungsstipendium für japanische Biomedical und Verhaltensforscher am NIH unterstützt.
GFP-Fluoreszenz-Bildgebung. In-vitro-
und in vivo
Experimente wurden mit einem HER2-exprimierenden, GFP-exprimierenden, Magenkrebs-Zelllinie (N87-GFP) durchgeführt. Ein Konjugat aus einem Photosensibilisator besteht, IR-700, konjugiert an Trastuzumab (tra-IR700), gefolgt von NIR-Licht wurde PIT verwendet. In vitro
PIT wurde durch Messung der Cytotoxizität mit totem-Färbung und einer Verringerung der GFP-Fluoreszenz ausgewertet. In-vivo-
PIT wurde in einer disseminierten Peritonealkarzinose Modell und einer Flanke Xenotransplantat mit Tumorvolumenmessungen und GFP-Fluoreszenzintensität bewertet. In-vivo-
Anti-Tumor-Wirkung von PIT durch signifikante Reduktion des Tumorvolumens bestätigt wurden (am Tag 15, p < 0,0001 vs. Kontrolle) und GFP-Fluoreszenz-Intensität (Flanke Modell: am Tag 3, behandelt PIT vs. Kontrolle p < 0,01 und Peritonealdialyse disseminierte Modell: am Tag 3 PIT vs. Kontrolle, p <behandelt; 0,05). Zytotoxische Effekte In-vitro-
wurden gezeigt auf der Lichtdosis abhängig zu sein und verursacht nekrotischen Zellbruch zu GFP Freisetzung führen und zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität in vitro.
So Verlust der GFP-Fluoreszenz serviert als nützlicher Biomarker für Zellnekrosen nach PIT
Studien haben gezeigt PIT hochzellspezifisch sein, also nicht-exprimierenden Zellen unmittelbar benachbart angezielten Zellen zeigen keine toxischen Wirkungen [5]. Zellen mit PIT laufen Expansions schnellen Volumen behandelt, was zu Reißen der Zellmembran, Extrusion von Zellinhalt in den Extrazellularraum und irreversible Nekrose [6] - [8]. Unsere Ergebnisse und andere zeigen, daß die Zytotoxizität von PIT induzierte völlig nicht auf reaktive Sauerstoffspezies verlassen oder das Vorhandensein von Singulett-Sauerstoff-Quencher [9]. Weiterhin Zytotoxizität von PIT induziert wird, in erster Linie in der Zellmembran und nicht in den Mitochondrien als mit PDT auftritt.
ist, dass sie extrinsische Injektionen von Mitteln (wie Luciferin im Fall von Biolumineszenz) nicht benötigen und können in Echtzeit [14] überwacht werden - [18]. Da sie Gen-Transfektion erfordern, würden sie wahrscheinlich nur nützlich in Studien vorklinischen.
Synthese von IR700-konjugierten Trastuzumab oder Panitumumab und IR800-konjugierte Trastuzumab
Zellkultur
Durchflusszytometrie
In-vitro-PIT
Zytotoxizitätstest
Abschätzung der GFP-Fluoreszenzintensität in vitro
Verfahren wurden mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortier Ressourcen (1996), betrieben, US National Research Council, und von der NIH Animal Care und Use Committee genehmigt. Sechs- bis acht Wochen alte weibliche homozygote athymische Nacktmäuse wurden von Charles River (NCI-Frederick) erworben. Um nur die direkte Tumorzellen abtötende Wirkung von in vivo
PIT, geschwächtem Immunsystem Nacktmäuse wurden verwendet, um zu bewerten. Während Verfahren wurden die Mäuse mit Isofluran betäubt. Zehn Millionen N87-GFP-Zellen wurden subkutan in die rechte Dorsum der Mäuse injiziert. Um Tumorvolumen, die größte Längsdurchmesser (Länge) und der größten Querdurchmesser (Breite) wurden gemessen mit einem externen Sattels zu bestimmen. Tumorvolumina bezogen auf Kalibermessungen durch die folgende Formel berechnet wurden; Tumorvolumen = Länge x Breite 2 × 0,5. Tumoren erreicht etwa 100 mm 3 in Volumen wurden für die Studie ausgewählt. GFP-Fluoreszenz nach PIT, zehn Millionen N87-GFP-Zellen wurden subkutan in beide dorsi der Mäuse injiziert messen. Für die Verbreitung Peritonealdialyse Krebs-Maus-Modell, fünfzig Millionen N87-GFP-Zellen mit PBS (insgesamt 300 &mgr; l) wurden in die Bauchhöhle injiziert.
In-vivo-Fluoreszenz-Bildgebung
Fluoreszenzbilder wurden zum Nachweis von IR700 /IR800 Fluoreszenz und einem Maestro Imager (CRI, Woburn, MA, USA) für GFP mit einem Perlen-Imager (LI-COR Bioscience) erhalten. Für GFP, ein Bandpassfilter von 445 bis 490 nm (Anregung) und einem Langpassblaufilters über 515 nm (Emission) verwendet. Der abstimmbare Emissionsfilter wurde automatisch in 10 nm-Schritten von 500 bis 600 nm für die grünen Filtersätze bei konstanter Belichtung (500 ms) trat. Die spektralen Fluoreszenzbilder bestehen aus Autofluoreszenzspektren und den Spektren von GFP (N87-GFP-Tumor), die dann ungemischten waren, basierend auf der charakteristischen spektralen Muster von GFP unter Verwendung Maestro Software (CRI). Regionen von Interesse (ROIs) wurden von Hand gezeichnet entweder an der Flanke Tumor oder über die Bauchregion entsprechend dem Modell und der Fluoreszenzintensität gemessen wurde [19].
Charakterisierung von disseminierten Peritonealdialyse Mausmodell
In-vivo-PIT
Statistische Analyse
Test wurde auch die beiden zu vergleichen verwendet In-vitro-Studie
; p < 0,05 wurde eine statistisch signifikante Differenz, um anzuzeigen, betrachtet
Mikroskopie von in-vitro-PIT
Auswertung von in-vitro-PIT-Effekt
PIT quantitativ zu bestimmen, führten wir einen Zytotoxizitätstest basierend auf den Einbau von PI, die zeigten, dass der Zelltod mit zunehmender Lichtdosis erhöht (Fig. 1C). Keine signifikante Zytotoxizität wurde mit NIR-Licht Exposition oder tra-IR700 allein erkannt.
Auswertung mit GFP-Fluoreszenz in vitro nach PIT
in-vivo-PIT reduziert in der Flanke Xenograftmodell Tumorvolumen
auf Flanke tumortragenden Mäusen untersucht (Abb. 2A). PIT signifikante Reduktion des Tumorvolumens (n = 10 in jeder Gruppe, p = 0,0456 * < 0,05, Tukey-Test) induziert. Vier Mäuse von zehn in PIT-Gruppe wurden vollständig durch die Behandlung geheilt (Abb. 2B). Das Überleben war in der PIT-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verlängert (n = 10 in jeder Gruppe, ** p < 0,0001, lang-Rank-Test und Wilcoxon-Test) (Abb. 2C). Diese Daten legen nahe, dass PIT signifikante Tumorreduktion und ein verlängertes Überleben verursacht in vivo
.
GFP-Fluoreszenz-Bildgebung nach In-vivo-PIT in der Flanke Xenograftmodell
PIT, GFP-Bildgebung in Echtzeit wurde in Mäusen mit N87-GFP bilateralen Flankentumoren (Abb. 3A) durchgeführt. GFP-Fluoreszenz zeigte Tumorlast und die Reaktion auf die PIT. GFP-Fluoreszenz wurde mit IR700 Fluoreszenz korreliert, die schnell verringert nach PIT (Abb. 3C). Gesamtfluoreszenzbildgebung (TFI) von GFP in unbehandelten Tumoren (Kontrolle) und in Tumoren Empfangen von Licht nur durch das Tumorwachstum erhöht. Bei Tumoren mit PIT behandelt, TFI von GFP allmählich verringert, in dem behandelten Tumor, während die entgegengesetzte Tumor in der gleichen Maus (iv nur, kein Licht) zeigten erhöhte GFP-Fluoreszenz (Abb. 3B).
Analyse wurde durchgeführt (Fig. 4A). Die PIT Effekt wurde mit einer Abnahme der Fluoreszenz IR700 (Fig. 4B) bestätigt. Unter dieser Bedingung GFP Intensität von ex vivo
Tumoren sank nach PIT (Fig. 4B). Diese Daten legen nahe, dass Echtzeit-GFP-Live-Bildgebung steht im Einklang mit ex vivo
Bildgebung.
GFP-Fluoreszenz-Bildgebung nach In-vivo-PIT in disseminierter Peritonealdialyse Modell
Diskussion
GFP-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht den vollständigen Prozess der Tumorentstehung, Behandlung, Regression, Metastasierung oder Rezidiv, zu im gleichen Tier ohne invasive Verfahren nachgewiesen werden [10], [11]. Durch die Zellen, die Zytoplasma-GFP, die Anti-Tumor-Effekte induziert durch PIT Verwendung leicht durch Extrusion von GFP aus behandelten Zellen überwacht werden könnte.
GFP-Fluoreszenz-Bildgebung überwacht werden.
Schlussfolgerungen
Abbildung S1.
Spezielle gezielte nekrotischen Zelltod beobachtet wurde nach PIT in vitro.
N87-GFP-Zellen mit 3T3 /DsRed (non-HER exprimierenden Zellen) co-kultiviert wurden. Sie wurden mit tra-IR700 behandelt und (vor und nach der Bestrahlung mit NIR-Licht) beobachtet. Gezielte spezifische nekrotischen Zelltod wurde bei einer Anregung mit NIR-Licht (nach 30 min) beobachtet. Kein Schaden wurde in 3T3 /DsRed Zellen demonstriert. . * 3T3 /DsRed Zellen, Bar = 25 &mgr; m
doi: 10.1371 /journal.pone.0113276.s001
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Abbildung S2.
Fluchtpunkt von GFP-Fluoreszenz bei 1 Tag nach PIT wurde beobachtet in vitro.
Abnehm GFP-Fluoreszenzintensität bei 1 Tag nach PIT beobachtet wurde, in einer Art und Weise auf der Lichtdosisabhängig zu sein. Bar = 100 &mgr; m. Die schwarze Linie am Rand war die Markierung, um die Position der Beobachtung zu bestimmen
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Abbildung S3.
Verringerungen der GFP-Fluoreszenz bei 1 Tag nach PIT mittels Durchflusszytometrie bewertet. Abnehmende GFP-Fluoreszenzintensität bei 1 Tag nach PIT in einer Art und Weise auf die Lichtdosis von Durchflusszytometrie-Analyse abhängig war
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Abbildung S4.
In-vivo-
Fluoreszenzbildgebung in Reaktion auf wiederholte PIT im Modell Peritonealdialyse verbreitet Mäusen. In-vivo-
Fluoreszenzbildgebung in Reaktion auf wiederholte PIT. IR700 Fluoreszenz wurde als Reaktion auf PIT verringert
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(TIFF)
Video S1.
Zeitraffer DIC Bilder einer N87-GFP Zelle von PIT behandelt. Zeitraffer-sequenziellen DIC Bilder (Video) eines N87-GFP-Zelle zeigt morphologische Veränderungen der Zelle nach NIR-Licht-Bestrahlung in Zellen mit tra-IR700 behandelt (25 min Beobachtung insgesamt). Blinkleuchte ist NIR-Licht-Bestrahlung (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s005
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Video S2.
Zeitraffer-PI Fluoreszenzbilder eines N87-GFP Zelle von PIT behandelt. Zeitraffer-sequenziellen PI Fluoreszenzbilder (Video) zeigt eine schnelle Membranschädigung eines N87-GFP Zelle nach NIR-Licht-Bestrahlung in Zellen mit tra-IR700 behandelt (25 min Beobachtung insgesamt). Blinkleuchte ist NIR-Licht-Bestrahlung (2 J /cm 2)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113276.s006
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Darmmikroben in Wespen helfen, Pestizide zu überwinden
Forscher hoffen, dass innerhalb von fünf Jahren ein Bluttest zur genauen Diagnose von Fibromyalgie verfügbar sein könnte
Allergien im Zusammenhang mit einem höheren Junk-Food-Konsum,
Forscher manipulieren Bakterienarten im Darm mit der Nahrung
Genetisches Risiko für Autoimmunität kann mit Unterschieden im Darmmikrobiom zusammenhängen
Probiotika können in den nächsten zwei Jahrzehnten helfen, Mangelernährung einzudämmen.
Darmstärkende Nahrung kann der Unterernährung bei Kindern weltweit ein Ende setzen
Forscher haben eine neue Art von Nahrung entwickelt, die die Darmbakterien bei unterernährten Kindern verbessert und das Wachstum besser ankurbelt als eine herkömmliche Nahrungsmitteltherapie.
Tests für die GERD-Diagnose
Bei einigen Patienten, wir können eine gastroösophageale Refluxkrankheit vermuten, aber die Symptome des Patienten können atypisch sein. Oder wir müssen vielleicht einfach unsere Diagnose bestätigen.
Neues Tool zur Entschlüsselung des Darmmikrobioms
Die Millionen von Bakterien im Darm spielen eine sehr wichtige Rolle für Gesundheit und Krankheit. Jedoch, ein ständiges Thema war das fehlende Verständnis der tatsächlichen Zusammensetzung des gesund