PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktivoi NLRP3 Inflammasome ja Edistää Migration and Invasion mahasyöpä- Cells

tiivistelmä

Background

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis, M.hy
) liittyy kehittämiseen mahalaukun ja eturauhasen syöpiä. NLRP3 inflammasome, proteiinikompleksin ohjaamiseksi kypsymisen tärkeää proinflammatoristen sytokiinien interleukiini (IL) -1β ja IL-18, on myös kasvaimien syntyyn liittyvien ja etäpesäkkeiden eri syövissä.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

selventämään, M.hy
edistää kasvainten kehittymistä kautta inflammasome aktivointia, analysoimme monosyyttien IL-1β ja IL-18-tuotanto M.hy
haaste. Kun altistuu M.hy
, ihmisen monosyyteistä näytteillä nopea ja kestävä IL-1β ja IL-18-eritys. Olemme lisäksi havainneet, että lipidien kalvoproteiini (LAMP) kohteesta M.hy
oli vastuussa IL-1β induktio. Soveltamalla kilpailua estäjät, geenispesifisistä shRNA ja geenin kohdennettua hiiriä, olemme varmistaneet, että M.hy
indusoi IL-1β eritys oli NLRP3 riippuva in vitro
ja in vivo
. Katepsiini B aktiviteetti, K ^{+ efflux, Ca 2+ virtaa ja ROS tuotanto olivat kaikki tarvittavat NLRP3 inflammasome aktivointi M.hy
. Mikä tärkeintä, se on IL-1β, mutta ei IL-18 valmistettu makrofagien altistettiin M.hy
edistänyt mahasyövässä solujen vaeltamiseen ja invaasiota.}

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että aktivointi NLRP3 inflammasome mukaan M.hy
voi liittyä sen edistämiseen mahasyövän etäpesäke, ja anti- M.hy
terapia tai rajoittamalla NLRP3 signalointi voisi olla tehokas lähestymistapa valvontaan mahalaukun syövän kehitykseen.

Citation: Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et ai. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktivoi NLRP3 Inflammasome ja Edistää Migration and Invasion mahasyövän Cells. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10,1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Intia

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 06 syyskuu 2013; Julkaistu: 06 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 100 Talent Program Kiinan tiedeakatemia, Natural Science Foundation of China (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS stipendiohjelmassa sekä avustusta National Key ohjelmat Infectious Disease (2012ZX10002007-003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mykoplasmat ovat pleomorphic, seinä vapaa, prokaryoottisia organismeja, jotka sijaitsevat joko eukaryoottinen solukalvojen tai solujen sisällä, ja ne ovat pienimpiä organismeja pystyy itse lisääntymään [1]. Tähän mennessä ainakin 16 mykoplasmalajeja on eristetty ihmisistä [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) katsottiin ei-patogeeninen ihmisille, koska se yleensä tarttuu sika johtaa hengitysteiden sairauksien ja tulehdus rinnassa ja nivelet [3], [4] . Kuitenkin, varaamiseen todisteet osoittavat, että M.hy
infektio ihmisellä ei johda kliinisiä tuloksia. M.hy
todettiin 56% mahalaukun karsinooma, 55% paksusuolen syöpä ja 52,6% ja keuhkosyöpä koepaloja [5]. Lisäksi 36% miehillä eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) ja 52% miesten eturauhassyövän ovat M.hy
seropositiivinen. Nämä kliiniset havainnot viittaavat siihen mahdollisesta yhteydestä M.hy
altistuksen mahalaukun, paksusuolen, keuhko- ja eturauhassyövät [5], [6].

Kun mikrobi-infektion, isäntä hahmontunnistus reseptorit ( PRRS), kuten TLR tunnistavat taudinaiheuttajia ja käynnistää synteesin pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten pro-IL-1β ja pro-IL-18: n kautta NF-KB: n aktivaation. Samaan aikaan, toinen ryhmä PRRS lukien NLRP3 rekrytoida sovittimen proteiinin ASC ja johtaa kaspaasi-1, joka on aktiivinen proteaasi, joka pilkkoo esiaste sytokiinien muodossa, kuten pro-IL-1β ja pro-IL-18- kypsiksi, eritetyn muodon [7]. Taudinaiheuttajia tai haastava aineet aiheuttavat kaliumin ulosvirtausta, mitokondriot vahinko, mitokondriot DNA julkaisu, ROS tuotanto, solunsisäisen kalsiumin lisäys tai solujen syklisen AMP väheneminen synnynnäisen immuunijärjestelmän soluja, jotka kaikki osallistuvat kaspaasi-1 aktivointi [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Tänä prosessin NLRP3, ASC ja prokaspaasia 1 muodostavat molekyyli- alustan nimeltään inflammasome. Tähän mennessä useita inflammasomes on tunnistettu, ja Heille NLRP3 inflammasome on yhteydessä esiintyvistä kasvaimen kehittymisen [14], [15], vaikka kiistaa esiintyy eri mallit [16], [17]. Kuitenkin, IL-1β: n raportoitiin edistää kasvainsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden indusoimalla useita pro-metastaattisen geenejä, kuten matriksin metalloproteinaasien ja endoteelisolujen adheesiomolekyylien, sekä TGF-β, kemokiinit ja kasvutekijät [18]. Vuonna Korean väestö, yhdistelmä lisääntynyt limakalvon IL-1β tason ja homotsygoottisiksi IL-1β -31T yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) voivat molemmat aiheuttaa lisääntynyt riski mahasyövän [18]. Lisäksi Tu et al. havaittiin, että vatsa-ekspressio ihmisen IL-1β siirtogeenisissä hiirissä johtaa spontaaniin mahalaukun tulehdus ja syöpään [19], joka lisäksi viittaa siihen, että IL-1β voi edistää ihmisen mahasyövän. Sitä vastoin, IL-18 tehostaa NK-solujen aktiivisuutta, vähentää kasvaimen kehittymisen, indusoi apoptoosia ja estää angiogeneesin kasvainsoluissa käyttämään antituumorivaikutuksia [20], [21]. Lisäksi, sopimattoman IL-18: n havaittiin myötävaikuttaa patogeneesiin syöpien ja voi vaikuttaa kliiniseen lopputulokseen potilailla [22]. IL-18 oli raportoitu stimuloivan matriisi--9 tuotanto, mikä lisää muuttoliikkeen ja hyökkäyksen sepelvaltimon sileälihassolujen ja HL-60 myelooinen leukemia solujen [23], [24]. On myös raportoitu, että seerumin IL-18-tason mahasyövän potilasryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna mahahaava potilasryhmässä [25] ja IL-18 voi lisätä etäpesäke ja immuunijärjestelmän karkaamisen mahasyöpä kautta alas-säätely CD70 ja ylläpito CD44 ihmisen mahasyövän solulinjaa NCI-N87 ja SNU16 [26]. Se on myös tärkeä välittäjäaine VEGF-lisätä maastamuuttoa ihmisen mahasyövän solulinjoissa SNU-601 [27]. Edellä esitetyt havainnot osoittavat, että Mycoplasma hyorhinis
voi edistää muuttoliikettä ja invaasion mahasyövän solujen aktivoimalla inflammasome.

Toistaiseksi laaja kirjo mikrobeja kuten viruksia, bakteereita, sieniä ja alkueläimiä ovat olleet tunnistettu aktivoida NLRP3 inflammasome [28]. Tuore tutkimus osoitti, että Mycoplasma pneumoniae
kykeni myös indusoimaan IL-1β tuotantoa ihmisen soluissa [29]. Kuitenkin, onko M.hy
, joka on tärkeä tekijä mahalaukun syövän kehitykseen, kuten edellä on mainittu [5], [30], [31], aktivoi NLRP3 inflammasome ja onko tämä aktivointi edistää mahalaukun syöpä kehitys ei vielä tunneta. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että M.hy
laukaisi IL-1β eritystä NLRP3 inflammasome riippuvaisella tavalla, ja tuloksena IL-1β aiheuttama muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja.

tulokset

M.hy
käynnistimet IL-1β ja IL-18-tuotanto THP-1 solut

Voit selvittää M.hy
indusoi IL -1β tuotannon synnynnäisen immuunijärjestelmän solut, tarkkailtiin kypsän IL-1β tasot ihmisen monosyyttisolulinjassa THP-1-solut altistettiin eri määriä M.hy
. Tässä kokeessa vahva induktio IL-1β annoksesta riippuvalla tavalla ei havaittu (kuvio 1A). Seuraavaksi mittasimme pro-IL-1β mRNA-tasoja soluissa ja kypsän IL-1β-proteiinin tasot viljelmäsupernatanteissa eri ajankohtina sen jälkeen M.hy
haaste. Havaittiin, että IL-1β mRNA-tasot olivat korkeimmillaan 3 tuntia altistuksen jälkeen (kuvio 1 B) ja kypsän IL-1β (kuvio 1C) ja IL-18 (kuvio 1 D) proteiini oli korkeimmillaan 12 tuntia altistuksen jälkeen. Lisäksi, THP-1 johdettujen makrofagien on myös esillä vankka eritystä IL-1β, IL-18 sekä muiden inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-6 ja IL-8 (kuvio 1 E, kuvio S1). Vahvista yllä havainnoista THP-1-solulinjassa, tutkimme IL-1β tuotantoa ensisijainen ihmisen monosyyteissä terveiltä luovuttajilta altistettiin M.hy
, jossa IL-1β myös vahvasti aiheuttama (kuvio 1 F) . Nämä tulokset osoittivat, että M.hy
laukaisi vankka IL-1β ja IL-18-eritys ihmisen myeloidisoluissa.

LAMP johdettu M.hy
vastaa IL -1β induktio läpi TLR2

Seuraavaksi, tutkimme replikaatiota M.hy
vaadittiin IL-1β tuotantoa monosyyteissä. Kuten on esitetty kuviossa 2A, M
.hy
inaktivoitiin kuumentamalla tai UV-(UV) indusoi yhtä paljon IL-1β eritystä THP-1-soluja, kuten live M .hy
. Tämä osoitti, että tietyt lämpöä ja UV-kestävä komponentti M.hy
oli vastuussa induktion IL-1β eritystä. Lipid kalvoproteiini (LAMP) on ekspressoidaan runsaasti pinnalla M.hy
[32], ja edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että kalvo lipoproteiinien muista mykoplasmalajeja indusoi IL-1β eritystä [33]. Olemme siis arveltu, että M.hy
johdettu LAMP (MLAMP) voi olla vastuussa IL-1β induktio THP-1-soluissa. Sitten uutetaan LAMP päässä M.hy
(kuvio 2B) ja testattiin kyky MLAMP indusoida IL-1β eritystä THP-1-soluissa. Olemme havainneet, että MLAMP selvästi indusoimaa IL-1β annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas vesifaasi M.hy
uute ei voi tehdä niin (kuvio 2C). Jos haluat jättää mahdolliset RNA ja /tai DNA saastumisesta MLAMP, käsittelimme MLAPMs RNaasi ja DNaasia ja totesi, että MLAMP oli pääkomponentti IL-1β induktion (kuvio S2).

Kerrottiin, että MLAMP pääasiassa aktivoitu NF-KB kautta TLR2 ja TLR6 [34], [35]. Siksi meidän ensimmäinen soveltaneet TLR2 neutraloivan vasta-aineen T2.5 estää TLR2 signaali, jossa ConT2 toimii isotyyppikontrolli [36]. Kuten kuviossa 2D on esitetty, T2.5 täysin esti IL-1β eritystä stimuloitiin TLR2 agonistin P3CSK4 mutta ei sen TLR4-ligandin, LPS. Tärkeää on, IL-1β eritystä M.hy
infektoituja soluja voimakkaasti vähennetty T2.5, mikä osoittaa, että TLR2 oli mukana MLAMP laukaisi IL-1β eritystä ihmisen monosyyteissä. Mielenkiintoista on, että IL-1β: n eritys M.hy
infektoituja soluja ei täysin estänyt T2.5 (kuvio 2D), joka viittasi siihen, että TLR2-riippumaton signalointireitin oli mukana myös MLAMP laukaisi IL-1β eritystä, joka ansaitsee lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

M.hy
indusoi IL-1β eritys kautta aktivointi NLRP3 Inflammasome

Voit testata, onko M.hy
indusoi IL-1β eritystä inflammasome aktivointia, ensin hyödyntää LPS pohjustettu THP-1 johdettujen makrofagien tarkistamaan, onko M.hy
voi aktivoida inflammasome kuten ATP tai MSU, jotka tunnetaan inflammasome aktivaattoreita. Kuten on esitetty kuviossa 3A, M
.hy
kykeni indusoimaan IL-1β vapautumista pohjustettu soluissa. Seuraavaksi tutkimme pilkkominen kaspaasi-1 ja oligomerointi ASC, kaksi tärkeää päättäjät varten inflammasome aktivointia. Olemme havainneet, että M.hy
edistänyt pilkkominen kaspaasi-1 ja oligomerointi ASC (kuvio 3B), joka osoittaa suoraa aktivoitumista inflammasome mukaan M.hy.

Lisäksi testasimme M.hy
indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen tietyistä inflammasome komponentteja. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että tietyn kaspaasi-1-estäjä AC-YVAD-CHO laski IL-1β eritystä THP-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3C). Seuraavaksi, kun erityinen shRNA käytettiin vaientaa ilmentymistä kaspaasin 1 ja ASC (kuva 3D), IL-1β tuotanto laski voimakkaasti M.hy
haaste (kuvio 3E), mikä osoittaa, että M.hy
indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen kaspaasi-1: n ja ASC.

Sitten testasimme, onko NLRP3 vaadittiin M.hy
indusoi IL-1β eritystä. Ensimmäinen, olemme huomanneet, että NLRP3 estäjä Glybenclamide tukahdutetaan M.hy
indusoi IL-1β eritystä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3F) [37]. Kun erityiset shRNA käytettiin vaientaa ilmaus NLRP3 (kuvio 3G), IL-1β tuotanto laski voimakkaasti M.hy
haaste (kuvio 3H), mikä osoittaa, että M.hy
indusoi IL-1β eritys oli riippuvainen NLRP3. Tämä varmistettiin edelleen immunoblottaus, jossa kaspaasi-1 aktivointia ja IL-1β tuotanto olivat molemmat NLRP3 riippuvainen (kuvio 3I). Lisäksi olemme edelleen havainneet, että MLAMP oli pääkomponentti vastuussa NLRP3 inflammasome aktivoinnin M.hy
(kuvio S2C). Lisäksi, AIM2 inflammasome oli kuitenkin aktivoida DNA [38], ja olemme havainneet, että M.hy
DNA indusoi IL-1β erityksestä AIM2 inflammasome (kuvio S3A). Mielenkiintoista, M.hy
indusoi IL-1β eritys oli pääasiallisesti riippuvainen NLRP3, kun AIM2 oli vain osittain mukana (kuvio S3A). Yhdessä nämä tulokset osoittivat selvästi, että M.hy
indusoi IL-1β eritystä aktivoimalla NLRP3 inflammasome ihmisen monosyyttejä.

mekanismeista M.hy
Käynnistetty NLRP3 Inflammasome Activation

aktivointi NLRP3 inflammasome erilaisilla ärsykkeille riippuu katepsiini B toimintaa, K ^{+ efflux, kalsiumin ja /tai reaktiivisten happiradikaalien (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Tutkia mekanismeista IL-1β release vastauksena M.hy
haaste, ensin sovellettu katepsiini B-spesifinen estäjä CA-074 Me ja havaittu heikentyi merkittävästi IL-1β eritys upon M .hy
haaste. Pitoisuutena 100 uM, CA-074 Me täysin tukossa IL-1β release (kuva 4A). Tämä inhibitio ei johtunut myrkyllisiä vaikutuksia soluille kuin IL-8 eritystä vaikuta estäjä oli hyvin lievä (kuvio 4E). Tärkeää on, kun soluja käsiteltiin Katepsiini K: n estäjä I, väheneminen IL-1β eritys ei ollut selvää ollenkaan (kuvio 4B ja 4F), mikä viittaa siihen, että katepsiini B-aktiivisuus erityisesti mukana NLRP3 inflammasome aktivoinnin aikana M .hy
haaste. Lisäksi kun estänyt K + ulosvirtaus lisäämällä solunulkoinen K + pitoisuus, IL-1β eritystä THP-1-solujen upon M.hy
haaste väheni merkittävästi annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4C). Jälleen, ei ollut toksista vaikutusta KCL, kuten IL-8 tuotantoa samoista soluista normaali (kuvio 4G). Selvittää, onko kalsiumin auttoi inflammasome aktivointia, lisäsimme eri annoksilla EGTA solun elatusalustaan ​​ja se havaittiin, että EGTA hoito estää M.hy
indusoimaan IL-1β eritystä annoksesta riippuvalla tavalla, ja myrkyllisiä päivästä EGTA havaittiin osoituksena IL-8 tuotantoa (kuvio 4D ja 4H).}

Lisäksi testasimme M.hy
haaste indusoi ROS THP-1-soluissa . Tässä määrityksessä THP-1-soluja ensin ladataan redox-herkkien fluoroforin DCFDA ja altistettiin sitten M.hy
, ATP sisällytettiin positiivisena kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa 5A, 16,9% CM-H2DCFDA positiivisia soluja havaittiin 30 minuutin kuluttua M.hy
hoitoon verrattuna 1,6% käsittelemättömissä soluissa. Nämä tiedot osoittivat, että ROS saattavat edistää NLRP3 inflammasome aktivoinnin vastauksena M.hy
haaste. Voit tarkistaa tätä mahdollisuutta, esikäsittelimme THP-1-solujen ROS estäjän diphenyliodonium (DPI) 30 minuuttia, ja sitten haastoi solut M.hy
ennen mittausta IL-1β tuotanto 6 tuntia myöhemmin. Kuten odotettua, DPI vähentynyt huomattavasti M.hy
indusoi IL-1β release (kuvio 5B). Tuore tutkimus osoitti, että ROS-estäjä kuten DPI poistettava IL-1β vapautumista hiiren makrofageissa estämällä NLRP3 geeniekspressiota [40]. Siksi me myös seurataan mRNA taso pro-IL-1β ja NLRP3 alle DPI hoitoa. Olemme havainneet, että DPI vähensi huomattavasti ilmentymisen pro-IL-1β ja NLRP3 (kuvio 5C-D), joka oli yhdenmukainen sen havainnon kanssa, hiiren soluihin [40]. Lisäksi olemme myös tutkinut kaspaasi-1 ja totesi, että pieninä annoksina (1 tai 10 uM) DPI hoito ei vaikuta kaspaasi-1 aktivointi, kun taas 100 uM DPI esti kaspaasin 1 aktivaation (kuvio 5E). Tämä osoitti, että ihmisen soluissa DPI häirinnyt NLRP3 inflammasome aktivointi estämällä NLRP3 transkription sekä kaspaasi-1 aktiivisuutta, kun suuri annos sovellettiin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että katepsiini B toimintaa, K ^{+ efflux, Ca 2+ virtaa ja ROS kaikki osaltaan NLRP3 inflammasome aktivoinnin vastauksena M.hy
haaste.}

M.hy
Aktivoi NLRP3 Inflammasome in vivo

Kun hiiren luuytimen dendriittisolut (BMDCs) infektoitiin M.hy
, jatkuva IL-1β induktio havaittiin (kuvio 6A). Lisäksi kokeet BMDCs eristetty villityypin (WT) hiirillä tai hiirillä puutteellinen kaspaasi-1, ASC tai NLRP3 kanssa M.hy
haaste vahvistettiin, että M.hy
induktio IL- 1β oli NLRP3 inflammasome riippuvainen (kuvio 6B). Lisäksi systeeminen inokulointi M.hy
WT-hiirissä indusoi IL-1β tuotantoa seerumissa ja vatsakalvon huuhtelu nestettä (PLF), mutta ei hiirillä puuttuu ASC tai NLRP3 (kuvio 6C-D). Mielenkiintoista, pohjapinta taso IL-1β ASC hiirissä oli selvästi korkeampi kuin WT tai NLRP3 hiirillä, mutta haasteena M.hy
ei lisätä eritystä IL-1β tällaisissa hiirissä (kuvio 6C-D). Yhdessä nämä havainnot vahvistivat, että M.hy
aktivoidaan myös NLRP3 inflammasome hiirillä in vitro
ja in vivo
.

M. hy
aiheuttama IL-1β Edistää mahakasvaimen Cell Migration and Invasion

edellä olevat tiedot osoittivat selvästi, että M.hy
kykeni indusoimaan IL-1β tuotannon synnynnäisen immuunisolujen kautta NLRP3 inflammasome aktivointi. Varhainen epidemian tutkimukset paljastivat mahdollista roolia mykoplasman kehittämisessä mahasyövän [5]. Ja Mycoplasma hyorhinis
osoitettiin edistää kasvainten solujen vaeltamiseen, invaasiota ja etäpesäkkeiden in vitro
ja in vivo
[41]. Oletimme, että saattaa olla olemassa toinen mekanismi tähän tarjoukseen, jonka mukaan M.hy
voi edistää mahasyövän ja /tai etäpesäkkeiden edistämällä IL-1β tuotantoa. Ja me vahvisti, että M.hy
edistänyt mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota (kuva S5). Koska M.hy
osoitettiin infektoimaan mahalaukun syövän soluja ([41], kuvio S4), on näin ollen mahdollista, että M.hy
voi aiheuttaa inflammasome aktivaatio syöpäsoluja suoraan. Ei kuitenkaan inflammasome aktivaatio havaittiin mahalaukun syövän soluissa (kuvio S6).

vieressä määritti ihmisen rekombinantti-IL-1β (rIL-1β) on mahasyövän karsinogeneesin on pesäkemuodostusta, joka paljasti, että rIL-1β ei vaikuttanut leviämisen mahasyövän solulinjan MGC-803 (Kuva S7). Koska IL-1β ilmoitettiin edistää etäpesäkkeiden muiden kasvainten [18], tarkistimme vaikutuksia rIL-1β maahanmuutto- ja hyökkäys MGC-803 soluja. Tuloksemme osoittivat, että MGC-803 muuttoliikettä ja invaasio parannettiin rIL-1β hoitoa (kuvio 7A ja 7C), kun taas käsittely rIL-18 eivät osoittaneet mitään vaikutusta (kuvio 7B ja 7D). Seuraavaksi käsitellään näitä mahasyövän solujen viljelmäsupematanteista M.hy
haastoi THP-1 peräisin makrofagien tai makrofaagien vaiennettu NLRP3, ASC ja kaspaasi-1 Muuttoliikettä ja invaasiomääritys. Tuloksemme osoittivat, että viljelmäsupematanteista M.hy
haastoi scramble makrofaagisoluissa voimakkaasti lisätä maastamuuttoa ja invaasion mahasyövän solujen viljely taas supernatantit NLRP3, ASC tai kaspaasi-1 Knockdown makrofagien ei, todennäköisesti johtuen vähentynyt IL-1β erittymistä (kuvio 8A ja 8C). Tämä lisätä maastamuuttoa ja hyökkäys MGC-803 solut poistettiin käsittelemällä solut anti-IL-1β mAb (kuvio 8B ja 8D). Yhdessä tuloksemme osoittivat, että M.hy
johtuvaan muuttoliikkeeseen ja hyökkäys mahasyövän solulinjan MGC-803 edistämällä IL-1β eritystä monosyyttisoluilla. Lisäksi meidän tulokset osoittivat, että M.hy
aiheuttama inflammasome aktivointi voi edistää M.hy
replikointi (kuvio S8), jotka saattavat aiheuttaa positiivista palautetta ja lopulta johtaa kroonisuusaste tauti.

keskustelu

Mykoplasmat erottuvat muista bakteereista pieni koko, minuutti genomin ja puute soluseinän. Monet mykoplasmojen perustaa kolonisaation ja infektion kautta noudattaminen isäntä kudoksiin. Koska niiden dynaaminen pinta arkkitehtuuri on antigeenisesti ja toiminnallisesti monipuolinen, mykoplasmoja pystyvät kiertämään isännän immuunijärjestelmän hyökkäys ja sopeutua monia elinympäristöjä ja aiheuttaa kroonisia sairauksia [32]. Koska tunnistaminen M.hy
sian vuonna 1962, vähän tutkimusta suoritettiin tämän taudinaiheuttajan kunnes todettiin liittyvän useisiin ihmisen syöpiin [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. Viime aikoina tutkijat havaitsivat, että M.hy
proteiini p37 oli vastuussa edistää syöpäsolujen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [30], [44]. Tämän lisäksi suora mekanismi, tämä mikrobi voi myös aiheuttaa kasvaimen kehittymisen tai etäpesäkkeiden epäsuorasti paikallisen krooninen tulehduksellinen prosessi. On tunnettua, että IL-1β on tärkeä proinflammatorinen sytokiini, joka edistää kasvua paksusuolen syövän solujen ja parantaa invasiivisuus ja etäpesäkkeiden B16-melanoomasoluja [19], [45]. Yli-ilmentyminen IL-1β havaittiin indusoivan mahalaukun tulehdus ja syöpään hiirissä [19]. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko NLRP3 inflammasome, joka ohjaa IL-1β kypsymisen, aktivoitiin M.hy
, ja onko tämä aktivointi voidaan osaltaan M.hy
liittyvien maha- etäpesäke . Tuloksemme osoittivat, että M.hy
aktivoinut NLRP3 inflammasome in vitro
ja in vivo
, ja edistämällä mahasyövän solumigraation ja hyökkäystä M .hy
oli riippuvainen NLRP3 inflammasome aktivointia. Sitä paitsi NLRP3, huomasimme, että M.hy
DNA myös aktivoinut AIM2 inflammasome, mutta MLAMP aktivointi NLRP3 oli hallitseva osa IL-1β induktio M.hy.

äskettäin on raportoitu, että asyloidun lipopeptidit lämmöllä tapettuja mykoplasman Acholeplasma laidlawii
(HKAL) indusoi IL-1β tuotantoa NLRP7 inflammasome ihmisen soluissa, kun koko HKAL indusoi IL-1β eritys oli osittain NLRP3 riippuvainen [46], mikä osoittaa, että useita inflammasomes voidaan aktivoida tiettyjä mykoplasma. Tuloksemme ei sulkenut pois mahdollista osallistumista NLRP7 in M.hy
indusoi IL-1β tuotantoa, mutta M.hy
pääasiassa aktivoinut NLRP3 inflammasome, koska IL-1β eritys oli lähes kokonaan lakkautettiin NLRP3 vaiennettu soluja (kuvio 3H ja 3I).

Varhaiset tutkimukset ehdotti, että ROS aktivoinut NLRP3 inflammasome aktivoimalla kaspaasi-1 [47]. Kuitenkin tuore tutkimus osoitti, että ROS-inhibiittorit häiritsi transkription IL-1β ja NLRP3, mutta ei vaikuttanut kaspaasi-1 hiiren soluissa [40]. Tutkimuksessamme vaikka ROS esto pieniannoksisen DPI (10 uM) vähensi merkittävästi IL-1β-tuotanto M.hy
haaste, se ei estänyt kaspaasin 1 pilkkominen, markkeri inflammasome aktivointia. Kuitenkin, kun suuria annoksia DPI (100 uM) levitettiin, kaspaasi-1 lohkaisu oli selvästi esti (kuvio 5E), mikä viittaa siihen, että suuri annos DPI voi tukahduttaa kokoonpanoon inflammasome monimutkaisia, vaikka emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että tämä vaikutus saattaa on johtunut NLRP3 mRNA poistamista lähtötasosta (kuvio 5D). On todennäköistä, että ROS estäjä saattaa häiritä sekä pro-IL-1β synteesi ja kaspaasi-1 aktivaatio.

Miten M.hy
edistää ROS tuotannon makrofagien edelleen heikko. Puute solun seinämän M.hy
sallii suora kosketus mykoplasman kalvo ja isäntäsolun kalvoon, ja tämä kosketus voi johtaa fuusio mykoplasman eukaryoottisten isäntäsolun. Tämä fuusio ei välttämättä johda ainoastaan ​​mykoplasman komponenttien tuottaa isäntäsolun, vaan myös insertion mahdollistamiseksi mykoplasman kalvon osat kalvoon eukaryoottisen isäntäsolun. Äskettäin M.hy
kalvot havaittiin olevan fosfolipaasi (PLA), joka voi olla mukana solukalvon häiriöitä prosessissa, joka tapahtuu, kun hyökkäys isäntäsolujen [48], [49]. Tämän prosessin aikana Isäntäsolut voivat tuottaa ROS. Olisi syytä tutkia, onko PLA tarvitaan M.hy
aiheuttamaa ROS tuotanto ja IL-1β eritystä.

Tämä on todistettu tietomme, lysosomaalinen repeämä, K ^{+ ulosvirtaus, Ca 2+ virtaa ja ROS olivat mukana M.hy
aiheuttama NLRP3 aktivointia. Kuten raportoitu aiemmin, K + ulosvirtausta ja fagolysosomaalista repeämä voi aiheuttaa Ca 2+ virtaa, kun taas Ca 2 + tulva voi aiheuttaa toimintahäiriöitä mitokondrioita, mikä johtaa vapauttaa hapettuneen mitokondriaalisen DNA (mtDNA) osaksi sytosoliin, jossa se sitoutuu ja aktivoida NLRP3 inflammasome [9], [12]. Mitokondriot näyttää toimivan keskeisenä solmukohta integrointia erilaisia ​​signaaleja aistitaan NLRP3, mutta suhteellinen osuus ROS ja mtDNA varten NLRP3 inflammasome aktivointia ole vielä selvää tähän mennessä [9].}

Vaikka M .hy
ei virulenttia, se voi perustaa krooninen infektio. By saadaan vähitellen vuorovaikutusta isäntäsolujen, se aiheuttaa kromosomi epävakautta ja pahanlaatuisiksi, mikä puolestaan ​​edistää kasvaimen kasvua, kulkeutumista tai invaasio [50], [51]. M.hy
p37-proteiini edisti mahan syöpäsolun, eturauhasen syöpä ja melanoomasolulinjat invasiivisuus [30], [31]. Lisäksi proinflammatoristen mikro-ympäristössä, kuten IL-1β tuotanto voi myös tukea tätä prosessia [19]. Meidän tutkimuksessa todettiin, että M.hy
indusoi IL-1β edistänyt muuttoliike ja invaasion mahasyövän solut, kun taas M.hy
indusoi IL-18 ei leviämistä edistävät ja hyökkäys mahalaukun syöpäsoluja, joka oli erilainen kuin muut raporteissa [26], [27]. Yksi mahdollinen selitys on, että IL-18 voi edistäneet mahasyövän solujen maahanmuuton ja invaasion kautta sääntelyn CD70, CD44 ja VEGF ilmentymisen immuunisolujen, joka ansaitsee lisätutkimuksia [26]. Toinen selitys voisi olla, että annos rIL-18 ne käytetään (150 ng /ml) on paljon suurempi kuin mitä käytimme [27]. Lisäksi IL-1β edistänyt muuttoliike ja invaasion mahasyövän solut voidaan välittämiä matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9) kuin muita hakuja raportoitu [52]. Kuitenkin saada suoraa ja vakaampi todisteet ja niitä vastaavat mekanismit välisestä yhteydestä NLRP3 inflammasome aktivointi laukaisee M.hy,
ja mahasyövän etäpesäkkeiden sopiva eläinmalleissa, kuten in vivo
kasvain invaasiomääritys [53] ja potilaiden tutkimuksia tarvitaan lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

THP-1-soluissa, PMA aiheuttama makrofagien ja mahasyövän solu MGC-803 pidettiin RPMI 1640-alustassa olennaisten täydentää. Ihmisen monosyyttejä eristettiin Percol TM tiheys-tisentrifugaatiolla (GE Healthcare, Bio-tieteet, Ruotsi) alkaen Ihmisen ääreisveren mononukleaarisia soluja (PBMC) saatu Shanghain veripankki (Shanghai, Kiina).

M.hy
Siivilöi ja PCR Detection

M.hy
käytetty kanta tutkimuksessamme saatiin saastunut soluviljelmästä. Mykoplasma tunnistus toteutettiin kaksi kierrosta PCR-solujen elatusaineeseen [54]: Ensinnäkin, ajaa PCR neljää aluketta 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'solujen elatusaine mallina. Toiseksi otetaan 1 ui edellä kuvattua PCR-tuotetta templaattina ja ajaa PCR kolme alukkeita 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Ensimmäinen ja toinen PCR suoritetaan samassa aikana kunnossa. Sitten sekvensoitiin PCR-tuote ja sai seuraavat sekvenssit: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. BLAST NCBI tietokantaan, saimme tiedon, että mycoplasma on M.hy
. Se voi olla SK76, GDL-1 tai MCLD rasitusta.

M.hy
Culture, DNA Extraction ja MLAMP valmistelu

M.hy
was viljelty modifioitua SP-4 alustassa, joka sisälsi 20% vastasyntyneen naudan seerumia, 10% hiivauutetta, 1% glukoosia, 0,00024% phenolsulfonphthalein, ja 1000 IU /ml penisilliiniä. DNA uutetaan M.hy
suoritettiin ohjeiden kanssa reagenssien tarjoamia Shanghai Lifefeng Biotechnology Ltd M.hy
kvantifioitiin kuten värin muutos yksikköä (CCU) per millilitran kuvatulla [55]. Louhinta MLAMP suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [34].

Reaaliaikainen PCR

NLRP3 ja IL-1β-mRNA: n ilmentyminen määritettiin Quantitative real-time PCR. Suhteellinen kvantitointi geenien normalisoitiin vastaan ​​endogeenista ohjaus β-aktiini kautta kaavan [2 ^{-ΔCt (kohdegeenin-β-aktiini)]. Käytetyt alukkeet olivat: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (eteenpäin) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (taaksepäin) 3'; p-aktiini, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (eteenpäin) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (taaksepäin) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (eteenpäin) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (käänteinen) 3'. M.hy
DNA kopioita dertermined by Quantitative real-time PCR standardin-käyrä menetelmää ehdoton kopio numeroita. Erityinen alukkeet M.hy
olivat: 5'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (eteenpäin) 3 ', 5'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (taaksepäin) 3'.}

ELISA

supernatantit viljellyistä soluista, hiiren seerumia ja hiiren vatsakalvon huuhtelu neste analysoitiin sytokiinien IL-1β, IL-18, IL-6: n tai IL-8 eritystä ELISA (BD Biosciences) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

sukupolven THP-1 solut, jotka ilmentävät shRNAs kohdistaminen Geenit kiinnostavat

shRNA vektoreita ihmisen NLRP3, kaspaasi-1 ja ASC, ja niiden scramble vektorit ovat lahjoja Dr. Jurg Tschopp [56]. Noin sukupolven THP-1 soluja, jotka ilmentävät shRNAs, lyhyesti, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA ihmisen ASC koodaavan sekvenssin, nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT ihmisen NLRP3 koodaavan sekvenssin, nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA on 3 'UTR ihmisen kaspaasi-1 insertoitiin pSUPER. Pol III promoottori shRNA kasetit nämä vektorit ja siitä lamiini A /C-spesifinen pSUPER ohjaus-konstrukti insertoitiin lentivirusvektori pAB286.1, johdannainen pHR, joka sisältää SV40-puromysiiniä asetyyli transferaasi kasetti antibioottiselektiota.

• PLoS ONE: Negatiivinen Node Count parantaminen Prognostic Prediction seitsemännen Edition TNM luokituksessa Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Natural History of pahanlaatuiset luustometastasointia mahasyövän: lopputulokset monikeskustutkimus luumetastaasin Survey