PLoS ONE: comparativa Proteomica Analisi del cancro gastrico Stelo Cells

Astratto

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono responsabili per la progressione del cancro, metastasi e recidive. Fino ad oggi, i marcatori specifici di cellule staminali tumorali rimangono da scoprire. Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare nuovi biomarcatori di CSC gastrici per la diagnosi clinica utilizzando la tecnologia proteomica. cellule CSC-come SP, cellule OCUM-12 /SP, cellule OCUM-2MD3 /SP, ed i loro genitori OCUM-12 cellule e cellule OCUM-2MD3 sono stati utilizzati in questo studio. lisati proteici da ciascuna linea cellulare sono stati analizzati utilizzando Qstar Elite cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem, insieme con tag isobariche per la tecnologia quantificazione relativa e assoluta. proteine ​​candidate rilevati dalla tecnologia proteomica sono stati convalidati da analisi immunoistochimica di 300 tumori gastrici. Sulla base dei risultati di LC-MS /MS, otto proteine, tra cui RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, e KRT18, sono up-regolati in entrambi-12 OCUM cellule /SP e OCUM-2MD3 /SP cellule rispetto ai loro celle principale corrispondente. analisi RT-PCR ha indicato che il livello di espressione di RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, e CK18
era alto nel OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 /SP, in confronto con il controllo del genitore OCUM-12 e OCUM-2MD3. Queste proteine ​​sono risultate significativamente associate con la profondità avanzata invasione, metastasi linfonodali, metastasi a distanza, o fase clinica avanzata. espressione RBBP6, DCTPP1, HSPA4, e ALDOA in particolare erano significativamente associati ad una prognosi sfavorevole nei 300 pazienti di cancro gastrico. RBBP6 era determinato a essere un fattore prognostico indipendente. La capacità motilità-stimolante di OCUM-12 cellule /SP e cellule /SP OCUM-2MD3 è stata inibita da RBBP6
siRNA. Questi risultati potrebbero suggerire che gli otto proteine, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, e KRT18, utilizzando l'analisi proteomica comparativa, sono stati percepiti come potenziali marcatori CSC di cancro gastrico. Degli otto proteine ​​candidate, RBBP6 stato suggerito di essere un marcatore prognostico promettente e un obiettivo terapeutico per il cancro gastrico

Visto:. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) comparata Proteomica Analisi del cancro gastrico cellule staminali. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736

Editor: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama a Birmingham, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 3 Maggio, 2014; Accettato: 16 settembre 2014; Pubblicato: 7 novembre 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

disponibilità dei dati:. Il autori confermano che tutti i dati sottostanti i risultati sono completamente disponibili senza restrizioni. Tutti i dati rilevanti sono all'interno del suoi file informazioni di supporto carta e. numeri di adesione per i dati della proteina sono inclusi come UniProt /Swiss-Prot nella Tabella 2.

Finanziamento: Questo studio è in parte finanziato dal KAKENHI (Grant-in-Aid per la ricerca scientifica, nn 22.390.262, 23.390.329 e 26.293.307. ), dal Fondo nazionale Cancer center di ricerca e sviluppo (23-A-9), e da priorità Fondo di ricerca di Osaka City University. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

le cellule staminali tumorali (CSC) sono definiti come una sottopopolazione unico nei tumori che possiedono la capacità di avviare la crescita del tumore e sostenere auto-rinnovamento [1]. E 'stato proposto che possono causare lineage eterogenea di cellule tumorali che costituiscono il tumore e svolgere un ruolo importante nella progressione maligna del carcinoma, come metastasi a distanza, recidiva e chemioresistenza [2] - [4]. CSC sono stati inizialmente identificati nella leucemia mieloide acuta [5], ma sono stati recentemente riportati esistere in un'ampia varietà di tumori, tra cui il cancro gastrico [6]. L'identificazione di marcatori CSC può aprire una nuova prospettiva terapeutica sulla base di targeting selettivamente questa piccola frazione di cellule [7], [8]. Recentemente, è stato riportato che CSC possibilmente fare esprimere i propri marcatori unici, come l'aldeide deidrogenasi 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], e CD133 [12]. Tuttavia, molti dei marcatori pubblicati non sono unici al CSC. Quantitativa espressione della proteina profilazione permette l'identificazione efficiente dei valori di espressione differenziali accurate e riproducibili per le proteine ​​[13]. tag isobariche per relativa e assoluta quantificazione (iTRAQ) in combinazione con la cromatografia liquida multidimensionale (LC) e spettrometria di massa tandem (LC-MS /MS) analisi sta emergendo come un potente metodo per la ricerca di biomarcatori tumorali [14]. Abbiamo precedentemente riportato che le cellule popolazione lato (SP) sono in grado di auto-rinnovano e producono cellule non-SP, e che le cellule tumorali in frazioni SP possiedono un elevato potenziale di tumorigenicità, metastasi a distanza [3], e chemioresistenza [2]. Ciò suggerisce che le cellule SP di cancro gastrico possiedono proprietà simili alle cellule staminali del cancro. Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di individuare un nuovo marcatore CSC (s) di cancro gastrico confrontando i proteomi tra cellule madre e le cellule staminali SP cellule simili che sono stati conosciuti per possedere una ricca popolazione CSC [15].

Materiali e Metodi

Cell Culture

Due linee di cellule di cancro gastrico, OCUM-2MD3 [16] e OCUM-12 [17], sono stati utilizzati in questo studio. Queste linee cellulari sono state derivate da diffuso tipo di cancro gastrico. La condizione della cultura è stato coltivato in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, Nikken, Kyoto, Giappone) con il 10% inattivato al calore siero fetale di vitello (FCS, Life Technologies, Grand Island, NY), la penicillina e la streptomicina, e 0,5 mM di sodio piruvato, e incubate a 37 ° C. linee di cellule /SP OCUM-12 /SP e OCUM-2MD3 erano cellule SP che sono stati valutati da una analisi di citometria a flusso utilizzando Hoechst 33342 dalle loro linee di cellule madri, OCUM-2MD3 e OCUM-12, rispettivamente. Ordinando è stata eseguita tre volte per stabilire una popolazione stabile di cellule SP-arricchito. Dopo un periodo di tre mesi di incubazione post-smistamento, OCUM-12 cellule /SP (6,5%) e cellule /SP OCUM-2MD3 (12,2%) rappresentano ancora una percentuale elevata della frazione SP, rispetto al genitore OCUM-12 (3,2% cellule) e OCUM-2MD3 (6,3%) (Figura S1). Successivamente, queste cellule SP-arricchita con una popolazione stabile sono state le linee cellulari utilizzati per l'analisi, come riportato in precedenza [18].

I campioni di tessuti umani e Informazioni paziente

I campioni di tessuto sono stati ottenuti da 300 pazienti con diagnosi di gastrici operazioni consentite cancro a Osaka City University. La tabella 1 mostra le caratteristiche clinico-patologiche dei 300 pazienti affetti da cancro gastrico. Ci sono stati 208 92 pazienti maschi e femmine, con l'età media di 64 anni (range 28-85 anni) al momento dell'operazione. Le diagnosi sono state confermate da almeno due persone. Messa in scena è stata determinata in accordo con la classificazione giapponese di carcinoma gastrico (14 ^{° edizione) [19]. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico City University di Osaka (Osaka, Giappone). Consenso informato scritto dal donatore è stato ottenuto per l'uso di questo campione nel campo della ricerca.}

proteine ​​identificazione e la quantificazione da /MS

Le cellule tumorali Qstar Elite LC-MS (60 mg ciascuno) sono stati omogeneizzati e quindi lisate utilizzando 100 ml di tampone T-PER lisi (Thermo Scientific) o 500 ml di 9 M Urea e 2% CHAPS tampone di lisi con un inibitore della proteasi. Successivamente, il lisato cellulare è stato poi trattato con ultrasuoni. Dopo l'acetone precipitazioni, concentrazioni di proteine ​​sono stati misurati con BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Riduzione, alchilazione, la digestione, e la successiva etichettatura peptide di 50 mg di proteine ​​per ogni campione sono state eseguite utilizzando il kit AB Sciex iTRAQ reagente Multi-Plex (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. I campioni iTRAQ-marcati sono stati caricati su una cartuccia di scambio cationico ICAT (AB Sciex). I peptidi sono stati eluiti in sei frazioni (1 mL di soluzione di KCL 10, 50, 70, 100, 200, e 350 mM), e il supernatante di ciascuna viene evaporato in una centrifuga a vuoto. I campioni sono stati poi dissalata e concentrati usando cartucce Sep-Pak Luce C18 (Waters Corporation, Milford, MA), evaporati in una centrifuga a vuoto, risospese in 20 ml di 0,1% (v /v) di acido formico, e successivamente applicati su Qstar Elite LC -MS /MS. Ciascun campione è stato analizzato per 150 minuti. dati MS /MS è stato cercato nel database svizzero Protein (umano) utilizzando il software ProteinPilot (versione 2.0, AB Sciex) con tripsina impostato come l'enzima digestione e methanethiosulfinate metile come la modifica cisteina. Al fine di rimuovere colpi ridondanti e quantitativa comparata, i risultati della ricerca ottenuti sono stati ulteriormente elaborati dal software ProteinPilot utilizzando l'algoritmo Paragon. Ciò ha provocato il set minimo di proteine ​​identificate giustificabili. Tutti i dati riportati è stato utilizzato con un limite di cut-off del 95%. quantificazione relativa di peptidi è stato calcolato come rapporto dividendo l'intensità giornalista iTRAQ. I rapporti di peptidi che supportano l'esistenza di una proteina sono stati mediati per la quantificazione della proteina relativa. In seguito, l'analisi analisi ProteinPilot e via Ingenuity (IPA) (Ingenuity sistema, Mountain View, CA) sono state eseguite. Dopo aver eseguito un t-test semplice su uno dei rapporti proteici medi calcolati contro 1 per valutare la validità delle proteine ​​cambiamenti di espressione, è stato segnalato un valore p. rapporti proteina con un p-value inferiore a 0,05 sono stati considerati attendibili. Dovrebbe essere noto che nel 90% delle prove sperimentali iTRAQ fatto in precedenza, le deviazioni standard dei rapporti di proteine, che derivano da varianti tecniche, sono stati segnalati per essere inferiore a 0,3. Pertanto, espressione cambia maggiore di 1,2 volte o inferiore a 0,8 volte dei livelli di espressione normalizzati sono stati considerati al di fuori del range di variabilità tecnica. Abbiamo anche effettuato un'analisi non etichettati, e rilevato la presenza di proteine ​​solo all'interno OCUM-12 cellule /SP e cellule /SP OCUM-2MD3, ma non all'interno delle cellule madre [21]. Ciascun campione è stato analizzato due volte. La applicata LC-MS /MS esame insieme con la tecnologia iTRAQ stato segnalato come un metodo quantitativo affidabile per l'espressione della proteina, essendo ancora più sensibile di quanto il Western Blot, che dipende dal tipo di anticorpi applicate [22].

IPA e selezione delle proteine ​​candidate

il database IPA viene utilizzato principalmente nel campo dell'ontologia proprietaria, contenente fino a 300.000 articoli biologici tra geni, proteine, molecolari e processi cellulari. Pertanto, IPA è stato impiegato per l'analisi di proteine ​​funzioni molecolare, localizzazione. Inoltre, è stato ottenuto informazioni dettagliate per quanto riguarda le funzioni e le posizioni cellulari delle proteine ​​identificate. Sulla base dei risultati di LC MS /MS e analisi IPA, proteine ​​che sono stati osservati essere sovraespresso in SP linee cellulari, rispetto ai loro corrispondenti frequenze di espressione in madri linee cellulari, sono stati selezionati come biomarcatori candidati cellule SP del cancro gastrico. L'identificazione di reti di proteine ​​interagenti, così come gruppi funzionali e percorsi stato generato da IPA, e l'analisi dipende dalle associazioni precedentemente caratterizzati.

quantitativa in tempo reale Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR )

cellule di cancro gastrico sono state coltivate. E l'RNA cellulare totale è stato estratto utilizzando RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA è stato preparato da 2 mg di RNA usando primer casuali (Invitrogen). Per determinare le variazioni piega in ogni gene, RT-PCR è stata effettuata sulla ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), con saggi di espressione genica in commercio (Applied Biosystems) per RBBP6
( legame proteina retinoblastoma 6
; Hs00544663), HSPA4
( shock termico 70kDa proteina 4
; Hs00382884), HSPA9
( heat shock 70 proteina di kDa 9
; Hs00269818), GLG1
(Golgi glicoproteina 1; Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrophosphatase 1
; Hs00225433), VPS13A
( proteine ​​vacuolare smistamento 13 omologo A
; Hs00362891), CK18 (cheratina 18
; Hs028

• PLoS ONE: Photoimmunotherapy di cancro gastrico peritoneale carcinosi in un modello murino
• PLoS Genetics: linea germinale mutazioni nel MAP3K6 sono associati con Familial cancro gastrico