PLOS ONE: Podocalyxin como marcador pronóstico en gástrico Cancer

Extracto

Antecedentes

Podocalyxin tipo 1 (Podxl) es una glicoproteína de adhesión celular asociada con el fenotipo tumoral agresivo y mal pronóstico en varias formas de cáncer. El objetivo de este estudio fue investigar la expresión Podxl en el cáncer gástrico mediante el uso de dos anticuerpos diferentes.

Métodos

Por micromatrices de tejido tumoral y la inmunohistoquímica que evaluamos la expresión Podxl en muestras tumorales de 337 pacientes que se sometieron a cirugía para el adenocarcinoma gástrico en el hospital Universitario de Helsinki. Se han utilizado dos anticuerpos diferentes:. HPA2110, que es un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal de la casa llamada HES9, para investigar la asociación de la expresión Podxl con variables clínico-patológicas y la supervivencia del paciente

Resultados

Podxl tinción fue positiva por el anticuerpo policlonal en 153 (57,5%) casos y por el anticuerpo monoclonal en 212 (76%). la expresión de anticuerpos policlonales se asoció con el tipo de cáncer intestinal (p < 0,001). tinción de anticuerpos monoclonales se asoció con la edad mayor de 66 (p = 0,001), con el cáncer intestinal (p < 0,001), y con el tamaño de tumor pequeño (≤ 5 cm; p = 0,024). Ambos anticuerpos se asociaron con fracción de alto fase S (p = 0,022; p = 0,010), y el índice de proliferación tumoral alta (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). Podxl positividad por el anticuerpo policlonal indicado redujo la supervivencia a los 5 años gástrica-cáncer-específica del 24,0% (IC del 95%: 16,9-31,1), en comparación con el 43,3% (IC 95% 33,7-52,9) de los pacientes con negatividad Podxl (p = 0,001 ). El resultado permaneció significativo en el análisis multivariable. (HR = 3,17; IC del 95%: 1,37 a 7,34; p = 0,007)

Conclusión

En el cáncer gástrico, Podxl expresión por parte del HPA2110 anticuerpo policlonal es una marcador independiente de mal pronóstico

Visto:. Laitinen A, C Bockelman, Hagström J, Kokkola A, C FERMER, Nilsson O, et al. (2015) Podocalyxin como marcador pronóstico en el cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada |

Recibido: 15 Septiembre, 2015; Aceptado: 29 Noviembre 2015; Publicado: 16 de diciembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Laitinen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de Finska Läkaresällskapet, la Fundación Kurt och Doris Palander, la Fundación Sigrid Jusélius, y Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB y Onson Consulting prestado apoyo en forma de salarios de los autores CF y seguir, pero no tenían ninguna función adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

en las últimas décadas, la incidencia de cáncer gástrico ha disminuido, especialmente en los países occidentales, al parecer debido a la la disminución de la incidencia de Helicobacter pylori
, para una mejor higiene, y para vivir con menos gente. Dado que el cáncer gástrico tiene un mal pronóstico, sigue siendo globalmente la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer [1]. La tasa de supervivencia a 5 años, a pesar de la cirugía curativa, es sólo alrededor de 10-30% [2]. La alta mortalidad se debe principalmente a un diagnóstico tardío.

El Nodo Metástasis (TNM) UICC tumor es, con mucho, el sistema de clasificación de pronóstico más coherente en la actualidad. Sin embargo, incluso dentro de los mismos tumores del grupo etapa, el curso de la enfermedad puede variar. La creación de métodos para la evaluación más precisa de la agresividad neoplasia sería de gran ayuda al momento de evaluar el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico individuales.

Podocalyxin tipo 1 (Podxl) es una glicoproteína transmembrana anti-adhesivo que pertenece a la familia CD34 . Se expresa normalmente por los podocitos renales [3], las células progenitoras hematopoyéticas [4], endotelios vasculares [5], y las células epiteliales de mama [6].

El significado clínico de Podxl en la progresión del cáncer se ha investigado en diversos tipos de carcinoma, primero como un marcador de células madre en el cáncer testicular [7]. Un hallazgo más tarde es que la expresión Podxl de células tumor-específica está asociada con un fenotipo más agresivo y resultado adverso en varios tipos de cáncer, por ejemplo, en mama [6], de próstata [8], ovárico [9], colorrectal [10- 12], urotelial de vejiga [13], de páncreas [14], y el cáncer periampular [15].

El objetivo de este estudio fue investigar la expresión Podxl en el cáncer gástrico para revelar su posible papel en la agresividad y el pronóstico. Decidimos usar dos anticuerpos que reconocen diferentes epítopos Podxl: un anticuerpo monoclonal HES9 de la casa y un anticuerpo policlonal HPA2110 disponible en el mercado. Recientemente nos enteramos de que estos dos anticuerpos son marcadores independientes de mal pronóstico en el cáncer colorrectal [12]. Los dos anticuerpos pueden reconocer dos grupos de pacientes con cáncer colorrectal, ambos de los cuales tienen un mal pronóstico; uso combinado de estos anticuerpos reveló un grupo de pacientes con peor pronóstico [16].

Materiales y Métodos

Los pacientes

En el estudio participaron 337 pacientes consecutivos que se sometieron a cirugía para el histológicamente verificado adenocarcinoma gástrico en el Departamento de Cirugía, hospital de la Universidad de Helsinki, de 1983 a 1999. el diagnóstico y la estadificación según la clasificación de la UICC proporcionado 100 (29,7%) en estadio IA-IB, 41 (12,2%) en estadio II, 96 (28,5%) el estadio IIIA-IIIB y 100 (29,7%) pacientes en estadio IV. metástasis de ganglios linfáticos ocurrido en 184 (55%) y las metástasis a distancia en 93 (28%) de los casos. La mediana de edad fue de 66 años (rango 30 a 87), y 163 (48%) eran mujeres y 174 (52%) hombres. gastrectomía total o parcial con linfadenectomía extendida (D2-D2 +) se realizó en 34 (10%) pacientes, gastrectomía total con D1-linfadenectomía en 161 (48%), y la gastrectomía subtotal con D1-linfadenectomía en 142 (42%). En total, 143 (43%) pacientes fueron operados con intención curativa, mientras que 176 (52%) fueron sometidos a cirugía paliativa. Ninguno recibió tratamiento neoadyuvante, pero 32 (9%) pacientes recibieron tratamiento adyuvante postoperatoria (28 quimioterapia, la radioterapia 2; 2 recibieron ambos). Los datos de supervivencia y causa de la muerte hasta noviembre de 2013 procedían de registros de pacientes, el Centro de Registro de Población de Finlandia, Finlandia y Estadística.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Quirúrgica del Hospital Universitario de Helsinki (ONR SUH 226 /E6 /06, la extensión TMK02 §66 04/17/2013) y la Autoridad Nacional de Supervisión del Bienestar y la Salud dio permiso para usar las muestras de tejido sin el consentimiento individual en este estudio retrospectivo (Valvira DNRO 10041 /06.01.03.01 /2012).

las muestras de tejido

fijados con formalina y muestras de tejidos quirúrgicos incluidos en parafina provienen de los archivos del Departamento de Patología. Los tejidos del paciente se aplica el anonimato y se analizaron de forma anónima. Punto de vista histopatológico se definieron áreas representativas de las muestras de tumor y marcadas en las diapositivas haematoxylin- y eosina. Tres núcleos de cada bloque del tumor se muestrearon con pegadores de 0,6 mm y embebidos en un nuevo bloque de parafina por un microarrayer tejido semi-automático (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.). De los seis bloques de tejido de matriz preparadas, cada una contenía 24-192 muestras tumorales. Las secciones de 4 micras, cada uno se cortaron y se procesaron para inmunohistoquímica.

Los anticuerpos

Se han comparado dos anticuerpos Podxl contra diferentes epítopos. El anticuerpo policlonal (HPA2110, Antibodies Atlas, Estocolmo, Suecia) se elevó contra un péptido con los residuos de aminoácidos 278 a 415 de Podxl, y el anticuerpo monoclonal HES9 en-casa [12] reconoce los residuos de aminoácidos 189 a 192 de Podxl . Ambos epítopos se producen en la parte extracelular de la molécula Podxl. La secuencia del epítopo HPA2110 tres partidos de proteínas variantes de empalme Podxl de codificación con un 100% (Podxl 001, 005 y 201, la proteína humana Atlas). La cuarta variante de empalme coincide con el 87% (Podxl 202). Las secuencias de epítopo de la HES9 partidos 100% con todas las variantes de empalme. Los anticuerpos se describen en detalle [12,17,18].

La inmunohistoquímica

Las secciones fueron fijadas en portaobjetos y se secaron durante 12 a 24 horas a 37 ° C, y luego se deparaffinized en xileno y rehidratada a través gradualmente decrecientes concentraciones de etanol a agua destilada. Para la recuperación de antígenos, las secciones se tratan en un módulo de tratamiento previo (Lab Vision Corp., Fremont, CA, EE.UU.) en tampón Tris-HCl (pH 8,5) durante 20 minutos a 98 ° C. Las secciones fueron teñidas en un Autostainer 480 (Lab Vision) por el sistema de detección de Dako EnVision VERDADERO, peroxidasa /DAB +, conejo /ratón (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las diapositivas fueron tratados durante 5 minutos con 0,3% Solución Dako VERDADERO peroxidasa-bloqueo para bloquear las peroxidasas endógenas. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo policlonal (dilución 1: 250 = 2,5 mg /ml) o anticuerpo monoclonal (dilución 1: 500 = 5 mg /ml) a temperatura ambiente. Como control positivo para cada serie de tinción se utilizó muestras de tejido renal.

Scoring de inmunorreactividad

HPA2110 y immunopositivity HES9 se calificó en todos los núcleos tumorales disponibles. Podxl citoplasmática y immunopositivity HES9 se puntuó como 0 a 3 basándose en la intensidad de la inmunorreactividad de las células cancerosas, y la puntuación más alta de los tres núcleos sirven para su posterior análisis. inmunoreactividad negativo se puntuó como 0, difusa débil positividad citoplasmática como 1, moderadamente positiva o intensidad focalmente fuertemente positiva como 2, y la intensidad homogénea fuerte como 3. Todas las muestras se puntuaron de forma independiente por dos investigadores (AL) y JH estaban cegados al estado clínico y los resultados datos. Se volvió a evaluar las muestras con resultados discordantes sobre, y la puntuación de consenso sirvieron para su posterior análisis. Hemos sido capaces de procesar y marcar HPA2110 tinción en 266 y HES9 tinción en 279 muestras.

El análisis estadístico

Las asociaciones entre HPA2110 y HES9 positividad y las variables clínico-patológicas se evaluaron mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Las correlaciones entre los dos anticuerpos Podocalyxin se evaluaron mediante la prueba de correlación de Spearman. la supervivencia específica de la enfermedad se calculó a partir de la fecha de la cirugía a la muerte por cáncer gástrico.

Las curvas de supervivencia se construyeron de acuerdo con el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de rango logarítmico. Para el análisis de supervivencia univariable y multivariable, el modelo de riesgo proporcional de Cox tenía las siguientes covariables entraron: edad, sexo, estadio, grado, clasificación Laurens, el tamaño del tumor, localización del tumor, la expresión Podxl determinado por HPA2110 tinción y coloración HES9, la ploidía del ADN, S- fracción de fase, Ki-67 expresión, y la expresión de p53. Estadio, el grado, la clasificación Laurens, el tamaño del tumor, la ploidía del ADN, la fracción de la fase S, y la expresión de Podxl, HES9, Ki-67 y p53 se introdujeron como covariables categóricas. la ploidía del ADN y la fracción de la fase S se habían evaluado anteriormente por citometría de flujo, y p53, y la expresión tejido Ki-67 por inmunohistoquímica [19,20]. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron con IBM SPSS Statistics versión 20.0 para Mac (IBM Corporation, Armonk, Nueva York, EE.UU.).

Resultados

La inmunohistoquímica

reactividad citoplasmática HPA2110, evaluados en 266 casos, fue negativo en 113 (42,5%), débilmente positiva en 120 (45,1%), moderadamente positiva en 29 (10,9%), y fuertemente positiva en 4 (1,5%) casos. De los 279 casos teñidas con éxito para la expresión citoplasmática por HES9, 67 (24,0%) fueron negativos, 137 (49,1%) débilmente positivo, 54 (19,4%) moderadamente positiva, y 21 (7,5%) fuertemente positiva. En el análisis final, débil a fuertemente HPA2110 positivo y HES9 inmunoreactividad (puntuaciones 1-3) fue considerada como la expresión positiva. Imágenes representativas de immunostainings están en la figura 1. Tanto HPA2110 y HES9 tiñeron de manera uniforme por todo el citoplasma, con immunopositivity membranosa nuclear, ni celular apreciable. La expresión citoplasmática de Podocalyxin por los dos anticuerpos diferentes HPA2110 y HES9 correlacionada (r _{s = 0,455, p < 0,001, de correlación de Spearman).}

Asociación de HPA2110 y HES-9 con variables clinicopatológicas y biomarcadores

Las asociaciones de HPA2110 y HES9 con variables clinicopatológicas y biomarcadores moleculares fueron los siguientes: positivos (puntuación 1-3) tinción HPA2110 se asoció con el tipo de cáncer intestinal (p < 0,001), tinción positiva HES9 se asoció con edad mayor de 66 (p = 0,001), con el cáncer intestinal (p < 0,001), y con el tamaño pequeño (≤ 5 cm) del tumor (p = 0,024). Tanto HPA2110 y HES9 se asociaron con fracción de la fase S alta (SPF, p = 0,022; p = 0,010) y de alto índice de proliferación del tumor (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (Tablas 1 y 2).

Los análisis de supervivencia

expresión positiva HPA2110 indicaron a 5 años de supervivencia específica del cáncer gástrico del 24% (IC del 95%: 16,9-31,1), en comparación con los pacientes con tinción negativa con HPA2110 5 años la supervivencia del 43% (IC del 95%: 33,7 a 52,9) (p = 0,001 log-rank test) (figura 2 y Tabla 3). La supervivencia a 5 años específico del cáncer gástrico de los pacientes con tumor de tinción HES9-positivas fue del 30% (IC del 95%: 23,1-36,1), y para aquellos con tinción negativa, el 40% (IC 95% 27,7-52,1; p = 0,130 log prueba -rank) (figura 2).

en el análisis de subgrupos, HPA2110 fue un importante marcador de mal pronóstico en los grupos de pacientes más jóvenes (edad menores de 66 años) (p = 0,006), y para el género masculino (p = 0,002), el cáncer de tipo difuso (p = 0,001), y pacientes en estadio I (p = 0,048) (figura 3 y Tabla 3). En los otros subgrupos estudiados, HPA2110 no sirvió como marcador pronóstico

La expresión HPA2110 siguió siendo significativa en el análisis multivariable. (HR = 3,17; IC del 95% 1,37 a 7,34; p = 0,007; Tabla 4). Otros factores pronósticos independientes en el análisis multivariable fueron el estadio, grado y la ploidía del ADN.

Discusión

Hemos demostrado que la supervivencia a los 5 años de cáncer específico fue significativamente mejor en los pacientes con cáncer gástrico tienen un Podxl -negativo tumoral. En realidad, entre la etapa 1 en pacientes con tumores Podxl-negativas, sólo un paciente murió de cáncer. En el análisis multivariable, la expresión Podxl positivo sirvió como un marcador independiente de mal pronóstico. expresión Podxl positiva tanto por el HPA2110 anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal HES9 se asoció con SPF alto por citometría de flujo y Ki-67 tinción, siendo ambos marcadores de alta proliferación de células cancerosas y por lo tanto de peor pronóstico.

Positivo expresión de Podxl por ambos anticuerpos se asoció con el tipo de cáncer intestinal, pero un tumor Podxl-negativo resultó no ser un marcador de pronóstico en el cáncer intestinal. A la inversa, 5 años de supervivencia específica del cáncer en el subgrupo de cáncer de tipo difuso fue significativamente peor en los pacientes con un tumor Podxl-positivo. En general, el cáncer de tipo difuso se ha asociado con un peor pronóstico que tiene el tipo intestinal [21].

A lo mejor de nuestro conocimiento, somos los primeros en informar de un valor pronóstico para Podxl en el cáncer gástrico. Esto ha sido evidente durante varios otros tipos de cáncer, como de mama [6], de próstata [8], ovárico [9], colorrectal [10-12], vejiga urotelial [13], de páncreas [14], y el cáncer periampular [15] . Un estudio sobre el cáncer colorrectal muestran concordancia entre tumores primarios y metástasis en los ganglios linfáticos correspondientes en pacientes individuales, y la expresión Podxl también se ve afectado por la radioterapia neoadyuvante. Estos hallazgos apoyan la utilidad clínica de Podxl como un marcador de mal pronóstico [22]. Aquí no estudiamos la expresión Podxl de metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer gástrico, y ninguno de los pacientes en esta cohorte recibido quimioterapia preoperatoria, aunque es actualmente bastante rutinaria. Estos efectos de la quimioterapia preoperatoria sobre la expresión Podxl en el cáncer gástrico requiere una evaluación adicional.

Se han utilizado dos anticuerpos que reconocen Podxl, un anticuerpo policlonal HPA2110 disponible en el mercado y un anticuerpo monoclonal de la casa HES9 [16]. Inmunoexpresiones por el HES9 anticuerpo monoclonal era más fuerte que por el anticuerpo policlonal. Ambos anticuerpos tiñeron uniformemente por todo el citoplasma, y ​​ni núcleos ni membrana celular manchadas. La variedad en intensidad y distribución de tinción fue más leve cuando se utiliza el anticuerpo policlonal, haciendo que la puntuación más difícil. Básicamente Podxl es una molécula transmembrana, y por lo tanto fue sorprendente no encontrar en las membranas celulares en células de cáncer gástrico, ya sea por anticuerpo. El significado de citoplasmática, no membranosa, la expresión de Podxl, su papel y función, necesita una evaluación adicional.

Estos anticuerpos diferentes que utilizamos reconocer partes desiguales de la molécula Podxl, probablemente explica por qué su expresión en algunas de las especímenes diferían y los resultados no eran idénticos. Kaprio et al. [16], que se utiliza estos mismos anticuerpos en el cáncer colorrectal, y se encontró una diferencia interesante entre los patrones de tinción. La positividad anticuerpo policlonal era membranosa [9,10], pero la positividad del anticuerpo monoclonal fue evidente principalmente en el citoplasma. En el cáncer colorrectal, fuerte positividad tanto con el monoclonal y anticuerpo policlonal la reveló un subgrupo de pacientes con peor supervivencia. No hemos encontrado este tipo de correlación en muestras de cáncer gástrico. En general, la positividad en los pacientes con cáncer gástrico fue menor que en pacientes con cáncer de colon. En el cáncer colorrectal alrededor del 94% de los casos fueron positivos para Podxl con estos dos anticuerpos, mientras que en el cáncer gástrico positividad aparecido en 76% de los casos con el anticuerpo monoclonal y en el 58% con el anticuerpo policlonal. La frecuencia de Podxl positividad en el cáncer gástrico estaba cerca de la observada en los de mama y cáncer de ovario (40% y 67%) [6,9].

Podxl es una glicoproteína transmembrana. Se ha demostrado que las mucinas, que también son glicoproteínas, juegan un papel en la transición epitelial a mesenquimal (EMT) [23,24]. El papel de Podxl en el cáncer es desconocida, pero se puede especular que también Podxl puede tener un papel en la EMT. EMT puede explicar por qué los pacientes con una expresión de alto Podxl tienen una peor supervivencia.

La fuerza de este estudio es una gran cohorte de pacientes con cáncer gástrico y un seguimiento a largo plazo con el tiempo de seguimiento clínico fiable y datos de supervivencia. Mediante la técnica de TMA, sólo pequeñas áreas del tumor se evalúan en comparación con las secciones de todo el tejido. En el cáncer colorrectal, Larsson et al. [22] encontró que el uso de secciones enteras permitió la identificación de un mayor número de tumores como Podxl-positiva que hizo análisis TMA. Dado que la expresión Podxl es heterogénea, el uso de la técnica de TMA puede dar lugar a una subestimación de los casos positivos. La puntuación de ambos monoclonal-anticuerpo policlonal y expresión de anticuerpos fue para algunos especímenes difíciles; casos con sólo unas pocas células de cáncer y aquellos en los que el valor de las células cancerosas era no identificable fueron así excluidos del análisis. Esto, en parte, explica el elevado número de casos excluidos. Por otro lado, la técnica TMA permite el análisis de grandes cohortes de pacientes con un método de tinción homogénea.

En conclusión, Podxl inmunotinción sirve como un marcador independiente de mal pronóstico en el cáncer gástrico. Esto es, a nuestro entender, el primer informe sobre el valor pronóstico de la expresión Podxl en el cáncer gástrico. Los estudios futuros deben confirmar esta asociación y resolver los mecanismos por los cuales Podxl afecta el desarrollo y el comportamiento del cáncer gástrico.

Reconocimientos

gracias Päivi Peltokangas y Elina Aspiala por su excelente asistencia técnica.

• Tipos de cancer
• PLOS ONE: DBGC: Una base de datos de cáncer gástrico humano